06 Protease

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TP 610-Transformações Bioquímicas 
em Alimentos
Proteases
Profa Hélia 
3/10/2017
o Principais Classes de Proteases
o Modo de ação
o Características 
o Aplicações
Hidrólise enzimática de proteínas
+
Proteases
Proteases e 
peptidases
Peptídeos
Proteína
Aminoácidos 
H2O
H2O
Peptídeo Peptídeo
+
Hidrólise 
extensiva
1) Ácido Aspártico 
protease
Quimosina 
(abomaso de 
bezerro)
Pepsina ( abomaso 
de bovinos, 
estômago de suínos)
Proteases fúngicas
2) Serina protease
Quimotripsina;
Tripsina (pâncreas)
Alcalase (Bacillus
licheniformis)
C
O
O-
Classificação de Proteases
-OH
Classificação de Proteases
3) Cisteína protease Papaína (mamão), 
Bromelina (abacaxi);
Ficina (figo);
Calpaínas (músculo 
bovino)
4) Metaloprotease Carboxipeptidase A 
(enzima digestiva);
Aminopeptidase
(enzima digestiva);
Neutrase ® (Bacillus
amyloliquefaciens); 
Termolisina (B. 
thermoproteolyticus
- Zn2+
Outras Classes de Proteases
5) Treonina protease
Protease de 
Thermoplasma
acidophilum
(Archaea)
6) Ácido glutâmico 
protease
Proteases
microbianas:
Aspergillus niger
var. Macrosporus; 
Scytalidium lignicola,
Alicylobacillus sp.
CH
2
C
O
O-
CH
CH
OH
3
Classe 1
Ácido aspártico proteases
Proteases que contém 2 
resíduos de ácido aspártico 
no sítio ativo.
Endo-enzima ( atuam no meio da cadeia).
Maioria são ativas em pH ácido (1 – 6).
Quimosina de abomaso ( Asp34, 216 )
Pepsina humana ( Asp32, 215 )
Tipo Fonte
Quimosina ou 
renina
abomaso de 
bezerro
Pepsina
abomaso de 
bovinos adultos, 
estômago de 
suínos
Proteases 
fúngicas
Mucor miehei, 
Endothia parasitica, 
Aspergillus oryzae
Quimosina de 
abomasso de 
bezerro 
produzida por 
micro-organismos
Levedura 
geneticamente 
modificada
Ácido aspártico proteases 
para coagulação do leite
Caseínas
80% 
das proteínas 
do leite
αs1 caseína 38%
αs2 caseína 10%
κ caseína 36%
β- caseína 13%
γ caseína 3%
Leite
Composição do leite
Água 86 - 88%
Gordura 3 - 6%
Proteína 3 - 4%
Lactose 5%
Fósforo e 
minerais
0,7%
Proteínas 
do soro
20% 
das proteínas 
do leite
Albumina do soro
imunoglobulinas
Lactoferrina
Peptonas
Ceruloplasmina etc
Bioquímica de Alimentos- Eskin e Shahidi , 2015
Micelas de caseína do leite
Micela de Caseína
Partícula coloidal MM 10.000 e 
∅ 30 nm- 300nm.
Agregados coloidais altamente hidratados 
de moléculas de caseínas organizadas ao 
redor de fosfato de cálcio 
Microscópio 
eletrônico
Frações de Caseína
α- S1- Caseína
α- S2- Caseína
β- Caseína
κ- Caseína Submicelas 
(12 - 15 nm)
Micela de caseína 
∅ médio 200nm
Proteínas 
hidrofóbicas 
estão 
localizadas na 
parte interna.
Solúvel na presença de íons cálcio.
Exerce efeito estabilizante das
frações de caseína pela formação de
micelas coloidais.
K- caseína (169 aa) é uma proteína
hidrofílica encontrada na superfície
do micela e está mais exposta a ação
da protease quimosina.
K- caseína 
Micela de caseína 
K- caseína 
Quimosina de abomaso de bezerro
pH de 
atividade
pH ótimo = 3,8
Ativa em pH 6,3 - 6,6
Especificidade
Rompe ligação peptídica 
entre fenilalanina-
metionina 
(aa 105 - aa 106) da κ-
caseína
Vantagem Proteólise Limitada
pH Estabilidade 4,8 - 6,0
Temperatura 
ótima
40°C
Quimosina hidrolisa a ligação peptídica
entre Phe105-Met106 da κ- caseína.
Quimosina ou 
Renina
Glico-macropeptídeo
A hidrólise da κ-caseína desestabiliza a 
micela de caseína causando a 
modificação da estrutura das proteínas e 
a formação de p-caseinato de cálcio 
(coágulo).
κ- caseína
p - κ- caseína
+
Coagulação do leite
Quimosina
Ca2+
Micelas de caseína
Glicopeptídeos
Agregação 
ρ-caseinato de cálcio 
Micelas
Caseínas do leite
Quimosina
p - κ - caseína
p- caseinato de cálcio
Ca2+ PO4
-
Leite coagulado
40 - 42ºC
+ glicopeptídeos
Coagulação do Leite
Quimosina
•Alta atividade de coagulação do leite.
• Baixa atividade proteolítica 
(adequada para produção de queijo). 
Coagulação do leite
Separação das proteínas do leite coagulado
Soro do leite = rico em proteínas solúveis 
(albuminas, globulinas, etc) e lactose.
p-caseínato 
de Ca2+
Obtenção de quimosina do 4º 
estomago (abomaso) de bezerro
Abomasso Abomaso SecoAbomaso fresco
Obtenção de Quimosina
Abomaso de Bezerro
Corte em tiras
Trituração
Extração com NaCl 5-10% 
Adição de ácido bórico, benzoato, 
sorbato para inibir micro-organismos.
Concentração através de 
ultrafiltração ou osmose reversa
COALHO LÍQUIDO
Produção de quimosina de 
bezerro ou camelo por 
levedura geneticamente 
modificada
Células de 
estomago
Gene da quimosina
DNA
Plasmídeo 
recombinante
Pichia pastoris Quimosina
ou E. coli K12
Características da quimosina de 
camelo expressa em Pichia pastoris
Atividade 
ótima
pH 5,04 
e 45 - 50°C
Especificidade κ-caseína
MM 42 kDa
Vantagem Proteólise Limitada
Altamente ativa 
e estável 
pH 2,5 - 6,5 
a 20ºC por 8h
Wang et al. - Protein Expression and 
Purification v. 111, p. 75-81, 2015
Renina microbiana
Proteases 
Fúngicas
Endothia parasitica
Rhizomucor miehei
Proteases fúngicas para 
coagulação do leite apresentam a 
vantagem de serem obtidas por 
fermentação em meios de cultura, 
evitando abate de bezerros.
Produção de Renina Microbiana
Rhizomucor miehei, Endothia parasitica
4 - 7 dias 
a 30ºC
Meio semi-sólido
50 g farelo de 
trigo:água (1:1)
Filtrado
Extração com 
50 mL de água
Renina Fúngica
purificação
Preparações de coagulante de leite 
Coagulante em póCoagulante líquido
Abomasso seco
CarlinaTM
Danisco , Vinay, França
1700 IMCU/g
Quimosina de abomaso 
de bezerro ou vitelo
Coalho de vitelo
em pó, Bela Vista 
Ltda, Santa Catarina, 
Brasil
97% de quimosina
Coalho Bovino 
BV® , Bela Vista Ltda, 
Santa Catarina, Brasil
(20 - 25g diluído para 
1000 litros de leite)
4º estomago de bovinos 
Contém 80 - 90% de 
pepsina bovina e
10 - 20% de quimosina 
bovina.
Exemplos de Coagulantes Comerciais
ChyMax- M 2500
( Chr Hansen) 
2500 IMCU/g
Quimosina expressa em 
Escherichia coli K-12
Quimosina 
recombinante pura. 
Alta capacidade 
coagulante, 
desenvolvimento 
balanceado de flavor
e textura. 
Marzyme 150 MG ;
Danisco, Vinay, França
2200 IMCU/g
Renina microbiana 
(Rhizomucor miehei)
Exemplo de Coagulantes Comerciais
Pepsina Estômago de suínos e 
bovinos
pH ótimo de 
atividade
pH 1 - 2
pH estabilidade pH 5,0 – 5,5
PepsinaC
O
O H
Aplicações
Coagulação do leite.
Auxiliar de digestão.
Preparação de cereais 
pré-cozidos e alimentos 
infantis.
Obtenção de hidrolisados 
proteicos. 
Produção de peptídeos 
bioativos.
Preparação de peptona 
(meio de cultura).
PepsinaC
O
O H
Especificidade
Hidrolisa 
preferencialmente ligações 
peptídicas envolvendo 
aminoácidos aromáticos
Tyr
Try
Asp
Phe Glu
Gosto amargo = Peptídeos 
hidrofóbicos, com grupos 
aromáticos volumosos.
Peptídeos Amargos
•Fenilalanina -Prolina - outros aminoácidos 
alifáticos
•Ala-Leu-Fenil-Glu-Glic-Tir-Prol (encontrado em 
hidrolisado de caseína).
•Gli-Fenil
•Leuc-Leuc
•Ala-Leuc 
•Leuc- Ala
•Ala-Val 
•Val- Ala
•Fenil -Glic
•Glic-Fenil
•Fenil -Glic- Fenil- Glic
•Fenil - Glic-Glic- Fenil
2 OHC
H
C
O
N
C
C
O CH
H N
2
CH
H C CH
33
Fenilalanina
Valina
H
VALINA
Fenilalanina
Peptídeos Amargos
2 OHC
H
C
O
N
C
C
O CH
H N
2
CH
H C CH 33
Leucina
CH 2
CH
CHH C
33
Leucina
H
2 OHC
H
C
O
N
C
C
O CH
H N
2
CH
H C CH
33
Fenilalanina
Leucina
CH 2
H
2 OH
C
H
C
O
N
C
C
O CH
H N
2
CH
H C CH
33
Fenilalanina
Leucina
CH 2
H
N
C
C
H
O
C
C
N
CH
Fenilalanina
O
H
CH
CHH C
33
Valina
Leucina Leucina
Leucina
LeucinaFenilalanina
Fenilalanina
Fenilalanina
Valina
Gosto amargo em queijos
Problema comum em queijos gouda,
cheddar e outros queijos maturados
utilizando-se bactérias.
Peptídeos hidrofóbicos de massa
molecular 6 kDa, derivados de caseínas,
especialmente da região C- terminal de
β-caseínas (β- CN f 193 – 209) são muitoamargos.
Proteases do envelope celular de
bactérias lácticas do gênero
Lactococcus sp estão envolvidas na
formação de peptídeos amargos.
Bioquímica de Alimentos , Eskin e Shahidi, 2015
Proteases de Aspergillus oryzae
Aplicações:
Hidrólise de proteínas;
Obtenção de hidrolisados proteicos;
Diminuição da alerginicidade de proteínas;
Obtenção de peptídeo bioativos; 
Produção de alimentos fermentados;
Panificação ( Melhoramento da massa);
pH ótimo de atividade 5,0- 5,5
Temperatura ótima 55- 60ºC
Estável em pH 4,5
Estável em temperaturas inferiores a 
45ºC.
Aplicações das proteases
em massas
• Modificações das proteínas do trigo.
• Melhora a elasticidade e textura da 
massa.
• Melhora a extensibilidade e simetria
• Melhoramento do aroma e da cor 
(Reação Mailard). 
Propriedades do Glúten da Farinha de Trigo
Ação mecânica
Elasticidade
Extensibilidade da massa
Rede do glúten
Aplicação das Proteases Fúngicas 
em Panificação
Protease fúngica hidrolisa parcialmente 
a rede de glúten e torna a massa elástica 
e fina para biscoitos, pizza
Proteases
A massa pode 
ser esticada 
muito fina sem 
despedaçar .
Proteases melhora as propriedades de 
manuseio da massa , elasticidade e 
textura, diminui o tempo de fermentação
Rede do glúten
Proteases de Aspergillus oryzae são 
utilizadas na produção biscoitos 
doces e bolacha água e sal
Melhora a extensibilidade da massa 
e a simetria.
A massa deve ser 
macia e elástica a 
fim de prevenir 
deformação, 
curvatura, 
entortamento e 
encolhimento do 
biscoito no forno .
A impressão de letras e decoração, 
comum em biscoito requer massa 
macia e plástica. 
Melhorador de farinha = protease 
para biscoito wafer
Protease hidrolisa parcialmente as 
proteínas da farinha melhorando a 
extensibilidade da massa.
Serina Proteases ou Proteases 
Alcalinas
Ativas em pH alcalino
pH 7 a 11
Plasmina Sangue
Tripsina Pâncreas bovino ou 
suíno
Quimotripsina Pâncreas bovino ou 
suíno
Subtilisina Bacillus sp
HO C C C
H H
H NH2
O
OH
SERINA
Tem grupo hidroxila do 
aminoácido serina no sítio 
ativo
-OH
Plasmina 
(Protease endógena do leite)
• Serina protease importante para a 
maturação do queijo (camenbert, 
cheddar).
• Atividade ótima em pH 7,5 e a 37ºC.
• Estável ao calor. 
Plasmina
o Hidrolisa rapidamente a β –caseína
o Hidrolisa 8 ligações peptídicas da 
α - S2 caseína.
o Pouca atuação sobre α - S1 caseína.
o Não hidrolisa κ -caseína.
Tripsina
Hidrolisa principalmente ligações peptídicas 
no lado carboxiterminal dos aminoácidos 
Lys e Arg.
Tripsina
Peptídeos +
+
Lys Lys Arg COOHH2N
H2N COOH
Lys
Arg
COOH
COOHH2N
H2N
Lys
Lys
Tripsina (Protease Pancreática)
Atividade
ótima
pH 7 – 9
50ºC
Aplicações
Produção de hidrolisados de 
proteínas vegetais e de 
peixe;
Obtenção de peptídeos 
bioativos;
Diminuição da alerginicidade
de proteínas;
Auxiliar de digestão;
pH 
Estabilidade
Estável em pH abaixo 6
Em pH > 6 a tripsina é 
inativada por 
autodigestão
Tripsina é muito estudada porque 
ativa outras proteases
Tripsinogênio Tripsina
Tripsina
Quimotripsinogênio Quimotripsina
Procarboxipeptidase A Carboxipeptidase A
Inibidores de Tripsina
A tripsina é inativada por algumas
proteínas de baixa massa
molecular encontradas em
alimentos.
Soja crua = Inibidor de Kunitz e
Bowman
Feijão cru
Trigo cru
Amendoim cru
Ervilha crua
Inibidores de tripsina em clara de 
ovo crua
Ovomucóide
Glicoproteína 
resistente à 
desnaturação térmica.
Ovoinibidor
Inibidor de tripsina e 
quimotripsina.
Quimotripsina 
Peptídeos +
+
Phe Tyr Trp COOHH2N
H2N COOHPhe
Tyr
Phe COOH
COOHH2N
H2N
Quimotripsina 
Hidrolisa ligações peptídicas do 
lado carboxi-terminal de Phe, Tyr e 
Trp.
Phe
Trp
+
pH 
Estabilidade
Estável em pH 2 – 6
Retém 80% da 
atividade após 4 h a 
37oC em pH 2 – 6
Retém 10% da 
atividade após 4 h a 
37oC em pH 8 – 9
(autodigestão)
Quimotripsina ( protease pancreática)
Atividade
ótima
pH 7 – 9
38ºC
Hidrolisados Protéicos
Proteínas
Proteases
Hidrólise parcial
Hidrolisados Protéicos
Melhoria nas 
propriedades 
funcionais
•Solubilidade
•Dispersibilidade
• Formação de espuma
• Emulsificação
Aplicações: alimentos infantis não 
alergênicos, alimentos geriátricos, 
bebidas para esportistas, alimentos 
para dieta.
Hidrolisados Protéicos
Tabletes de 
caseína 
hidrolisada 
com 
protease 
pancreática
Proteínas de 
soro de leite 
hidrolisadas.
Uso :
4 cápsulas, duas 
vezes ao dia , 30 
minutos antes e após 
atividade física 
vigorosa.
Hidrolisados Proteicos para Crianças 
e Adultos
Indicações:
� Adequado para pacientes que não 
toleram proteínas intactas.
� Suplemento para crianças com 
problemas gastrointestinais. 
� Intolerância múltipla de proteínas de 
alimentos.
� Mal absorção. 
Composição:
Equivalente a 12% proteína
(44% aminoácidos livres, 
56% peptídeos de baixa 
MM; 42% carboidratos, 46% 
gordura.
Alto conteúdo de vitaminas e 
minerais
Alerginicidade
• Proteínas do Leite
• Soja
• Glúten
• Ovos
• Amendoim 
• Castanha do Pará
Proteínas que causam alergenicidade em 
crianças e adultos :
Entre as pessoas alérgicas às proteínas do 
leite :
60% alérgicas à caseína
60 - 80% alérgicas a β-lactoglobulina
50 % alérgicas a α-lactoabumina
Para crianças com alergias a 
alimentos e cólicas devido à 
sensibilidade a proteínas e 
dificuldade de digestão de gorduras.
Alimento de fácil digestão. 
Hidrolisado de 
caseína 
hipoalergênico
Proteases Alcalinas
• Obtenção de hidrolisados proteicos , 
peptídeos bioativos;
• Aplicação em detergentes 
hospitalares e domésticos;
• Remoção de resíduos de alimentos, 
sangue, etc;
• Lise de proteínas da parede celular 
de algumas bactérias.
Fonte : Bacillus subtilis 
Atividade ótima pH 7,5 – 9,5
55 - 65ºC
Clarificação do meio fermentado de 
Xanthomonas campestris
 
Xanthomonas 
campestris
 
48h a 
30 ºC Meio 
fermentado
viscoso 
(goma 
xantana)
Protease de
B. subtilis ou 
B. licheniformis
Lise das células 
de Xanthomonas 
campestris
Recuperação da 
goma xantana 
por precipitação 
com etanol
Meio 
contendo 
sacarose
Proteases Sulfidrílicas 
(proteases vegetais)
Contém resíduo do aminoácido 
cisteína no sítio ativo.
Papaína
Ativa
Papaína
Inativa
Oxidação
Redução
+ Cisteína
Papaína Protease sulfidrílica
pH ótimo de 
atividade
pH 5 ( gelatina)
pH 7 (albumina de ovo 
e caseína) 
pH estabilidade
Maior estabilidade em
pH 5.
Instável pH abaixo de 3 
e acima de 11.
Estabilidade
Térmica
Bastante estável
Perda de 20% da 
atividade após 30 
min a 70ºC em pH 7
Temperatura 
ótima
60 – 70ºC
Papaína
Ampla 
Especificidade 
Hidrolisa proteínas 
e peptídeos 
pequenos
Endoenzima
Forma peptídeos 
amargos em leite e 
hidrolisados 
protéicos
Atividade de 
síntese
Sintetiza 
polipeptídeos a 
partir de 
aminoácidos e 
peptídeos
Extração de Papaína
Látex de mamão
(Carica papaya )
Hidrólise de proteínas;
Síntese de plasteínas;
Auxiliar de digestão; 
Amaciamento da carne 
Aplicações da Papaína
Papaína Quimopapaína
Amaciante de Carne Contendo Papaína
Papaína hidrolisa o 
tecido conectivo 
(colágeno, elastina 
etc) durante o 
cozimento da carne.
Mistura de sal, papaína , 
glutamato de sódio e 
temperos.
Bromelina
Extraída do caule da 
planta do abacaxi.
Aplicações Tenderização da carne;
auxiliar de digestão para
uso clínico;
hidrólise de proteínas
Tabletes de bromelina 
(auxiliar de digestão)
BROMELINA Protease sulfidrílica
pH Ótimo de 
Atividade
pH 5 (gelatina )
pH 6 a 8 (caseína)
Estabilidade
Térmica
Razoavelmente 
estável a 55°C
Temperatura 
Ótima
50° - 60oC
pH 
Estabilidade
Estável pH 4 - 10
BROMELINA CARACTERÍSTICAS
Endoenzima
Hidrolisa preferencialmente 
ligações peptídicas 
envolvendo grupos 
carboxilas de aminoácidos 
básicos (arginina) e 
aminoácidos aromáticos 
(fenilalanina e tirosina)
Forma peptídeos amargos na hidrólise de 
proteínasdo leite.
Arg Phe Tyr COOHH2N
2CH
3 3
CHH C
CH
CH N
COOH
Peptídeo
C
Arginina 
2
NH NH
C
CH
CH
NH
CH
COOH
 H N CH
2
OH
C
H
C
O
N
C
C
O CH
 N
2
CH
H C CH
33
Fenilalanina
Leucina
CH 2
H
N
C
C
H
O
C
C
N
CH
Tirosina
O
H
CH
CHH C
33
Valina
N
C
C
O
2 CH
NH
CH
CH
C
NHNH
2
Arginina
C
OH
Aminoácidos 
aromáticos
Aminoácidos
básicos
Especificidade da Bromelina
Bromelina
Fenilalanina Tirosina
Fenilalanina
Tirosina
Arginina
Arginina
Leucina
Valina
FICINA Características
pH ótimo pH 5 - 7,5
pH Estabilidade 
máxima
pH 6 - 8,
pH de Estabilidade pH 3,5 - 9
Extraída de Látex de
Figo
10-15 g de figo verde
contém 100 - 150 mg
de ficina.
Figo maduro → Perde 10 -
12% da atividade em
relação ao figo verde.
FICINA
Temperatura ótima 62,5°
Termoestabilidade inativada a 80°C
Ampla especificidade quanto ao 
substrato
Proteases vegetais 
( papaína e bromelina= alta 
atividade proteolítica)
Leite + 
mamão cozido
Leite +
abacaxi cozido
Leite +
mamão in natura
Leite + 
abacaxi in natura
Proteína 
hidrolisada
Proteína 
hidrolisada
Leite
Controle
Leite 
coagulado 
com 
Quimosina
animal
Leite 
coagulado 
Renina 
fúngica
Ação de Proteases no Leite
1 2 3
Leite 
coagulado 
com 
pepsina
4 5 6
Leite 
coagulado 
e 
hidrolisado 
com 
papaína
Leite 
coagulado 
e 
hidrolisado 
com
bromelina
Hidrólise extensiva = forma sabor amargo
Metaloproteases
Íons
- Zn2+
Zn2+
Protease ativa Protease inativa
MetaloProtease Fonte Íon 
metálico 
Carboxipeptidase A humana Zn2+
Protease de 
bacteriana
Bacillus 
subtilis
Zn2+
Zn2+ , Mg2+ , Co+
Fe3+ , Cad2+ , Cu2+ , Ni+
Carboxipeptidases
Carboxipeptidase
Exoenzima que hidrolisa a ligação 
peptídica carboxi terminal.
peptídeo
Aminoácidos
livres
+ +
Peptídeo
Menor MM
COOHH2N
H2N COOH
Carboxipeptidase A
Aplicação:
Hidrólise de peptídeos amargos 
contendo resíduos de aminoácidos 
aromáticos e hidrofóbicos.
+
Aminopeptidases
Aminopeptidase
Exoenzima que hidrolisa a ligação 
peptídica amino terminal.
peptídeo
Aminoácidos
livres
++
Peptídeo
Menor MM
COOHH2N
H2N COOH+
Pseudomonas fluorescens
produtor de metaloprotease e lipase
Estocagem de leite cru à baixa 
temperatura
Crescimento de 
Pseudomonas fluorescens 
(psicrotrófico)
Gelificação do leite e produção de 
peptídeos amargos.
Hidrólise de proteínas e gorduras.
Metalo protease de 
Pseudomonas fluorescens
Atividade ótima = pH 6,0 - 6,5 à 37º C
Ativa em temperatura de refrigeração 
= 4ºC – 7ºC
Atividade proteolítica dependente de 
Ca2+.
Metalo protease de 
Pseudomonas fluorescens
70% de atividade residual após 
tratamento 75ºC por 20 seg.
Termoresistentes e não são 
inativadas por pasteurização (72ºC / 
15 seg) e processamento UHT (138ºC/ 
2 seg ou 149ºC/ 10 seg).
Tipo de 
Queijo
Enzimas 
adicionadas
Fonte Estágio 
de 
Adição
Cheddar
Protease ácida 
e neutra, lipase, 
descarboxilase
Enzimas 
animais
Coalho
Exemplos de adição de enzimas 
para acelerar a maturação de 
queijo
Gouda Protease Aspergillus
oryzae
Leite e 
coalho
Cheddar,
parmesão
Lipase, 
protease
Tecido 
gástrico de 
ovelha
Leite e 
coalho
Queijo Azul ( Blue Cheese ) 
Gorgonzola
Penicillium roquerfort produz peptidases 
e lipases importantes para a proteólise e 
lipólise durante a maturação do queijo.
2 endopeptidase
Penicillium roquerfort
3 exopeptidase
Efeito de proteases comerciais no 
desenvolvimento de flavour em queijos 
Cheddar, após 2 meses de maturação
Tipo de 
Protease
Conc. 
U/g
Flavour de 
queijo 
Cheddar
Escala
0 - 8
Sabor 
amargo
Escala
0 - 4
Outros 
off 
flavours
Escala
0 - 4
Protease
ácida
A.oryzae
50 1,8 3,3 1,1
10 2,6 2,8 0,7
2 2,7 2,6 0,4
0,4 2,1 2,2 0,3
0,08 2,2 0,7 0,2
Protease 
neutra
B. subtilis
50 3,1 1,6 0,9
10 3,4 0,7 0,4
2 3,2 0,1 0,2
0,4 2,7 0,1 0,2
Protease alcalina
B.licheniformis
2 2,9 3,5 0,0
Pronase
S. griseus
2 4,1 0,5 0,6
Controle - 2,4 0,1 0,2
Biossíntese de Aspartame com 
Termolisina (Metaloprotease)
C
H
C
2
HO
C
O
OH
H
N
C
OO
CH
2
C C
3
3
COO CH
2CHH N+
O
3C
C
C
H
N
NH
2 C
H
CH 2
CHC CH
O
O
2
O
HO
 Aspartame
H
O
2
C
C
HO
Termolisina
180 - 200 vezes maior que a sacarose
+
Benziloxi-carbonil –
L-Aspartato
Fenilalanina
- metil ester
Benziloxi-carbonil
PRODUTO MATERIAL FUNGO PAÍS
Molho 
de soja
Soja , 
trigo
Aspergillus 
oryzae e
Aspergillus 
soya
Japão, 
Coréia,
China
Aplicações de fungos proteolíticos 
em alimentos orientais
Misso 
(pasta 
de soja)
Soja, 
arroz, 
cevada
Aspergillus 
oryzae
Japão, 
Coréia,
China
PRODUTO MATERIAL FUNGO PAÍS
Ontjom Farinha de 
amendoim
Neurospora 
sitophila
Indonésia
Aplicações de fungos proteolíticos e 
amilolíticos em alimentos orientais
Lao-chao Arroz Rhizopus 
chinensis
China
Tempeh Soja
Rhizopus 
oligosporus 
e
Rhizopus sp
Indonésia
Sufu Soja
Actinomucor 
elegans, 
Mucor sp
China
Meitanza Soja Actinomucor
elegans
Katsoubashi Peixe Aspergillus 
glaucus
Japão
Produção de Molho de Soja 
Fermentado
Soja intumescida 
em água.
Aquecida com 
vapor
Trigo torrado e 
moído
Mistura dos grãos
Fermentação de Soja e do Trigo
Inoculação de 
Aspergillus oryzae
Fermentação 
de soja e trigo 
em bandejas 
(Koji)
Aspergillus oryzae produz proteases e 
amilases que hidrolisam respectivamente 
as proteínas em aminoácidos e o amido 
em glicose.
Soja e trigo
Koji (soja e trigo fermentado)
Adição de sal
Adição de 
leveduras
Adição de 
bactérias lácticas 
tolerantes a sal
Fermentação do mosto
Shoyu bruto
Pasteurização
Embalagem
Resíduo
Molho 
de soja
Shoyu
8 Enzimas da preparação comercial 
Flavourzyme (Novozymes) obtida de 
Aspergillus oryzae ATCC42149/RIB 40
Enzima pH ótimo de 
atividade
Temperatura 
ótima de 
atividade
Leucina
aminopeptidase
A (LAPA)
pH 9,0
(ativa em pH 6,5 
a 10)
65ºC
Leucina
aminopeptidase
2 (LAP2)
pH 9,5 
( 50% da 
atividade em pH 
8,5 a 10,5)
50ºC
Dipeptidil
Peptidase 4 
(DPP4)
pH 8,5 
( 50% da 
atividade em pH 
7,5 a 9,5)
60ºC
Enzimas da preparação comercial Flavourzyme
(Novozymes) obtida de Aspergillus oryzae
ATCC42149/RIB 40
Enzima pH ótimo de 
atividade
Temperatura 
ótima de 
atividade
Dipeptidil
Peptidase 4 
(DPP5)
pH 6,0 
( 50% da atividade 
em pH 5,0 e cerca 
de 80% da atividade 
em pH 7,0
65ºC
Protease Neutra 
1 (NP1)
pH 7,0 50ºC
Protease Neutra 
2 (NP1)
pH 5,0 -5,5 60ºC
Protease Alcalina pH 7,0
(ativa em pH 6,0 –
10,0)
50ºC
α -amilase A Tipo 
3 (AMY 3)
pH 5,0- 5,5
(50% da atividade 
em pH 3,0 e 7,0)
50ºC
Referências Bibliográficas
• Bioquímica de Alimentos Eskin N.A.M., 
Shahidi,F. 3 ed. Elsevier, 2015
• Food Chemistry – Owen Fennema, 5th 
edition, 2017
• Enzymes In Food Processing –
Nagodawithana, T. Gerald Reed, 1993
• Merz, M. ; Eisle,T.; Berends,P.; Appel, D.; 
Rabe, S.; Blank, I.; Streeler,T.; Fischer,L. 
– Flavourzyme, an enzyme preparation
with industrial relevance : Automated nive
step purification and partial
characterization of eight enzymes. 
Journal of Agricultural and Food
Chemistry. V.63, p.5682-5693, 2015