Provas bioquímicas para identificação de enterobactérias

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Provas bioquímicas para identificação de enterobactérias
1- CITRATO DE SIMMONS:
Determinar se o microrganismo é capaz de utilizar o citrato como única fonte de carbono em seu metabolismo com resultante alcalinidade do meio de cultura.
Deve ser o primeiro dos tubos a ser inoculado (para evitar contaminação de substâncias de outros meios de cultura).
· Incubar 24 horas/ 35°C.
Interpretação: Citrato positivo = azul e/ou crescimento no meio
Citrato negativo = cor verde (inalterado)
2- TRíPLICE SUGAR IRON (TSI):
Determinar se o micro-organismo é capaz de fermentar os açucares glicose, lactose e sacarose, se forma gás carbônico a partir de glicose e se produz sulfeto de hidrogênio (H2S).
O meio TSI é inclinado em bico de flauta, de cor vermelho-cereja e deve ser inoculado por picada central até o fundo, seguido de espalhamento na superfície.
· Incubar 18 - 24 horas/ 35oC.
Interpretação:
a- Púrpura/amarelo (inclinação púrpura e fundo amarelo) =fermentação apenas da glicose (lactose e sacarose negativos). Caracteriza bactérias não fermentadoras de lactose, como espécies de Shigella. 
b- Púrpura/amarelo-preto (inclinação púrpura e fundo amarelo/preto) =fermentação da glicose, ausência de fermentação de lactose, produção de sulfeto de hidrogênio. Caracteriza bactérias não fermentadoras de lactose e produtoras de sulfeto de hidrogênio, como espécies de Salmonella, Citrobacter e Proteus. 
c- Amarelo/amarelo (inclinação e fundo amarelos) = fermentação da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 açúcares). Caracteriza os fermentadores de lactose, como a Escherichia coli, espécies de Klebsiella-Enterobacter
d- Púrpura/púrpura (inclinação púrpura e fundo púrpura) =ausência de fermentação de carboidratos. Caracteriza bactérias não fermentadoras, como Pseudomonas aeruginosa. 
e- Presença de gás (CO2 ) = bolhas ou meio fragmentado 
f- H2 S positivo= presença de precipitado negro (Algumas bactérias têm a capacidade de liberar enxofre a partir dos aminoácidos com esse elemento ou de outros compostos na forma de H2S).
3- MIO (Motilidade, Indol, Orinitina)
Informa sobre motilidade, indol e a descaborxilação da ornitina.
Introduzir o estilete-agulha até 2/3 do meio (este meio deve preencher 1/3 da capacidade do tubo)
· Incubar por 24 horas à 36oC
Motilidade - Este teste é interpretado por exame macroscópico do meio à procura de uma zona difusa de crescimento projetada a partir da linha de inoculação.
Interpretação:
_ Motilidade (+) Crescimento além do local da inoculação (meio turva)
_ Motilidade (-) Crescimento apenas no local da inoculação
Produção de indol – O Indol é um dos produtos da decomposição metabólica do aminoácido triptofano. Bactérias com a enzima triptofanase conseguem clivar o triptofano e, desse modo, formam indol, ácido pirúvico e amônia. O indol pode ser detectado no meio de teste com triptofano por observação do aparecimento de cor vermelha (anel) depois do acréscimo de uma solução contendo p-dimetilaminobenzaldeído(reagente de Kovac).
Para a leitura do Indol, adicionar 2 gotas de Reativo de Kovacs
Interpretação:
_ Indol (+) reativo muda para a cor rosa no primeiro minuto
- Indol (-) reativo não muda de cor
Ornitina - Algumas espécies de bactérias têm enzimas capazes de descarboxilar aminoácidos específicos no meio em teste. As enzimas descarboxilases removem uma molécula de CO2 de um aminoácido formando aminas alcalinas que alteram o pH do meio.
Interpretação:
_ Ornitina descarboxilase (+) meio permanece roxo (ou roxo acizentado ou mais escuro)
_ Ornitina descarboxilase (-) 2/3 inferiores mudam para o amarelo
4- Agar Fenilalanina
Testa a habilidade da FAD (fenilalanina desaminase) em desaminar oxidativamente a fenilalanina presente no meio de cultura formando ácido fenilpirúvico que em presença de cloreto férrico produz uma cor verde garrafa no reagente.
Estria por cima da superfície inclinada do meio
· Incubar por 24 horas à 35oC
Interpretação:
Após crescimento pingar 3 gotas do reagente cloreto férrico a 10%
_ Fenilalanina (+) cor verde escuro na superfície
_ Fenilalanina (-) mantém a cor inalterada
5- Ágar Uréia de Christensen ou caldo uréia:
A presença da enzima urease detecta-se quando o microrganismo cresce num meio com ureia que contém também o indicador de pH, vermelho de fenol. Quando a ureia é desdobrada pela urease, a amônia acumula-se no meio tornando-o alcalino. Este aumento de pH faz com que o indicador de pH passe de amarelo a rosa, sendo uma reação positiva para a presença de urease. A ausência da coloração rosa indica uma reação negativa. No entanto, basta que ocorra o aparecimento de uma zona do meio rosa para se considerar a reação positiva;
Estria por cima com inóculo pesado na superfície inclinada do meio, ou inóculo pesado no caldo.
· Incubar por 24 horas à 35oC
Interpretação:
_ Urease (+) desenvolvimento de cor rósea-púrpura de qualquer intensidade
_ Urease (-) mantém a cor inalterada do meio
6- Prova da descarboxilação da lisina
A descarboxilação da lisina pode ser detectada semeando a bactéria num meio de cultura contendo esse aminoácido, glicose e um indicador de pH (púrpura de bromocresol). Antes da incubação deve ser colocado óleo mineral no caldo para impedir o oxigênio de atingir as bactérias e inibir a reação. 
Os ácidos produzidos pelas bactérias a partir da fermentação da glicose vão inicialmente baixar o pH do meio e causar a mudança de cor do indicador de pH de púrpura para amarelo. O pH ácido ativa então a enzima que causa descarboxilação da lisina a aminas e a subsequente neutralização do meio que muda de amarelo para púrpura outra vez.
Interpretação:
Positivo: púrpura-lavanda ou azul púrpura
Negativo: amarelo
Análise do crescimento nos meios ricos e seletivos
A identificação de uma enterobactéria começa com a análise da morfologia da colônia obtida a partir do material semeado. Em geral temos os seguintes meios para interpretar:
Secreções: Ágar sangue e Mac Conkey
Líquidos nobres e biopsias: Ágar chocolate e Mac Conkey
Fezes: Mac Conkey e SS.
Urina: CLED ou Ágar sangue e Mac Conkey.