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30/10/2017 1 Dra. Nathália Cristina Cirone Silva Família Vibrionaceae • Vibrio cholerae • V. parahaemolyticus • V. vulnificus • V. fluvialis • V. mimicus Vibrio - Clássico: 5ª e 6ª pandemias - El Tor: sétima pandemia • Biotipos do •sorogrupo O1 http://www.microbes-edu.org/glossaire/glossaire.html Cólera Poesia : O Cólera Euclides da Cunha O Cólera O seu olhar cheio de morte e dor ! E passa e passa e passa ...as tumbas pálidas Só têm uma guarida- a Eternidade – E deliram e morrem na ebriedade Da loucura – da febre e do pavor !... Euclides da Cunha CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS • bastonetes Gram negativos curvos • móvel por flagelo polar • sem esporos Vibrio cholerae HABITAT • encontrados, principalmente, em ambientes aquáticos • ingestão de água ou alimentos contaminados crus ou mal cozidos • contato com o ambiente aquático TRANSMISSÃO 30/10/2017 2 CARACTERÍSTICAS ANTIGÊNICAS • Antígeno O - Hikojima (A, B e C) • Sorogrupo O1 - três frações de Ag, que permitem diferenciar 3 sorotipos -sorogrupo O1...............O139 - Inaba (A e C) - Ogawa (A e B) - Clássico - El Tor - Clássico - El Tor - Clássico - El Tor SOROTIPOS BIOTIPOS Características Biotipos Clássico El Tor Sensibilidade à polimixina Sensível Resistente Aglutinação de hemáceas de galinhas - + • Biotipos do •sorogrupo O1 PATOGENICIDADE DO SOROGRUPO O1 - diarréia aquosa profusa - náuseas - vômitos - morte por desidratação grave FATORES DE VIRULÊNCIA • adesinas • protease: degrada vários tipos de proteínas (fibronectina, lactoferrina) • flagelo • Ace: Toxina Colérica Acessória • Toxina colérica • Zot: rompe junção das células epiteliais SOROGRUPO NÃO O1 • otite • gastrenterites • infecções do trato respiratório • infecções do trato urinário 30/10/2017 3 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL Fezes, vômito ou swab retal Enriquecimento em água peptonada 5-8h/35ºC Semeadura direta em TCBS 16-18/35ºC Ágar TCBS 16-18/35ºC Colônias suspeitas (amarelas) - identificação bioquímica - aglutinação com soro anti O1 - Elisa (para toxina) - PCR (para toxina) - sonda genética (para toxina) - hidratação oral ou endovenosa - antibióticoterapia: tetraciclina TRATAMENTO Vibrio parahaemolyticus Gastrentérica: período médio de incubação: 15h (4-96h) Auto-limitada: média de 3 dias em imunocomprometidos Infecções de ferimentos: podendo resultar em fascite necrotizante Septicemia fatal: pacientes imunocomprometidos(rara) Associado à produção de hemolisina tdh resistente ao calor. A hemolisina age no epitélio intestinal formando poros causando diarréia secretória. Os isolados clínicos produzem hemólise em Agar Wagatsuma (Kanagawa) Fatores de virulência - Família: Spirillaceae Características Gerais - 18 espécies - bastonetes Gram negativos curvos - flagelo polar - cápsula - cresce melhor a 42° do que a 35° - microaerofilia - 5 a 7% O2 - 5 a 10% CO2 -infecção pelo consumo de água ou alimentos contaminados. -não persiste no ambiente por muito tempo. -trato intestinal, órgãos reprodutores e cavidade oral de animais de sangue quente. Ecologia 30/10/2017 4 ♦ insuficiência de dados para estimar a real incidência das infecções humanas. ♦ poucos laboratórios clínicos incluem a investigação de Campylobacter nos exames de rotina. Campilobacteriose no Brasil ♦ número pequeno de laboratórios de pesquisa desenvolvendo trabalhos com esta bactéria. ♦ não há notificação compulsória. ♦ não há Programas de Vigilância para campilobacteriose. Fatores de Virulência - CadF (Campylobacter adhesion to fibronectin) • proteína situada na membrana externa da bactéria que media a ligação da bactéria com a célula hospedeira. Fatores de Virulência - CadF (Campylobacter adhesion to fibronectin) - JlpA (jejuni lipoprotein A) • lipoproteina de superficie que também media adesão da bactéria às células epiteliais. - LOS (lipooligossacarídeo) Fatores de Virulência - CadF (Campylobacter adhesion to fibronectin) - JlpA (jejuni lipoprotein A) • A semelhança da estrutura de LOS com os gangliosídeos do hospedeiro, leva a produção de Ac que apresentam reação cruzada com essas estruturas, sendo a base patológica para para a associação da infecção por C. jejuni e a Síndrome de Guillain-Barre. - LOS (lipooligossacarídeo) Fatores de Virulência - CadF (Campylobacter adhesion to fibronectin) - JlpA (jejuni lipoprotein A) - Flagelo • auxilia a penetração da bactéria no muco - LOS (lipooligossacarídeo) Fatores de Virulência - CadF (Campylobacter adhesion to fibronectin) - JlpA (jejuni lipoprotein A) - Flagelo - CiaB (Campylobacter invasion antigen) • auxilia no processo de invasão 30/10/2017 5 - LOS (lipooligossacarídeo) Fatores de Virulência - CadF (Campylobacter adhesion to fibronectin) - JlpA (jejuni lipoprotein A) - Flagelo - CiaB (Campylobacter invasion antigen) - CDT (Cytolethal distending toxin) - parece agir na indução de citocinas inflamatórias - alternativamente, ou em adição, pode ativar resposta imune celular, como linfócitos - LOS (lipooligossacarídeo) Fatores de Virulência - CadF (Campylobacter adhesion to fibronectin) - JlpA (jejuni lipoprotein A) - Flagelo - CiaB (Campylobacter invasion antigen) - CDT (Cytolethal distending toxin) - Enterotoxina (CJT) - letalidade baixa: 0,1% - febre com confusão mental ou delírio - diarréia aguda profusa, que pode evoluir para disenteria sanguinolenta com muco. 1. Enterite aguda Patogenicidade - dores abdominais severas - duração de 2 a 7 dias - raramente evolui para septicemia - dose infectante: 500 células Veículos de transmissão - carne de frango crua ou mal cozida. - leite cru. - água contaminada. - contaminação cruzada de alimentos prontos para o consumo. - animais de estimação Isolamento e Identificação 25g + 225 mL de caldo Bolton ou Preston 42ºC/24 e 48h Abeyta-Hunt-Bark Agar Modified Campylobacter Blood-Free Selective Agar Base Campy Blood Agar Campy Food Plaqueamento em meio seletivo Catalase positiva 30/10/2017 6 Microbiologia da água e planos de amostragem Nathália Cirone Principais contaminantes causadores de doença • Top 10 causadores de surtos pelo sistema público de distribuição de água dos EUA – Giardia – Legionella – Norovírus – Shigella – Campylobacter – Cobre – Salmonella – Hepatite A – Cryptosporidium – E. coli OMS: Problemas com água • Quase 1 bilhão de pessoas não têm acesso a uma água potável • Doenças diarréicas: até 1 milhão de mortes anuais atribuíveis à água insalubre, saneamento e higiene • Cólera: mais de 50 países ainda relatam cólera à OMS • Esquistossomose: cerca de 260 milhões de infectados • Milhões pessoas expostos a níveis inseguros de ocorrência natural de arsênico e fluoreto Quais são as leis? • PORTARIA MS Nº 2.914 - 2011 (Ministério da Saúde) “Dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade.” Quais são as leis? • RDC 275 - Regulamento técnico de características microbiológicas para água mineral natural e água natural. Parâmetros • Escherichia coli/ ou coliformes termotolerantes • Coliformes totais • Enterococos • Pseudomonas aeruginosa • Clostrídios sulfito redutores ou Clostridium Perfringens • Contagem de bactérias heterotróficas 30/10/2017 7 Coleta de amostras • Frascos: – Usar frascos com tampa a prova de vazamento, estéreis, – O frasco de coleta não deve ser totalmente preenchido (máximo ¾ da capacidade) – Para coleta de água clorada, adicionar agentes redutores, como tiossulfato de sódio (S2O3Na2) para neutralizar o cloro residual (0,1 ml de solução de sol. de tiossulfato a 10% por100 ml de água) Técnica da Membrana Filtrante ou Millipore de Filtração por Membrana � método utilizado para água, alimentos líquidos e bebidas � utiliza membranas de diferentes materiais � Millipore fabricada a partir de acetato de celulose com tamnho do poro regular e inferiorao tamanho das bactérias, diâmetro do poro 0,45 ou 0,22µ (mais utilizados) � Procedimento ANÁLISE DE ÁGUA Plano de amostragem • Justificativa da amostragem microbiológica: • Saúde Pública: muitos alimentos são veículos de micro-organismos patogênicos (Salmonella, Shigella, S. aureus, V. cholerae, C. perfringens, B. cereus, C. botulinum, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni). • Econômico: proliferação de micro-organismos deteriorantes (Pseudomonas, Flavobacterium, Clostridium estertheticum, Zygosaccharomyces). Conceitos • m: é o limite inferior (mínimo) aceitável. E o valor que separa qualidade satisfatória de qualidade marginal do produto. Valores abaixo do limite "m" são desejáveis. E o limite que, em um plano de 3 classes, separa o lote aceitável do produto ou lote com qualidade intermediaria aceitável. • M: em um plano de 3 classes, M separa o lote com qualidade intermediaria aceitável do lote inaceitável. Valores acima de M são inaceitáveis. • n: é o numero de unidades a serem colhidas aleatoriamente de um mesmo lote e analisadas individualmente. • c: é o numero máximo aceitável de unidades de amostras com contagens entre os limites de m e M (plano de 3 classes). Nos casos em que o padrão microbiológico seja expresso por "ausência", c e igual a zero, aplica-se o plano de 2 classes. Conceitos • Lote: todas as unidades do produto que tenham sido produzidos, manuseadas e armazenadas em um períodos limitados nas condições uniformes. • Amostra indicativa: é a amostra composta por um número de unidades amostrais inferior ao estabelecido em plano amostral constante na legislação especifica. • Amostra representativa: é a amostra constituída por um determinado numero de unidades amostrais estabelecido de acordo com o plano de amostragem. • Unidade amostral: porção ou embalagem(ns) individual(is) tomadas para ensaio, de forma aleatória de uma partida do produto. ICMSF2001 Condiçãodeuso/consumodoproduto reduz mantém aumenta Úteis,contaminantes em geral,reduzem a vida útil Cont.total,Bolores e leveduras Aumenta a vida útil n=5 c=3 Não altera n=5c=2 Reduz a vida útil n=5c=1 Indicadores:perigo Indireto e baixo Coliformes,Enterobacteriaceae reduzoperigo n=5 c=3 nãoaltera n=5 c=2 Aumenta o perigo n=5 c=1 Perigomoderado:risco direto,distrib.Limitada A.aureus,B.cereus,C.perfringens n=5 c=2 n=5c=1 n=10 c=1 Perigosério:graves/ Risco de vida,dur.moder. Salmonella,Shiguella,Vibrio n=5 c=0 n=10 c=0 n=20 c=0 Perigo severo:risco vida, Seqüela crônica,dur.Longa C.botulinum n=15 c=0 n=30 c=0 n=60 c=0 Planos de amostragem: importância da escolha do plano adequado 30/10/2017 8 � Classes: definem o estado de aceitação do produto. � Produto aceito: é aquele que atende todas as especificações � Produto provisoriamente aceito: é aquele cujas especificações estão em uma posição intermediária entre os limites de aceitação e rejeição � Produto rejeitado: é aquele que não atende as especificações. Recomendações da ICMSF Definições São aqueles cujos processos decisórios estão baseados na verificação se um produto atende ou não atende uma especificação. Aceitável m Inaceitável Programas de controle de duas Classes: Exemplo: �Especificação: ausência de micro-organismos patogênicos(defeito grave); �Amostra positiva: é aquela em que uma unidade apresenta micro- organismo patogênico (amostra defeituosa grave); �Amostra negativa: é aquela em que nenhuma unidade apresenta micro- organismo patogênico; �Processo decisório: •Amostra positiva: não atende => rejeitar •Amostra negativa: atende => aceitar; Programas de controle de duas Classes: DEFINIÇÃO São aqueles cujos processos decisórios estão baseados na verificação se um produto atende ou não atende uma especificação, ou se atende provisoriamente, quando a característica avaliada se encontra entre os limites de aceitação e de rejeição. Programas de controle de três Classes: Aceitável m Marginal M Inaceitável RDC n 12 • RESOLUÇÃO RDC Nº 12, DE 02 DE JANEIRO DE 2001 REGULAMENTO TÉCNICO SOBRE PADRÕES MICROBIOLÓGICOS PARA ALIMENTOS • OBJETIVO: Estabelecer os Padrões Microbiológicos Sanitários para Alimentos especificados no Anexo I e determinar os critérios para a Conclusão e Interpretação dos Resultados das Analises Microbiológicas de Alimentos Destinados ao Consumo Humano especificados no Anexo II. Âmbito de aplicação • Este Regulamento se aplica aos alimentos destinados ao consumo humano. • Excluem-se matérias-primas alimentares e os produtos semielaborados, destinados ao processamento industrial desde que identificados com os seguintes dizeres: "inadequados para o consumo humano na forma como se apresentam" ou "não destinados para o consumo humano na forma como se apresentam“. • Excluem-se deste Regulamento os produtos alimentícios e as toxinas de origem microbiana, como as micotoxinas, para os quais existem padrões definidos em legislação especifica. 30/10/2017 9 RDC 12/2001 • ANEXO I: Padrões Microbiológicos Sanitários para Alimentos: A tolerância é máxima e os padrões são mínimos para os diferentes grupos de produtos alimentícios, constantes no presente anexo, para fins de registro e fiscalização de produtos alimentícios. • ANEXO II: Conclusão e interpretação dos resultados das analises microbiológicas de alimentos destinados ao consumo humano. RDC 12/2001 • Amostragem, coleta, acondicionamento, transporte para análise microbiológica de amostras de produtos alimentícios devem obedecer: – Codex Alimentarius; "International Commission on Microbiological Specifications for Foods" (I.C.M.S.F.); "Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods” – "Standard Methods for the Examination of Dairy Products" da American Public Health Association “(APHA); – "Bacteriological Analytical Manual" da “Food and Drug Administration”, editado pela “Association of Official Analytical Chemists” (FDA/AOAC), – outras metodologiasinternacionalmente reconhecidas. RDC 12/2001 • Coleta das amostras: – embalagens originais não violadas, observando a quantidade minima de 200g ou 200mL por unidade amostral. – Produto a granel ou porções não embaladas na origem: deve-se cumprir as Boas Praticas de Colheita. – Exceções para os casos relacionados a elucidação de DTA, e de rastreamento de micro-organismos patogênicos. No caso de investigação de DTA devem ser colhidas as sobras dos alimentos efetivamente consumidos pelo(s) afetado(s). Alimento Micro-organismos n c m M Referência Frutas branqueadas ou cozidas, inteiras ou picadas, estáveis a Temperatura ambiente, refrigeradas ou congeladas, Consumidas diretamente; passa, com ou sem adição de açúcar ou mel; desidratadas, secas(excluídas as passas), liofilizadas, com ou sem adição de açúcar ou mel, incluindo as cristalizadas ou glaceadas e similares); polpa de frutas Concentradas ou não, com ou sem tratamento térmico, refrigeradas ou Coliformes a 45oC/g 5 2 10 102 RDC 12 Salmonella sp/25g 5 0 Aus - Alimento Micro-organismos n c m M Referência especiarias, condimentos e temperos prensados ou flocados ou em pó com adição de outros ingredientes ou não Coliformes a 45ºC/g 5 2 10 102 RDC 12 Salmonella sp/25g (mL) 5 0 Aus - Alimento Micro-organismos n c m M Referência carnes resfriadas, ou congeladas, "in natura", de bovinos, suínos e outros mamíferos (carcaças inteiras ou fracionadas, quartos ou cortes); carnes moídas; miúdos de bovinos, suínos e outros mamíferos Salmonella sp/25g 5 0 Aus - RDC 12 carnes resfriadas, ou congeladas, "in natura", de aves (carcaças inteiras, fracionadas ou cortes) Coliformes a 45oC/g 5 3 5x103 104 produtos cárneos crus, refrigerados ou congelados (hamburgueres, almôndegas, quibe e similares); produtos a base de sangue e erivados "in natura"; embutidos frescais ( lingüiças cruas e similares) Coliformes a 45oC/g 5 3 5x102 5x103 Estaf.coag.positiva/g5 2 103 5x103 C. sulfito redutor a 460C/g 5 2 5x102 3x103 Salmonella sp/25g 5 0 Aus - 30/10/2017 10 Alimento Micro-organismos n c m M Referência a) produtos prontos ou instantâneos que serão consumidos após adição de líquidos, por crianças acima de 1 ano de idade, incluindo os alimentos de transição e de seguimento, exceção dos produtos comercialmente estéreis Coliformes a 350C/g (mL) 5 2 3 20 RDC 12 Coliformes a 45oC/g (mL) 5 1 - 1 Estaf.coag.positiva/g(mL) 5 2 10 5x10 B.cereus/g (mL) 5 2 102 5x102 Salmonella sp/25g (mL) 10 0 aus - produtos prontos ou instantâneos que serão consumidos com ou sem adição de líquidos, por bebês de até 1 ano de idade, a exceção dos prematuros, incluindo as fórmulas infantis, exceto os que receberam tratamento térmico em embalagens herméticas Coliformes a 350C/g (mL) 5 2 10 Coliformes a 45oC/g (mL) 5 0 Aus - Estaf.coag.positiva/g(mL) 5 0 Aus - B.cereus/g (mL) 5 1 10 102 Salmonella sp/25g (mL) 10 0 Aus - fórmulas infantis para prematuros, exceto os que receberam tratamento térmico em embalagens herméticas Coliformes a 350C/g (mL) 5 1 10 Coliformes a 45oC/g (mL) 5 0 Aus - Estaf.coag.positiva/g(mL) 5 0 Aus - B.cereus/g (mL) 5 1 10 5x10 Salmonella sp/25g (mL) 10 0 Aus - PORTARIA MS Nº 2.914 - 2011 • Art. 2°Esta Portaria se aplica à água destinada ao consumo humano proveniente de sistema e solução alternativa de abastecimento de água. • Não se aplica à água mineral natural, à água natural e às águas adicionadas de sais, destinadas ao consumo humano após o envasamento, e a outras águas utilizadas como matéria-prima para elaboração de produtos PORTARIA MS Nº 2.914 - 2011 • I - água para consumo humano: água potável destinada à ingestão, preparação e produção de alimentos e à higiene pessoal, independentemente da sua origem; • II - água potável: água que atenda ao padrão de potabilidade estabelecido nesta Portaria e que não ofereça riscos à saúde; • III - padrão de potabilidade: conjunto de valores permitidos como parâmetro da qualidade da água para consumo humano, conforme definido nesta Portaria; (1) Valor Máximo Permitido. (2) Indicador de contaminação fecal. (3) Indicador de eficiência de tratamento. (4) Indicador de integridade do sistema de distribuição (reservatório e rede). PORTARIA MS Nº 2.914 - 2011 • Art. 28. A determinação de bactérias heterotróficas deve ser realizada como um dos parâmetros para avaliar a integridade do sistema de distribuição (reservatório e rede). – § 1º A contagem de bactérias heterotróficas deve ser realizada em 20% (vinte por cento) das amostras mensais para análise de coliformes totais nos sistemas de distribuição (reservatório e rede). – § 2º Na seleção dos locais para coleta de amostras devem ser priorizadas pontas de rede e locais que alberguem grupos populacionais de risco à saúde humana. – § 3º Alterações bruscas ou acima do usual na contagem de bactérias heterotróficas devem ser investigadas para identificação de irregularidade e providências devem ser adotadas para o restabelecimento da integridade do sistema de distribuição (reservatório e rede), recomendando-se que não se ultrapasse o limite de 500 UFC/mL. RDC 275 - Regulamento técnico de características microbiológicas para água mineral natural e água natural. 22/09/2005. Anvisa 30/10/2017 11 • Amostra indicativa: é a amostra composta por um número de unidades amostrais inferior ao estabelecido para a amostra representativa. • Amostra representativa: é a amostra constituída por um número de unidades amostrais estabelecido na Tabela 1. • Unidade amostral: porção ou embalagem(ns) individual(is) tomadas para ensaio, de forma aleatória de uma partida do produto. Definições – RDC 275 • n: é o número de unidades da amostra representativa a serem coletadas e analisadas individualmente. • c: é o número aceitável de unidades da amostra representativa que pode apresentar resultado entre os valores "m" e "M". • m: é o limite inferior (mínimo) aceitável. É o valor que separa qualidade satisfatória de qualidade marginal do produto. Valores abaixo do limite "m" são desejáveis. • M: é o limite superior (máximo) aceitável. Valores acima de "M" não são aceitos. Definições RDC 275 Tabela 1 - Características microbiológicas para Água Mineral Natural e Água Natural. Microrganismo (em 100ml) Amostra indicativa limite Amostra representativa n c m M Escherichia coli/ ou coliforme termotolerantes ausência 5 0 --- Ausência Coliformes totais <1,0 UFC; <1,1 NMP ou ausência 5 1 <1,0 UFC; <1,1 NMP ou ausência 2,0 UFC ou 2,2 NMP Enterococos <1,0 UFC; <1,1 NMP ou ausência 5 1 <1,0 UFC; <1,1 NMP ou ausência 2,0 UFC ou 2,2 NMP Pseudomonas aeruginosa <1,0 UFC; <1,1 NMP ou ausência 5 1 <1,0 UFC; <1,1 NMP ou ausência 2,0 UFC ou 2,2 NMP Clostrídios sulfito redutores ou Clostridium perfringens <1,0 UFC; <1,1 NMP ou ausência 5 1 <1,0 UFC; <1,1 NMP ou ausência 2,0 UFC ou 2,2 NMP • Amostra indicativa – A amostra é condenada (rejeitada) quando for constatada a presença de Escherichia coli ou coliformes termotolerantes ou quando a contagem dos demais grupos microbianos for maior que o limite estabelecido para amostra indicativa. – Ações – Efetuada a análise da amostra representativa Interpretação dos resultados • Amostra representativa – Quando realizar? – avaliação de partida – suspeita ou com identificação de problemas – informações sobre as possíveis fontes de problema – planos estatísticos com maior poder de discriminação de falhas Interpretação dos resultados • Aprovação – ausência de Escherichia coli ou coliformes termotolerantes em todas as unidades da amostra representativa; – nenhuma unidade da amostra representativa apresentar contagem dos demais grupos microbianos maior que "M"; – no máximo uma unidade da amostra representativa apresentar contagens entre os valores "m" e "M". Interpretação do resultado 30/10/2017 12