Trabalhando com carboidratos

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Trabalhando com carboidratos 
Hospital Universitário 
Clementino Fraga Filho
HUCFF
Hospital Universitário 
Clementino Fraga Filho
HUCFF
Hospital Universitário 
Clementino Fraga Filho
HUCFF
Hospital Universitário 
Clementino Fraga Filho
HUCFF
Prof.: Felipe Bezerra 
Curso: Farmácia 
Disciplina: Bioquímica FF1 
Técnicas de análise em glicobiologia 
Extração 
Cromatografia 
Eletroforese 
Modificações químicas (metil-derivados, oxidação com 
periodato em degradação de Smith) 
 Espectrometria de massa (electrospray ionization) 
Espectroscopia de ressonância magnética nuclear 
(RMN) 
Cromatografia em papel 
Cromatografia líquida 
Cromatografia de troca-iônica 
Cromatografia de permeação (exclusão) em gel 
Cromatografia de afinidade 
Carboidratos com tamanhos semelhantes e 
diferentes de cargas? 
Como separar 
Mesma carga e tamanhos diferentes? 
Caso eu resolva fazer uma coluna de 
afinidade para a trombina, qual polissacarídeo 
eu deveria usar? 
CH3OH 
CH3O 
OCH3 
O
O 
O 
O 
O 
O 
O 
O-CH2 
O 
OCH3 
OCH3 CH3O 
2,3,6 tri-metil derivado 2,4,6 tri-metil derivado 
2,3,4 tri-metil derivado 3,4,6 tri-metil derivado 
OCH3 
CH2OCH3 
OCH3 OH 
OH 
CH2OH 
HO 
OH 
CH2OH CH2 OCH3 
OCH3 
H3CO 
OH 
CH2OH 
HO 
OH 
OH HO 
OH 
OH 
CH2OH 
HO 
OH 
CH2OH 
OH 
CH2OH 
HO 
OH 
OH HO 
Metilação de açúcares com diferentes posições de 
ligação glicosídica 
Resultado das análises estruturais de um 
polissacarídeo complexo 
 Os seguintes derivados metilados foram obtidos de um 
composto constituído exclusivamente por glicose: 
2,3,4,6 tetrametil glicose (10%) 
2,3,6 trimetil glicose (80%) 
2,3 dimetil glicose (10%) 
1,2,3,6 tetrametil glicose (>1%) 
Qual a estrutura deste polissacarídeo? 
Os resultados advém da análise do glicogênio 
O 
CH2OCH3 
OCH3 
OCH3 
O 
CH2OCH3 
OCH3 
O OCH3 O O 
O 
CH2OCH3 
OCH3 
OCH3 
O 
OCH3 
O OCH3 
O 
CH2OCH3 
OCH3 
OCH3 OCH3 
2,3,4,6 tetrametil glicose (10%) 
2,3,6 trimetil glicose (80%) 
2,3 dimetil glicose (10%) 
1,2,3,6 tetrametil glicose (>1%) 
O tamanho das cadeias de glicosaminoglicanos podem ser 
analisadas por PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) 
Origem 
+ 
- 
- 
- 
- 
- 
> 100 kDa 
60 kDa 
40 kDa 
15 kDa 
8 kDa 
Eletroforese horizontal em gel de agarose 
Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) 
10 min 
Glc 
αH1 
βH1 
HOD 
90% 
10% 
2,5h 53% 
47% 
2 days 
33% 
67% 
Espectrometria de Massa (MS) 
vitor3 #4-106 RT: 0.10-2.92 AV: 103 NL: 2.24E6
T: - p ESI Full ms [ 150.00-2000.00]
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lat
ive
 A
bu
nd
an
ce
379.0
278.9
316.5
252.3
634.1
390.0
458.1
679.1 780.9
476.0
212.0
803.1
554.1 701.1 883.1 1702.51329.9 1586.6 1845.71028.3 1154.4 1425.2 1939.4
z = 1
z = 3
z = 3
z = 2
z = 1
z = 2
A
vitor8 #2-35 RT: 0.04-0.96 AV: 34 NL: 4.38E6
T: - p ESI Full ms [ 150.00-2000.00]
300 350 400 450 500 550 600 650
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lat
ive
 A
bu
nd
an
ce
366.3
370.6
458.0
375.2
463.5
469.0
480.4438.1379.5
350.4
619.1502.1
386.8 647.9515.7 626.1584.5571.1 616.3426.7 531.6489.0405.7304.1 349.2 649.9
z = 5
B Unsaturated unreduced CS octasaccharide
Unsaturated unreduced CS trisaccharide
z = 5
z = 5
z = 5
z = 4
z = 4
z = 4
z = 4
MW= 635 (ΔGlcA-GalNAcS-GlcA)
MW= 760 (GalNAcS-GlcA-GalNAcS)
Exemplos práticos do uso destas metodologias 
 análises de preparações farmacêuticas de CS 
 análise estrutural de amostras de CS comerciais 
Análise de preparações farmacêuticas de CS – 
eletroforese em gel de agarose 
A
?
KS
wcCS-A
scCS-C
USP CS
Chondrof lex
Batch 1
B
KS
CS
Retention time (min)Retention time (min)
A
b
s
 2
1
5
n
m
 x
 1
0
4
A
b
s
 2
1
5
n
m
Batch 1
Batch 2
Batch 3
Batch 4
Batch 5
Batch 6
Batch 7
Batch 8
Batch 9
Batch 10
Batch 11
Batch 12
Batch 13
Batch 14
C
D
E
Análise de preparações farmacêuticas de CS – 
cromatografia em gel-filtração 
10 20 30 40
0,0
0,4
0,8
1,2
Ab
s 2
15
nm
 
187300 + chaseAC
187300
Retention time(min)
KS
CS
Batch 1 + Chase AC
Batch 1
5 10 15 20 25 30
0,00
0,15
0,30
0,45
CS
QS
Á
ci
do
 u
rô
ni
co
 (A
bs
 5
25
nm
)
mg de amostra adicionados
Sample amount (g)
Ab
s
52
5n
m
 
A B
C D
Análise de preparações farmacêuticas de CS –cromatografia em gel-
filtração(A), eletroforese em gel de agarose (B) e poliacrilamida (D), 
dosagem de ácido urônico (C) e susceptibilidade enzimática específica 
GlcUA
GlcNAc
IdoUA
GalNAc
Gal
Hexosamine:
Uronic acid:
Hexose:
+
or
5’ epimer
GlcUA
GlcNAc
IdoUA
GalNAc
Gal
Hexosamine:
Uronic acid:
Hexose:
+
or
5’ epimer
Análise estrutural de CS – gel filtração após 
digestão enzimática limitada 
GlcUA
GlcNAc
IdoUA
GalNAc
Gal
Hexosamine:
Uronic acid:
Hexose:
+
or
5’ epimer
Análise estrutural de CS – cromatografias de gel filtração (A,B) e 
troca-iônica (aniônica) (C, D) após digestão enzimática exaustiva 
btCS-A overdigested with ABC and C lyases
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94 97 100 103 106 109 112 115 118 121 124 127 130 133 136 139 142 145
A
scCS-C overdigested with ABC and C lyases
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94 97 100 103 106 109 112 115 118 121 124 127 130 133 136 139 142
B
UF
2
1
UF
A
bs
 2
32
 n
m
A
bs
 2
32
 n
m
Fractions (mL) Fractions (mL)
2
1
Figure S1. LC analyses of homogeneous dimers from btCS-A (A and C), and from scCS-C (B and D). Bio-Gel P-10 cromatograms (size-fractionation) 
of oligomers from (A) btCS-A and (B) scCS-C, both overdigested with ABC and C lyases (see experimental section). The digits indicate the number of units. 
UF stands for unfractionated oligomers of MW > 20 kDa (V0 of the column). The yields of dimers were ~ 79.0 % (btCS-A, panel A) and ~ 84.0% (scCS-C, 
panel B) of the total digested materials. Monomers were less than 5% for each digestion. (C and D) SAX-HPLC profiles of the dimers (peak 2) of each Bio-
Gel P-10 chromatograms. The percentage of each dimeric type was measured by their respective relative integrals (values between parentheses).
C D
Retention time (min)
10 20 30 40 50 60
10
20
30
40
50
60
Flu
ore
sce
nce
 (A
U)
∆C0S 
(8%)
∆C6S 
(42.4%)
∆C4S 
(49.6%)
Retention time (min)
Flu
ore
sce
nce
 (A
U)
10 20 30 40 50 60
70
20
30
40
50
60
∆C0S 
(3.1%)
∆C6S 
(48.8%)
∆C4S 
(26.3%)
∆C2,6S 
(21.8%)
AU
%
 C
om
po
sit
ion
0 .0 0
0 .5 0
1 .0 0
1 .5 0
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
0 .0 0
1 0 .0 0
2 0 .0 0
3 0 .0 0
4 0 .0 0
5 0 .0 0
6 0 .0 0
7 0 .0 0
8 0 .0 0
9 0 .0 0
1 0 0 .0 0
M in u te s
2 .0 0 4 .0 0 6 .0 0 8 .0 0 1 0 .0 0 1 2.0 0 1 4 .0 0 16 .0 0 1 8 .0 0 2 0 .0 0
A
ΔC0S 
(6.8%)
ΔC6S 
(32.7%) ΔC4S(60.5%)
D
1H6/13C6 of 6S
1H4-13C4 of 4S
ΔC6S ΔC4S 
α β
α β
6.0 5.0 4.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0
40.0
45.0
50.0
55.0
60.0
65.0
70.0
75.0
80.0
85.0
90.0
95.0
100.0
105.0
110.0
115.0
120.0
13C
-chem
ical shift (ppm
)
100.0
90.0
80.0
70.0
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
00.0
(─
) %
 2M
 N
aC
l
Minutes
20.018.016.014.012.010.08.06.04.02.00.0
(─
) A
bs
 2
32
 n
m
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
1H-chemical shift (ppm)1H-chemical shift (ppm)
7.0 6.0 5.0 4.0
1H-chemical shift (ppm)
CΔC0S 
7.0
6S
4S
B
Figure S4A-D. SAX-HPLC (A) and 13C-gHSQC NMR (B-D) analyses of the products from chondroitinase ABC digestion of 
btCS-A. (A) Fractionation of the homogeneous dimers (peak 2 of 2 h and 30 min ABC lyase digestion shown at -Δ- Figure 2 in 
original manuscript) using SAX-HPLC chromatography. The ΔC0S, ΔC6S, and ΔC4S stand for non-, 6- and 4-sulfated unsaturated 
unreduced CS dimers, respectively. The integral of their peaks are displayed between parentheses. The 2M NaCL gradient is shown 
with the continuous light grey line. (B-D) 1H/13C-gHSCQ spectra (expansions from δH 3.0 to 7.0 ppm and δC 40.0 to 120 ppm) of the 
homogeneous dimers: (B) ΔC0S, (C) ΔC6S, and (D) ΔC4S, which were obtained from the SAX-HPLC chromatography (panel A). The 
regions (dashed circles in spectrum B) and cross-peak assignments (C, D) denoting sulfation sites (2S for GlcA2S; 4S and 6S for 
GalNAc4S and GalNAc6S) are indicated respectively in the NMR spectra. 
2S
Análise estrutural de CS – cromatografias de gel troca-iônica 
(aniônica) (A) e RMN (B-D) após digestão enzimática exaustiva 
Análise estrutural de CS – MS do segundo pico da troca-iônica 
Vitor_dimer_0S #224-308 RT: 1.24-2.14 AV: 85 NL: 6.36E6
T: FTMS - p NSI Full ms [ 100.00-700.00]
220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lat
ive
 A
bu
nd
an
ce
378.26
z=1
380.26
z=1
485.48
z=0
290.71
z=0
394.26
z=0
220.76
z=0
446.28
z=0
414.25
z=0
427.27
z=0
376.24
z=0
468.33
z=0
356.81
z=0
275.36
z=0
516.83
z=0
261.32
z=0
242.74
z=0
318.56
z=0
330.29
z=0
204.77
z=0
304.95
z=0
348.51
z=0
505.16
z=0
Vitor_dimer_6S #3-65 RT: 0.03-0.98 AV: 63 NL: 4.71E5
T: FTMS - p NSI Full ms [ 150.00-1000.00]
220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Re
lat
ive
 A
bu
nd
an
ce
480.24
z=1
458.25
z=1
485.49
z=1
228.62
z=2
240.12
z=0 502.24
z=0282.15
z=0
493.94
z=2
242.75
z=0
255.34
z=0
460.25
z=0
300.16
z=0
524.24
z=0
509.24
z=0
220.77
z=0
442.19
z=0
478.53
z=0
413.36
z=0
321.31
z=0
425.55
z=0
456.45
z=0
405.75
z=0
366.34
z=0
376.37
z=0
341.66
z=0
353.96
z=0
ΔC0S 
ΔC6S 
E
F
GlcUA
GlcNAc
IdoUA
GalNAc
Gal
Hexosam
ine:
Uronicacid:
Hexose:
+or
5’epim
er
Essentials of G
lycobiology, Second ed. Pg 232 Fig. 16.3 
G
lycosam
inoglycans
GlcUA
GlcNAc
IdoUA
GalNAc
Gal
Hexosamine:
Uronic acid:
Hexose:
+
or
5’ epimer