Série bioquímica para identificação de Enterobacteriaceae

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1 Agravos e Imunidade em Saúde Animal – Prof. Valéria | Medicina Veterinária 2020 | Natália Ramos Bueno 
6 de novembro de 2020 
Série bioquímica para identificação de Enterobacteriaceae 
Principais gêneros da família Enterobacteriaceas: 
 
Série Bioquímica 
Os tubos usados estão com meios de cultura 
específicos para a identificação da bactéria 
analisada. 
Indicador de pH → presente para identificar reações 
químicas. 
pH (Potencial Hidrogeniônico) 
Água � poder de dissociação 
H20 � H+ + OH- 
Se uma solução apresentar uma variação de H+ ou 
OH-, um em relação ao outro dizemos que a solução 
está: 
Ácida: H+ > OH- 
Básica ou Alcalina H+ < OH- 
Autodissociação da água 
H2O H+ + OH- 
Kw = constante do produto iônico que traz embutida 
em si o valor da concentração molar da água. A 25° C 
= [H+] = 10-⁷ M 
 [OH-] = 10-⁷ M 
Assim: Kw= [H+] [OH-] 
 Kw= (10-⁷M) x (10-⁷M) 
 Kw= 10-ⁱ⁴M 
Para evitar o uso de expoentes negativos usamos os 
valores de pH (escala de 0 – 14), sendo: 
pH = 7 (solução neutra) 
pH < 7 (solução ácida) 
pH > 7 (solução básica) 
O pH ou potencial hidrogeniônico é o resultado de 
uma expressão logarítmica que indica o pH sem fator 
exponencial. Por exemplo, numa solução neutra: 
 pH = -log10 [H+] 
-pH = log10 [10-7] 
logba = c e bc = a, temos que: 
log10[10-7] = -pH 
10-pH = 10-7 
pH = 7 
Podemos então entender que: 
Solução ácida � [H+] > [OH-] , ou seja, pH < 7 
Solução neutra � [H+] = [OH-] , ou seja, pH = 7 
Solução alcalina ou básica � [H+] < [OH-] , ou 
seja, pH > 7 
Solução tampão 
 
Indicador de pH 
 
1º tubo 
Teste de fermentação de carboidratos e produção 
de H₂S (ácido sulfídrico) – meio três açucares e Ferro 
(TSI) (tubo 4) 
Meio de cultura 
Açucares → glicose, lactose ou sacarose 
H₂S → aminoácidos que contêm enxofre (enzima 
dessulfurase – presente em bactérias negativas) 
Diferencia membros positivos de negativos da 
família enterobacteriaceae 
 
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Técnica 
Inocular o material a ser analisado com auxílio de 
uma agulha estéril de maneira perpendicular, da 
superfície até o fundo do tubo contendo o meio de 
cultura. 
Após inoculação, incubar o material a 35ºC por 14-
48h 
 
 
 
Interpretação: 
Presença de cor negra: hidrólise da cisteína pela 
dessulfurase (bactérias negativas) 
Base do tubo amarela e o ápice vermelho: bactéria 
capaz de fermentar apenas a glicose, com produção 
de CO₂ 
Resultado: Salmonella 
Base e ápice do tubo amarelos: bactéria capaz de 
fermentar dois ou mais açucares. Produção de CO₂. 
Resultado: E. coli 
Reações ápice/base 
Vermelho/amarelo = fermentação da glicose (lactose 
e sacarose negativos) 
Amarelo/amarelo = fermentação da glicose + lactose 
e/ou sacarose (2 ou 3 açucares) 
Presença da gás (CO₂) = bolhas ou meio fragmentado 
H₂S positivo = cor negra na base 
 
Série bioquímica: TSI 
 
2º Tubo 
Teste do citrato: (tubo 1) 
Princípio: determinar se um microrganismo é capaz 
de utilizar o citrato como única fonte de carbono 
para seu crescimento com consequente alcalinização 
do meio de cultura 
Um micro-organismo que é capaz de utilizar o citrato 
como uma única fonte de carbono utiliza também 
sais de amônia como sua única fonte de nitrogênio. 
Os sais de amônia são desdobrados em amoníaco 
com consequente alcalinização do meio reacional. 
Técnica 
Inocular uma alçada de cultura de bactéria-teste 
contida em caldo triptona soja ou caldo nutriente 
em superfície de ágar inclinado de citrato Simmons. 
Incubar a 35-37ºC por 24 horas ou mais tempo, se 
necessário. 
Interpretação 
Indicador de pH azul de bromotimol presente no 
meio de cultura 
Resultados 
Positivo → azul → meio alcalino (Salmonella) 
Negativo → verde → meio neutro sem crescimento 
(E. coli) 
Série bioquímica: Citrato Simmons 
Verifica a capacidade da bactéria de utilizar o citrato 
de sódio como única fonte de carbono, juntamente 
com sais de amônia como fonte de nitrogênio 
No caso de reação positiva, haverá alteração do pH, 
que se torna alcalino e provoca a viragem do 
indicador de pH (azul de bromotimol) para azul 
 
 
 
 
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3º Tubo 
Teste de uréase: (tubo 3) 
Determinar se um microrganismo é capaz de 
hidrolisar ureia e duas moléculas de amônia (NH₃) 
por ação da enzima uréase 
Este teste é útil na distinção entre patógenos do 
gênero Proteus e outras bactérias entéricas 
Utilizam-se meio ou caldo de ureia contendo extrato 
de levedura, ureia e o indicador de pH vermelho de 
fenol, alça ou agulha de platina 
Técnica 
Inocular o material a ser testado no meio teste com 
auxílio de uma agulha ou alça estéril. Incuba a 35ºC 
para posterior análise da mudança de cor 
Interpretação 
Positivo → produto alcalino, cor rosa. Proteus 
Negativo → Nenhuma mudança de cor, ou 
levemente alaranjada 
Série bioquímica: ureia 
Determina a habilidade do microrganismo de 
degradar a ureia em duas moléculas de amônia pela 
ação da enzima uréase 
Em caso de reação positiva, irá ocorrer alcalinização 
intensa do meio, tornando-o rosa pink 
 
4º tubo 
Teste da fenilalanina-desaminase (tubo 21) 
Determinar a capacidade de um microrganismo de 
desaminar a fenilalanina em ácido pirúvico, por sua 
atividade enzimática, com consequente acidez. 
Técnica 
A inoculação da bactéria-teste deve seguir as 
normas de semeadura em meio de cultura em ágar 
inclinado. Incubar a 35-37ºC por 18 a 24h 
 
Interpretação 
No momento da leitura, adicionar 5 gotas de cloreto 
férrico a 10%. Rodar suavemente o tubo entre as 
mãos. 
Positivo → Verde → houve desaminação 
Negativo → Amarelo → não houve desaminação 
Série bioquímica: fenilalanina 
Algumas bactérias têm a capacidade de realizarem a 
desaminação oxidativa da fenilalanina desaminase. 
Como produto, formará o ácido fenilpirúvico, que, 
por ser ácido, irá acidificar o meio. 
Para a leitura da prova, é necessário a utilização de 
cloreto férrico a 10%, que irá revelar o resultado do 
teste. 
 
Teste da fenilalanina após a adição do doreto férrico. 
A reação é praticamente imediata e irá apresentar a 
cor ver quando for positiva. 
5º tubo 
Teste de motilidade (tubo 16) 
 
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Determinar se o microrganismo é ou não móvel. A 
bactéria é móvel através dos seus flagelos que 
ocorrem nos bacilos gram-negativos. Sendo que 
poucos cocos são móveis. 
Técnica 
Inocular o material a ser testado no meio teste com 
auxílio de uma agulha estéril. Incubar a 35ºC por 24h 
para posterior análise da mudança de aspecto. 
Interpretação 
A motilidade do organismo é evidente com a 
formação de uma névoa de crescimento que se 
estende sobre o ágar, a partir da linha da picada. 
Positivo → presença de névoa 
Negativo → sem presença de névoa 
6º tubo 
Teste de produção de indol: (tubo 36) 
Determinar a habilidade de um determinado 
microrganismo em produzir o indol a partir da 
molécula de triptofano. Enzimas triptofanases. 
Técnica 
Inocular uma alçada de cultura de bactéria-teste 
contida em caldo triptona soja ou caldo nutriente 
em caldo triptona 1%. Incubar a 35-37ºC por 24h. 
Interpretação 
No momento da leitura, adicionar 5 goras de reativo 
de Kovacs. 
Positivo → formação de composto de coloração 
vermelha, evidenciado pela formação de um anel na 
camada alcoólica superficial do meio 
Negativo → o meio fica amarelo, que é a cor do 
reativo de Kovacs 
Série bioquímica: meio SIM 
Ágar SIM (Sulfato/Indol/Motilidade Agar) 
Determina a habilidade do microrganismo de 
metabolizar o triptofano em indol. Triptofano é um 
aminoácido que pode ser degradado por certasbactérias resultando na produção de indol, que é 
evidenciado após a adição do reagente de Kovacs. 
Com a picada em linha reta, é possível avaliar se a 
bactéria inoculada é imóvel ou não. 
 
Teste do indol após a adiçaõ do reativo de Kovacs 
 
Teste da motilidade. O tubo à esquerda é positivo 
7º Tubo 
Teste de vermelho de metila (VM): (tubo 19) 
Testar a habilidade de um microrganismo em 
produzir ácido orgânicos relativamente estáveis, a 
partir da fermentação da glicose, de modo a 
suplantar a capacidade tampão existente no meio de 
cultura. 
E. coli realiza esta fermentação 
Técnica 
Inocular uma alçada de cultura contida em caldo 
triptona soja ou em caldo nutriente em tubo 
contendo 3,5mL de meio VM-VP e incubar a 35-37ºC 
por 2 a 5 dias. 
Interpretação 
No momento da leitura, retirar 2,5mL do meio e 
acrescentar cinco gotas de uma solução 
hidroalcóolica de vermelho de metila. O vermelho 
de merila é um indicador que já é ácido e indicará os 
graus de acidez por alterações de cor de uma escala 
de pH de 4,4 a 6,0. 
Em pH 4,4 o indicador ficará vermelho 
Com a diminuição da acidez (pH =6,0), o indicador 
passará para a cor amarela 
Resultados 
Positivo → Vermelho → pH 4,5 
Negativo → Amarelo → pH 6,0 
 
 
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Os microrganismos VM (+) fermentam a glicose 
produzindo ácidos e originando um pH final muito 
baixo, vencendo o sistema tampão de fosfato e 
mantendo o ácido (Escherichia coli) 
Os microrganismo VM (-) produzem ácidos, porém o 
pH é mais elevado (pH = 6,0) porque eles continuam 
metabolizando os produtos iniciais da fermentação, 
produzindo acetoína 
 
8º Tubo 
Teste de Voges-Proskauer (VP): (tubo 19) 
Determinar a habilidade de um certo microrganismo 
em produzir um composto neutro, o 
acetilmetilcarbinol (acetoína), a partir da 
fermentação da glicose. 
Os principais gêneros que realizam esta fermentação 
são Enterobacter e Aeromonas 
Técnica 
Inocular uma alçada de cultura contida em caldo 
triptona soja ou em caldo nutriente em tubo 
contendo 3,5mL de meio VM-VP e incubar a 35-37ºC 
por 2 a 5 dias. 
Interpretação 
No momento d aleitura, retirar 1,0 mL do meio VM-
VP e adicionar os seguintes reativos de Barrit, nesta 
ordem: 
1) 0,6 mL de solução de alfa-naftol a 5% 
2) 0,2 mL de solução de KOH a 40% 
3) Agitar o tubo suavemente para oxigenar o 
meio, a fim de oxidar a acetoína e obter uma 
reação de cor 
4) Deixar o tubo em repouso por 
aproximadamente 15 minutos antes de 
iniciar a interpretação 
Resultado 
Positivo → Rosa a vermelho – Enterobacter e 
Aeromonas 
Negativo → Cobre 
9º Tubo 
Teste da lisina-descarboxilase: (tubo 22) 
Determinar a habilidade enzimática de um 
determinado microrganismo em descarboxilar o 
aminoácido lisina, com a consequente alcalinização 
do meio de cultivo, pela formação da enzima 
correspondente. 
Enzima → descarboxilase 
Técnica 
Inocular o material a ser testado no meio teste com 
auxílio de uma agulha estéril. Incubar a 35ºC por 24h 
para posterior análise da mudança de cor. 
Interpretação 
Indicador: púrpura de bromocresol 
Positivo → Meio púrpura e turvo (crescimento 
bacteriano) 
Negativo → Meio torna-se ácido, amarelo e turvo 
Série bioquímica: lisina descarboxilase 
Ágar lisina 
Crescimento bacteriano → há a fermentação de 
glicose com produção de ácido → acidifica o meio → 
o indicador de pH vira, fazendo o meio mudar de 
púrpura para amarelo. 
Se a bactéria possuir a enzima lisina descarboxilase: 
há a liberação de CO₂ e descarboxilação da lisina 
com produção de cadaverina (composto alcalino) → 
neutraliza os ácidos produzidos na fermentação da 
glicose → alcaliniza o meio → viragem do indicador 
de pH novamente: o meio muda de amarelo e volta 
a ser púrpura (reação positiva) 
 
Teste da lisina descarboxilase: o tubo amarelo (à 
direita) apresenta reação negativa 
 
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