09 Producao Enzimas

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Produção de Enzimas e 
outros Metabólitos
TA 610 - Transformações 
Bioquímicas em Alimentos
Fontes de 
Enzimas 
Comerciais 
Vegetais
Animais
Micro-organismos
1) Enzimas Vegetais
Tipo Fonte
Malte de cevada 
(α-amilase, β-
amilase, proteases)
Cevada 
germinada
Papaína Látex do mamão)
Bromelina Caule do abacaxi
Ficina Látex do figo
Peroxidase Raiz forte
2) Enzimas Animais
Tipo Fonte
Enzimas 
pancreáticas 
(α-amilase, proteases, 
lipases)
Pâncreas suíno, 
bovino, etc
pâncreas Abomasso
Fígado
Quimosina ou 
Renina
Estomago de 
bezerro, ovelhas, 
cabra, camelo, etc
Pepsina
Estomago de suínos 
e bovinos
Catalase Fígado bovino
3) Enzimas Microbianas
Enzimas
Extracelulares
α - amilases
Bacillus subtilis,
Bacillus
licheniformis, 
Aspergillus
oryzae, etc
Glicoamilases Aspergillus niger,
Rhizopus sp, etc
Pectinases Aspergillus niger
Invertases Saccharomyces
cerevisiae, 
Aspergillus niger, 
etc
Proteases Bacillus subtilis,
Bacillus
licheniformis, etc
Lipases Rhizomucor
miehei; 
Geotrichum
candidum, 
Penicillium
roquefort ,etc
Nucleases Penicillium
citrinum
Ligada à 
célula e 
extracelular
Pululanase Klebsiella sp
Enzima
Intracelular
Glicose 
isomerase
Streptomyces
sp
β-galactosidase
Kluyveromyces
lactis,
Kluyveromyces
marxianus
3) Enzimas Microbianas
Frutas, raízes, 
fígado, pâncreas, etc
As amostras podem ser suspensas em 
tampão ou congeladas em nitrogênio 
líquido.
Waring Blender
Extração de Proteínas e Enzimas 
de Vegetais e Animais
Enzimas Vegetais Livres e Ligadas
Fruta ou Vegetal + Água ou Tampão 
Homogeneização em liquidificador ou 
Waring blender
Suco ou 
sobrenadante
Enzimas livres ou 
solúveis
(polifenoloxidase, 
peroxidase 
solúveis)
Centrifugação 10.000 x g , 5ºC
Resíduo (polpa)
Enzimas ligadas à 
parede celular 
(polifenoloxidase, 
peroxidase ligadas)
Produção Comercial de Papaína
Coleta do látex 
que flui por 1 ou 2 
minutos.
Incisões no mamão 
verde, no período 
da manhã
Purificação
Secagem
Papaína
Papaína bruta
Obtenção de Bromelina
Caule da 
planta
Extrato bruto
Prensagem
2 volumes de Etanol resfriado -5ºC
Bromelina 
bruta
10.000 x g
5ºC
Secagem
Célula vegetal
Protoplastos
Lise Celular
Macerozyme 
(celulases, pectinases, 
hemicelulases, glucanases, etc
Solução hipotônica
Lise enzimática de células vegetais
Obtenção de Quimosina Animal
Abomaso de bezerro
Corte em tiras
Trituração
Extração com NaCl 5-10% 
(Ácido bórico, benzoato e sorbato para
Inibição de micro-organismos)
Concentração através de ultrafiltração 
ou osmose reversa
Quimosina
Fontes de Micro-organismos:
Amostras de solo, resíduos de 
alimentos, caldo de cana, água de rios, 
mares, fontes termais, etc.
Produção de Enzimas Microbianas
Isolamento de Micro-organismos 
Produtores de Enzimas
Água + solo, 
frutas, vegetais, 
caldo de cana-
de-açúcar, etc
30ºC
37ºC
Isolamento de Micro-
organismos Amilolíticos
Halo incolor ao redor 
da bactéria produtora 
de α-amilase
Halo azul ao redor da bactéria produtora de 
enzima amilolítica desramificante 
isoamilase.
Agar Nutriente
+ Amilopectina
Adição de solução 
de iodo-KI
Isolamento de Micro-organismos 
Produtores de Proteases
Halo de hidrólise da caseína ao redor 
das colônias produtoras de proteases
Meio contendo caseína + sais
Meio de cultura 
contendo 
sacarose
Isolamento de Micro-organismos 
Produtores de Gomas 
(polissacarídeos)
Produção de Goma Xanthana 
extracelular por Xanthomonas 
campestris
Xantana polissacarídeo formado de
cadeia principal de glucana (glicoses
unidas por ligações β 1,4) e cadeias
laterais de resíduos de (α- 3→1) manose,
(β- 2→1)-D- ácido glucurônico e (β -4→1)
manose (alternados).
O
O
O
CH OH
CH OH
OH
OH
H C
OH
O
O
O
2
3
2
O
O
COOH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O
O
O
O OH
n
Xanthomonas 
campestris
Usado como espessante, gelificante, 
estabilizante em sucos, molhos para salada, etc
β 1,4
Aplicações da Goma Xantana
Goma xantana como 
estabilizante de suco 
de caju
Suco de caju com 
separação de fases
Estabilizante de 
molhos para 
saladas
Produção do polissacarídeo gelana por 
fermentação da bactéria 
Sphingomonas elodea
O O
O O
O O O
CH2
O C CH 3
O
O
C HHO
CH2OH
C O
C
O
OH
OHOH
OH OH OH OH
CH 3
CH
2
OH
Gelana 
O
ramnoseglicose
glicose
Ác. glucurônico
Usado como espessante, gelificante, 
estabilizante em sucos, molhos para salada, etc
Gelana = Polímero de unidades repetitivas de 
glicose-ácido glucurônico-glicose -ramnose
Suco de 
goiaba
 
 
5 a 10% de inóculo
Produção de Enzimas e Outros 
Metabólitos de Micro-organismos
10 L 20.000 L
Fermentador de Planta Piloto
Fermentador Industrial
Biossíntese de Proteínas ou 
Enzimas 
DNA
Transcrição Tradução
ProteínamRNA
Transcrição
Tradução
Transcrição do DNA em mRNA e 
Biossíntese de Proteínas
Proteína
DNA
mRNA
mRNA
tRNA
codon Ribossomo
Anti 
codon
Amino
ácidos
t RNA
Expressão gênica e fatores que afetam a 
concentração celular de uma proteína ou 
enzima
DNA GENE
1- Iniciação da transcrição
2- Processamento pós-
transcricional do mRNA
Transcrito 
primário 
de RNA
mRNA 3- Estabilidade do RNA
Proteína
4- Regulação da tradução 
ou síntese proteica
5- Modificação da proteína
Aminoácidos
Proteína 
modificada
6- Transporte da proteína
7- Degradação 
da proteína
Genes Constitutivos
Enzimas das Vias Metabólicas
Centrais (Via Embden Meyerhoff, Ciclo
de Krebs, etc), são expressas em teor
mais ou menos constante pelas células
de uma espécie ou organismo.
Regulação da Expressão de Genes
Enzimas constitutivas são 
produzidas o tempo todo.
Glicose
Glicose 6 P
Frutose 6 P
Frutose 1, 6 P
Gliceraldeido - 3 P Dihidroxiacetona - P
 1, 3 - Difosfoglicerato
3 - Fosfoglicerato
2
2
2 - Fosfoglicerato
Fosfoenolpiruvato
Piruvato
2
2
2 Lactato
AT P
ATP
ATP
ATP
ADP
NAD
NADH
NADH NAD
AD P
ADP
ADP
2
- H O
2
Glicogênio
Glicose 1 P
PiHexocinase
Fosfoglicose isomerase
Fosfofrutocinase
Aldolase
Triose fosfato 
isomerase
Gliceraldeido 3 fosfato
desidrogenase
Fosfogliceratocinase
Fosfogliceratomutase
Enolase
Piruvatocinase
Lactato desidrogenase
Sequências Regulatórias 
Genes transcritos
como uma unidade
Promotor Operador B
Sítios de ligação para proteínas que ativam 
ou reprimem a transcrição a partir do 
promotor
DNA A C
Sequências 
regulatórias
Operon de bactérias 
Sítio de 
ligação do 
ativador
Sítio de 
ligação do 
repressor
Regulação da Expressão de Genes
Repressão de Genes:
Produtos gênicos (metabólitos) diminuem
a concentração em resposta a um sinal
molecular.
Excesso de metabólito: Ocorre repressão
dos genes que codificam enzimas que
catalisam a biossíntese de triptofano.
 
Alta 
concentração 
de triptofano.
Bactéria não sintetiza o 
aminoácido triptofano
Regulação da Expressão de Genes
Enzimas induzíveis são aquelas que
aumentam a concentração em resposta a
presença de indutor.
Escherichia coli produz
β - galactosidase
Indução de Genes
 
Meio de cultura 
contendo indutor lactose
 
Meio de cultura 
sem lactose
E. coli não produz
β - galactosidase
gene
Padrões Comuns de Regulação da 
Iniciação da Transcrição do DNA
Repressor
Operador
Desligado
Ligado
Sinal 
Molecular
DNA
gene
Promotor
a) Regulação negativa
Sinal molecular provoca a dissociação do
repressor do DNA, induzindo a
transcrição
mRNA
Dissociação do repressor do DNA
Enzima
gene
Padrões Comuns de Regulação da 
Iniciação da Transcrição 
Operador
Desligado
Ligado
Sinal 
Molecular
DNA
gene
Promotor
a) Regulação negativa
Sinal molecular provoca a ligação do
repressor ao DNA, inibindo a transcrição
mRNA
repressor
Ligação do repressor ao DNA 
Enzima
b) Regulação Positiva
Sinal molecular provoca a dissociação do
ativador do DNA, inibindo a transcrição
mRNA
Ativador
Ligado
Desligado
Sinal 
molecular
Sítio de 
ligação do 
ativador
gene
gene
Dissociação do ativador do DNA
EnzimaDesligado
Ligado
b) Regulação Positiva
Sinal molecular provoca a ligação de
ativador do DNA, induzindo a transcrição
Sinal 
Molecular
Ativador
mRNA
RNA 
polimeraseDNA
gene
gene
Enzima
Composição celular de 
micro-organismos
Célula 
bacteriana
70% = água
30% = massa seca
92% = Consiste de
Food Biotechnology, 1995
Massa seca
Porcentagem Composição
92 % C, O, H , N
7- 8% P, S, K+, Na+, Mg 2+, 
Ca 2+, Cl-, Fe 2+
Elementos 
traços 
Co+, Zn 2+, Mo, Cu2+, 
Mn2+, Ni+ , Se
Requerimento de nutrientes para 
o crescimento celular de micro-
organismos
o Fontes de carbono e energia
o Fontes de nitrogênio
o Íons inorgânicos
o Fatores de crescimento
o Água 
o Agentes Redutores
Fontes de carbono e energia
Organismos Autotróficos: Utilizam CO2
Algas, cianobactérias, 
bactérias anaeróbicas 
fotossintéticas, 
bactéria 
quimolitoautotrófica.
Fixação de Dióxido 
de carbono
Ciclo de Calvin-
Benson
Formação de 2 moléculas de gliceraldeído 
3P , via carboxilação de ribulose 1,5 
difosfato.
3 CO2 + 6 NADPH + 9 ATP D- frutose -6P + 
NADPH + 9 ADP + 
8 Pi
Fontes de carbono e energia utilizadas 
por organismos heterotróficos como 
fungos e bactérias
o Amido 
o Melaço
o Extrato de malte
o Soro de leite, 
o Glicose, maltose, lactose, sacarose, etc
Pequena quantidade de carbono pode 
ser fixada por reações de carboxilação 
envolvendo fosfoenolpiruvato e piruvato.
Fontes de nitrogênio
Fontes de nitrogênio são
requeridas para a síntese de
proteínas e ácidos nucleicos.
Sais de amônio: sulfato de amônio; 
Citrato de amônio; Fosfato de amônio
Nitrato; 
Peptídeos, Aminoácidos; 
Proteína hidrolisada (peptona, triptona );
Ureia;
Água de maceração de milho;
Extrato de levedura; etc
COOH
O
CH 2
C
CH2
COOH COOH
2CH
C
2CH
COOH
HH N
2
Vias de assimilação de amônia
NH3
L- glutamato 
desidrogenase
Ácido L-
glutâmico
Ácido 
α -cetoglutárico
NADPH + H+
NADP+
Concentrações de NH3 > 1mM
Grupo amino do ácido glutâmico
pode ser transferido para outros
ceto-ácidos por transaminação
Ácido 
α -cetoglutárico
+ 
HH N
C 
2
CH
C
2CH
COOH
2
2
NH
O
H NADPH + +
 NADP +
COOH
2CH
C
2CH
COOH
HH N
2
COOH
O
CH 2
C
CH2
COOH
2
Vias de assimilação de amônia
Ácido L-
glutâmicoGlutamina
ATP-
L- glutamato 
sintase
Concentrações de NH3 < 1mM
Transferência do grupo amino para 
outros ceto-ácidos por 
transaminação e formar outros 
aminoácidos
Requerimento de íons inorgânicos
P, S, K+, Na+, Mg 2+, Ca 2+, Cl-, Fe 2+
Co+, Zn 2+, Cu2+, Mn2+, Ni+ , Se, Mo, etc 
Substratos complexos geralmente contem 
íons metálicos para o crescimento 
microbiano.
Em meios de cultura mínimo ou meio 
definido, os íons inorgânicos devem ser 
adicionados. 
Requerimento de fatores de crescimento
Escherichia coli pode sintetizar todos os 
precursores ou constituintes celulares 
requeridos para crescimento se glicose, 
sulfato de amônio e íons inorgânicos são 
supridos.
Para muitas bactérias e fungos um ou 
mais nutrientes específicos podem ser 
requeridos ou estimulam o crescimento.
Fatores de crescimento: aminoácidos, 
ácidos graxos, bases purina, bases 
pirimidinas e vitaminas.
Extrato de levedura ( fonte de vitaminas 
do complexo B);
Extrato de carne;
Extrato de malte;
Infusão de cérebro e coração (BHI)
Componentes de meios de cultura 
ricos em nutrientes
Produção da Enzima em Diferentes 
Fases de Crescimento
Fase Log ou 
Exponencial
Morte celular
Fase Lag
N
ú
m
er
o
 d
e 
cé
lu
la
s 
( 
L
o
g
)
Fase estacionária
Tempo de fermentaçãoEnzima 
produzida 
na fase 
exponencial
Enzima 
produzida na 
fase 
estacionária
Cinética de Crescimento de 
Micro-organismos
Enzima 
produzida na 
fase de morte 
celular 
(autólise)
Produção da Enzima durante 
Crescimento Celular
Fase Log ou 
Exponencial
Morte celular
Fase LagN
ú
m
er
o
 d
e 
cé
lu
la
s 
( 
L
o
g
) Fase estacionária
Tempo de fermentação
Enzima 1 produzida na 
fase exponencial pode 
apresentar um pico de 
atividade.
Enzima 2 produzida na 
fase exponencial pode 
permanecer ativa 
durante a fase 
estacionária (desejável).
Enzima 1
Enzima 2
Dependendo da estratégia de adição 
de substrato a fermentação 
submersa pode ser dividida em:
• Batelada
• Batelada alimentada
• Fermentação contínua
Produção de Enzimas por 
Fermentação Submersa 
 
Injeção de ar Agitação (200 rpm) 
 
Termostato (30ºC) 
Massa 
celular 
Sobrenadante 
24 h a30ºC 
1 vvm 
Todos os componentes do meio são 
adicionados na cuba do fermentador e 
esterilizados.
A fermentação em batelada pode não ser 
ideal para a produção da enzima ou de um 
metabólito quando ocorre a repressão 
catabólica devido a presença de glicose.
1) Fermentação em Batelada
Centrifugação 
a 10.000 x g a 
5ºC
Massa 
Celular
Sobrenadante
Injeção 
de ar 1 
vvm
Agitação 200 rpm
Termostato 
30ºC
2)Batelada Alimentada
Alguns compostos são adicionados 
em pequenas quantidades em 
diferentes intervalos de tempo 
durante a fermentação para atingir as 
necessidades metabólicas do 
crescimento da cultura.
Batelada Alimentada 
O substrato é mantido em concentração
mínima por adição intermitente para evitar
repressão da síntese ou inibição.
Rendimento dos metabólitos (enzima, 
aminoácidos, ácidos orgânicos, 
antibióticos) na fermentação em batelada 
alimentada muitas vezes é superior ao 
método de batelada.
Solução 
de glicose
O meio nutriente líquido esterilizado é 
adicionado continuamente enquanto um 
volume equivalente é retirado.
Fatores que devem ser monitorados :
Agitação, oxigênio dissolvido, pH,
temperatura.
3) Fermentação contínua:
Classificação das Enzimas Microbianas 
quanto a Localização ou Excreção
1)Extracelulares (são sintetizadas e 
excretadas)
2)Intracelulares (citosol)
3)Ligadas à célula (espaço periplásmico)
Enzimas 
ligadas à 
célula
Enzimas
extracelulares
Intracelulares
extracelulares
Obtenção de Enzimas Microbianas
Sobrenadante = 
enzimas 
extracelulares
Massa Celular
Enzimas ligadas à 
células
Enzimas 
intracelulares
Composição do Meio de cultivo
Pectina 15g
Glicose 15 g
NaNO3 2g
KH2PO4 1g
KCl 0,5g
MgSO47H2O 0,5g
FeSO4 7H2O 0,01g
Água destilada 1L
Produção de Enzimas Pectinolíticas 
Extracelulares de Aspergillus oryzae por 
Fermentação submersa 
Produção Máxima de Enzimas a 30ºC
24h 48h 96h
- Poligalacturonase Pectina-liase
- Pectinametilesterase 1 Pectinametilesterase 2
Produção de Enzimas 
Extracelulares por Fermentação de 
Fungos
Substrato Farelo de Trigo
20 g Farelo de trigo: H2O 
[proporção 1:1 (p:v)]
30oC, 72 h
Extração com 100mL 
de água destilada
Filtrado = Extrato enzimático bruto
Produção de Enzimas por Fungos
Aspergillus niger
Aspergillus niger
Invertases, Lipases, 
Pectinases, 
Celulases, 
Glicoamilases, 
Invertases, Tanases, 
Asparaginases, etc
Produção de Enzimas por Fungos
Rhizopus sp Proteases, 
Glicoamilase, etc
Penicillium sp Proteases, Lipases, 
Pectinases, 
Nucleases, etc
Mucor miehei Renina microbiana
Mucor pusillus
Aspergillus
oryzae
Proteases, 
Amilases, 
Asparaginases,etc
Produção de α-amilase de 
Aspergillus oryzae por
diferentes métodos
Unidades 
Atividade
�Vermiculita 
(cultura sólida)
� Farelo de trigo
● Cultura líquida em 
superfície
○- Frascos 
agitados
- Cultura submersa
2 4 6 dias
Maior produção de α - amilase através de 
cultivo em farelo de trigo (meio sólido) do 
que em meio líquido (cultura submersa).
Produção de enzimas em frascos 
Erlenmeyer contendo farelo de trigo 
(meio sólido) 
Fermentação 
em estado 
sólido em 
tambores ou 
cilindros com 
pás rotativas
O aumento da escala na fermentação 
estado sólido é complexo .
O rendimento de enzima é muitas vezes 
maior do que na fermentação submersa. 
Fermentação em bandejas
Extração de Enzimas 
Microbianas Ligadas à Célula 
e Intracelulares
Bactérias, fungos e leveduras 
apresentam paredecelular com 
diferente estrutura e composição
Bacillus sp
Aspergillus niger
Saccharomyces 
cerevisiae
Principais constituintes 
da parede celular de micro-
organismos
Procarióticos
Gram Positivo Peptídeoglucana,
ácido teicóico
Gram Negativo Peptídeoglucana, 
lipopolissacarídeos
Arquea
Pseudo-
peptídeoglucana, 
glicoproteína, 
polissacarídeo, 
proteína
Eucarióticos
Fungos
Quitina e outros 
polissacarídeos. 
(Alguns apresentam 
celulose)
Parede Celular de Bactéria Gram + 
Peptídeo glucano 
Bacillus subtilis 
0,8 µm (diâmetro)
Membrana 
Plasmática
Parede Celular de Bactérias Gram –
Peptídeo-glucano
Escherichia coli
0,5 µm (diâmetro)
Espaço 
periplasmático
Lipo-polissacarídeo
-proteína
Membrana
plasmática
Extração de Pululanase 
Ligada à Célula
Suspensão da Massa Celular em solução 
0,1% de dodecil sulfato de sódio
Centrifugar a amostra a 10.000 x g
durante 10 minutos a 5oC 
Dialisar o sobrenadante em água destilada 
5o C 
Pululanase ligada à célula
5oC - 10 oC 
durante 15 –24 horas.
Produção de Pululanase Extracelular 
e Ligada a célula a 28ºC
Pululanase 
ligada à celula
Pululanase
extracelular
Massa celular
pH
Consumo de amilopectina
Pululanase extracelular = Centrifugar o 
meio após 40- 50h
10 20 30 40 50 60 70 80 horas
Pululanase ligada a célula = Centrifugar 
o meio após 10-15 h
pH
Métodos de Lise Celular 
Lise 
Enzimática
Ultrasonicação
Lise Mecânica 
Alta Pressão-
Atrito
Células ou 
tecidos
Lise Mecânica 
Atrito
Lise Enzimática de Bactérias
• Lisozima (extraída da clara de 
ovo) hidrolisa as ligações β -1,4 
glicosídicas do mucopeptídeo da 
parede celular de bactérias. 
Bactérias Gram+ são mais susceptíveis à
lisozima do que Bactérias Gram - .
Dosagem de Lisozima : 500 U/mL
Peptídeo glucano 
Aplicação de Lisozima em Lacticínios
Clostridium tyrobutyricum é 
formador de esporos e pode não 
ser totalmente eliminado com a 
pasteurização. 
A lisozima destrói as células 
vegetativas e também inibe o 
crescimento de esporos no queijo.
Aplicação de lisozima
Controlar defeitos na textura (formação 
rachaduras e buracos irregulares) em 
queijos, devido a fermentação butírica 
(Clostridium tyrobutyricum).
Enzymes in Food Technology- Robert J. 
Whitehurst, Barry A.Law, 2002
Queijos Gouda, Danbo, Grana Padano, 
Emmental e outras variedades de 
queijos duros e semi-duros.
Unidades de Mananaproteínas
Membrana Celular Unidades de Glucana
Quitina
β-1,6 Glucana
β-1,3 Glucana
Mananaproteínas
Cadeia N-glicosídica
Cadeia O-glicosídica
Enzimas periplásmica
Membrana plasmática
quitina
Parede Celular de Levedura
Leveduras 
Lise Enzimática
Lise Química
Lise Mecânica
Lise Enzimática da Parede Celular de 
Leveduras, Formação de Protoplastos e 
Lise Celular
Protoplastos de células 
de Kluyveromyces 
marxianus var.
bulgaricus.
Tempo 0” - controle
Lise de protoplastos de 
células Kluyveromyces 
marxianus var.
bulgaricus.
Tempo 30” após adição 
de água destilada ao 
meio
Lise de protoplastos de 
células Kluyveromyces 
marxianus var
bulgaricus.
Tempo 40” após adição 
de água destilada ao 
meio 
Aplicações potenciais de enzimas 
líticas de bactérias que lisam
leveduras
Preparação de protoplastos, fusão de 
células e transformação de leveduras
Extração de pigmentos de leveduras
vermelhas .
Pré-tratamento para rompimento
mecânico de leveduras com Dyno Mill.
Produção de extrato de levedura.
Obtenção de enzimas intracelulares,
lipídeos e polissacarídeos.
Lise Celular em Moinho de Bolas - Dyno Mill
• A câmara contém um eixo com discos 
que auxilia a rotação das pérolas de 
vidro.
• As pérolas de vidro rompem as células 
por uma combinação de grande atrito e 
impacto com as células .
Lise Mecânica de Células Microbianas
• Câmara Horizontal preenchida com 80-
85% de pérolas de vidro .
DYNO MILL
Moinho de bolas 
Dyno Mill
• Útil para rompimento de fungos 
e micro-organismos 
filamentosos (menos 
susceptível a entupimento).
É eficiente para rompimento de 
células das bactérias : 
Streptococcus mutans, 
Streptococcus haemolyticus, 
Staphylococcus aureus e 
Micrococcus lysodeikticus.
Lise de Escherichia coli 
em Dyno Mill
Bombear a suspensão de células 30 - 60% 
em tampão, resfriada a 0 - 5o C 
Velocidade de 4 - 6 litros /h 
Tempo de residência de 1 - 2 minutos.
Câmara com 80% do 
volume com pérolas de 
vidro de 0,2 mm de 
diâmetro.
Velocidade de rotação do disco a 10 m/seg.
jaqueta refrigerada a
-20oC.
Obtenção de 65 - 85% de lise celular.
Homogeneizador de Alta Pressão
Homogeneizadores de alta pressão 
lisam a célula pela prensagem da 
suspensão celular e liberação 
repentina da pressão.
Homogeneizador 
Manton Gaulin
Prensa francesa
Homogeneizadores de Alta 
Pressão
Mini DeBee Laboratory
Prensa Francesa
Homogeneizador 
de alta pressão
Pressão
Homogeneizador 
Manton Gaulin
6.000 - 8.000 psi
Prensa Francesa 20.000 - 40.000 psi
Mini DeBee 
Laboratory 
Homogenizer
45.000 psi
Susceptibilidade Relativa das 
Células ao Rompimento
Ultra 
Sonicação
Agitação Prensa Congelamento -
Prensa
Células 
animais
7 7 7 7
Esporos 1 2 1
Micélio 6 1 5
Leveduras 3,5 3 4 2,5
Gram +
cocos
3,5 2 3 2,5
Gram -
Bastonete 
e cocos 6 5 6 6
Gram + 
Bastonete
5 4 5 4
Estimativa do Mercado Global de 
Produtos obtidos por Fermentação 
2008 e 2013
8.000
7.000
6.000
5.000
4.000
3.000
2.000
1.000
0
2008 2013 
1 Aminoácidos
2
3
Enzimas industriais
Ácidos Orgânicos
4
5
Vitaminas 
6
Antibióticos
Polissacarídeos ( Xanthana)
2
2
3
3
4 4
5
5
6 6
U
S
$ 
M
ilh
õe
s
7,9 bilhões5,4 bilhões
4,9 bilhões
~2,5 bilhões ~ 4 bilhões
1
2
3,2 bilhões
2
11
3
3
Estimativa do Mercado Global de 
Produtos obtidos por Fermentação 
2008 a 2013
2008 
US$ 
2013 
US$ 
Aumento 
anual
Mercado 
Global
15,9 
bilhões
22,4 
bilhões
7,0%
Aminoácidos 5,4 
bilhões
7,8 
bilhões
7,6%
http:www.bccresearch.com/report/FOD020.ht
ml
Enzimas 
industriais
3,2 
bilhões
4,9 
bilhões
8,9%
Mercado Global de 
Enzimas Industriais
2014 US$ 4,6 bilhões
2015 US$ 4,9 bilhões
2016 US$ 5,0 bilhões
Previsão de aumento de 4,7 
% de aumento anual (2016 -
2021)
2021 US$ 6,3 bilhões
http:www.bccresearch.com
Mercado de enzimas
Enzimas Aplicação 2016 2021
Enzimas 
para
Alimentos 
(carboidrases
, proteases e 
lipases)
Bebidas, 
alimentos 
processados,
lacticínios, 
panificação e 
confeitaria
US$ 2,94 
bilhões
Enzimas 
para ração 
animal 
(fitases, 
proteases e 
carboidrases)
Ração animal 
(ruminantes, 
suínos, aves e 
animais aquáticos)
US$ 
842,9 
milhões
US$ 
1428,8 
milhões 
(ano 2022)
Enzimas 
técnicas 
(celulases, 
amilases, 
protease, 
lipases)
Bioetanol, papel & 
polpa, têxteis & 
couro, 
processamento de 
amido e outras 
aplicações
US$ 1,27 
bilhões
2015 2020 *
Mercado global de 
ingredientes para 
fermentação 
(alimentos , 
bebidas/ 
ingredientes para 
fermentação)
US$ 24,3 bilhões US$ 35,1 bilhões
Mercado global e 
tecnologias de 
enzimas para 
biocombustíveis 
US$ 652,1 milhão US$ 1 bilhão
* Taxa de crescimento anual de 
7,7%
Mercado Global de Enzimas
Enzimas 
Especiais
Enzimas 
para 
Alimentos 
e Bebidas
Enzimas 
para 
Detergentes 
e Bioetanol
40%
Enzimas 
Industriais
Enzimas para 
indústrias 
farmacêutica, 
diagnóstico 
Fonte: Freedonia 
Group, 2007
57% 43%
60%
Enzimas para 
alimentos, 
bebidas, rações 
animais e outras 
aplicações
45% Novozymes 
30% Danisco
14% DMS 
Fonte= Chemical Week, v.170, nº20. 2008
Outras Empresas 
Produtoras de Enzimas 
para Alimentos
Chr Hansen 
AB Enzymes
Amano Enzymes
Cargill
Mercado de Enzimas para 
Alimentos e Bebidas
US$ 800 milhões 
/ano 2009 
1) Lacticínios
Fontes : Freedonia and Frost & Sullivan
World Enzymes
2) Panificação
3) Outros
alimentos
e Bebidas
US% 1,2 bilhões 
em 2011
Aumento anual 
de 8%
Mercado de Enzimas para 
Lacticínios
Maior mercado de enzimas para 
alimentos.Enzimas para produção de 
queijos e remoção de lactose em 
leite.
Previsão de Crescimento de Mercado 
Moderado
Segundo mercado de 
enzimas: Enzimas 
para Panificação
Segmento que tem crescido cerca 
de 7,2% por ano
2003 € 32,7 milhões
α- amilases
Xilanases
Lipases
Proteases
2010 € 53,3 milhões
Fonte Frost & Sullivan
3º Mercado de Enzimas
Enzimas para Bebidas Fermentadas
Malte de cevada
Enzimas : α- amilases , β-amilases, 
glicoamilases, proteases, 
carboxipeptidases, β- glucanases, etc
Cevada 
germinada
Optimisation of culture conditions and 
development of a novel fed-batch 
strategy for high production of β-
galactosidase by Kluyveromyces lactis
You, S.P.; Wand, X.N.; Qi,W.; Su, R.X.; 
He, Z.M. International Journal of Food 
Science and Technology , v. 52, 1887-
1893, 2017
Estudo sobre a otimização das 
condições para alta produção de 
β-galactosidase por Kluyveromyces 
lactis
 
Produção de of β-galactosidase por 
Kluyveromyces lactis em frascos agitados
 
Meio de cultura inicial ( g/L)
20g lactose
3 g de extrato de levedura
3 g de extrato de malte
3 g peptona
Ajustado para pH 7,0
Kluyveromyces lactis
CICCI 1773
100 mL
500mL
20h a 
30ºC 
200rpm
500mL
5% de inóculo
30ºC 
200rpm
Massa celular
(β-galactosidase)
100 mL
Efeito de diferentes fontes de carbono na 
produção de β-galactosidase (enzima 
constitutiva) por K. lactis CICCI 1773
β
-
ga
la
ct
os
id
as
e 
(U
/m
L)
Controle
Galactose = maior produção de β - galactosidase 
Galactose é muito mais cara que a lactose.
Lactose foi escolhida como fonte de carbono
β - Galactosidase (U/mL)
Biomassa (mg células seca /mL) 
Efeito de sais na produção de 
β-galactosidase por K. lactis CICCI 1773 
β
-
ga
la
ct
os
id
as
e 
(U
/m
L)
Na2HPO4. 12H2O 
FeSO4
MgSO4
Aumentaram a 
atividade de
β-galactosidase.
Na2CO3
2g/L
MgSO4
0,6g/L
FeSO4
0,06g/L
Na2HPO4. 12H2O
4g/L
CaCl2
2g/L
(NH2)2SO4
3g/L
pH 8,49
pH
Extrato de 
levedura (g/L)
Efeito do pH e concentração de extrato de 
levedura na produção de β -galactosidase
β
-
ga
la
ct
os
id
as
e 
(U
/m
L)
Efeito da temperatura e concentração de 
extrato de levedura na produção de 
β -galactosidase
Temperatura 27,68 ºC
Extrato de 
levedura (g/L)
Temperatura ºC
β
-
ga
la
ct
os
id
as
e 
(U
/m
L)
Meio de cultura e condições otimizadas 
para produção de β-galactosidase por
K. lactis CICCI 1773 
Lactose 20g/L
Peptona 5g/L
Extrato de levedura 12 g/L
Extrato de malte 5g/L
Na2HPO4. 12H2O 3,58g/L
MgSO4
0,6g /L
FeSO4 0,06g /L
pH 8,48
Temperatura 27,6ºC
Tempo (h) 
� Lactose
�β-galactosidase
• Produtividade
B
io
m
as
sa
 (
m
g 
m
as
sa
 s
ec
a/
m
L
β
-
ga
la
ct
os
id
as
e 
U
/m
L
P
ro
du
tiv
id
ad
e 
(U
/ m
L/
h)
pH 5,74
pH 6,46
Aumento do pH , associado ao 
consumo de lactose
Tempo (h)
Cinética de produção de 
β –galactosidase em fermentador de 7 L e 
variação de pH 
(Fermentação em Batelada)
�Biomassa
Efeito da adição da lactose durante a 
fermentação de K. lactis CICCI 1773 e 
produção de β-galactosidase
Tempo (h) 
Tempo (h) 
� Lactose
B
io
m
as
sa
 (
m
g 
m
as
sa
 s
ec
a/
m
L
β
-
ga
la
ct
os
id
as
e 
U
/m
L
•
P
ro
du
tiv
id
ad
e 
(U
/ m
L/
h)
� β-galactosidase
Fase 1 Fase 2
Adição de 100 mL de solução 
400g/L de lactose
�Biomassa
• Produtividade 
(Fermentação em Batelada Alimentada)
Produção de β – galactosidase por 
K. lactis CICCI 1773
Tempo
de 
fermentação
Biomassa 
(mg massa 
seca/ mL)
Atividade 
máxima de β -
galactosidase
Frasco
Erlenmeyer
22h 6,85
Batelada
(reator 7L)
22h 5,83 41,37
Batelada
Alimentada
(adição de 
lactose)
(reator 7L)
22h 10,28 111,61
Regulamentação de uso de enzimas em 
alimentos
As cepas de micro-organismos 
utilizadas para obtenção de preparações 
de enzimas alimentares devem ser não 
patogênicas e não tóxicas
Deve ser realizada uma avaliação geral 
de segurança para cada preparação 
enzimática destinada a ser utilizada em 
alimentos ou processamento de 
alimentos. 
1. Concentração de chumbo inferior a 5 
mg/kg. (Determinado por absorção 
atômica); 
2. (ii) Critérios microbiológicos: 
Salmonella spp.: ausente na amostra 
de 25 g, 
3. Coliformes totais: não mais de 30 por g, 
Escherichia coli: ausente na amostra de 
25 g, 
4. Atividade antibiótica: Ausente em 
preparações de fontes microbianas.
Pureza das preparações enzimáticas 
JECFA (Joint FAO/WHO Expert 
Committee on Food Additives)
Enzimas para alimentos
α-amilase, 
Glicoamilase,
Celulase, 
Glicose oxidase, 
Catalase
Pectinase
Lipase
Aspergillus niger
α-amilase,
Protease
Aspergillus oryzae
α-amilase,
Protease
Bacillus subtilis
Invertase Saccharomyces
cerevisiae (panificação 
e cervejaria)
Lactase Kluyveromyces lactis;
Candida
pseudotropicalis
Enzimas para alimentos
• Renina geneticamente 
modificada de abomaso 
de bezerro expressa em 
Escherichia coli K12;
• Kluyveromyces marxianus
var. lactis;
• Aspergillus niger var. 
awamori
• Endothia parasitica, 
• Mucor pusillus Lindt
• Mucor miehei Cooney et 
Emerson 
• Aspergillus oryzae (gene 
da protease aspártica de 
Rhizomucor miehei
Cooney et Emerson )
Proteases 
para 
coagulação do 
leite para 
queijo
Enzimas para alimentos
Bromelina 
(Ananas comosus e 
Ananas bracteatus) Hidrólise de 
proteínas e 
polipeptídeos
Ficina ( Ficus)
Papaína (Carica 
papaya L.)
Lipase animal de 
abomaso de 
bezerro, ovelha
Hidrólise de acilglicerol
Lipase de Rhizopus
niveus
Interesterificação de 
gorduras e óleos
Esterase-lipase de 
Mucor miehei var. 
Cooney et Emerson
Produção de aromas 
em queijos, óleos, 
gorduras e óleos e 
produtos de leite
Asparaginase de 
Aspergillus oryzae
Diminuição da 
formação de 
acrilamida
Transglutaminase
de Streptomyces
mobaraensis
Reestruturação de 
carne, panificação
Enzimas consideradas GRAS para uso 
específicos 
Glicose isomerase
• Streptomyces 
olivaceus,
• Streptomyces 
olivochromogenes
• Streptomyces 
rubiginosus,
• Actinoplane 
missouriensis,
• Bacillus coagulans
Isomerização de 
glicose para frutose
C
C
C
CH OH
C
C
H O
H
H
H
H OH
OH
OH
HO
2 2
HO
OH
OH
H
H
H
O
C
C
CH OH
C
C
CH OH
2
Glicose isomerase
Glicose Frutose
Enzimas consideradas GRAS para 
uso específicos 
Catalase de fígado 
bovino
Decompor peróxido 
de hidrogênio
Protease 
pancreática de 
bovinos e suínos
Hidrólise de proteína 
e polipeptídeos
Pepsina de suínos Hidrólise de proteína
Tripsina de 
pâncreas de bovinos 
e suínos
Hidrólise de proteína
Aminopeptidase de 
Lactococcus lactis
Desenvolvimento de 
flavor em queijo 
cheddar
Referências
FAO - Food and Agriculture Organization of the 
United Nations, Expert Committee on Food Additives. 
Summary and Conclusions, 64th Meeting, 2006. 
Disponível em: 
ttp://www.who.int/ipcs/food/jecfa/summaries/en/summ
ary_report_64_ final.pdf. Acesso em: 25 de setembro 
de 2012. 
FAO/WHO. Biotechnology and Food Safety, Report of 
a Joint FAO/WHO Consultation. FAO Food and 
Nutrition Paper 61. Rome, Italy, 1996
FAO/WHO. Safety aspects of genetically modified 
foods of plant origin, Report of a Joint FAO/WHO 
Expert Consultation on Foods Derived from 
Biotechnology. Geneva, Switzerland, 2000.
JECFA Expert Committee on Food Additive-General 
Specifications and Considerations for Enzyme 
Preparations used in Food Processing. Disponível 
em: http://www.fao.org/ag/agn/jecfa-
additives/docs/enzymes_en.html.