TSA - TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS

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Métodos para o TSA
1. Macrodiluição em tubos
Esta técnica foi uma das primeiras a ser utilizada na avaliação da sensibilidade aos
agentes antimicrobianos e envolve a preparação de diluições seriadas e
logarítmicas de antimicrobianos (por exemplo, 1, 2, 4 e 8 μg/mL) em um meio de
cultura líquido, o qual permitirá o crescimento bacteriano.
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1. Macrodiluição em tubos
Um tubo límpido demonstra que o crescimento bacteriano foi inibido, sendo que o
primeiro tubo límpido representa a concentração inibitória mínima (CIM), ou seja,
a menor concentração de antimicrobiano capaz de inibir o crescimento bacteriano. A CIM
é expressa em microgramas por mililitro ( μg/mL).
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2. Microdiluição em caldo
A microdiluição em caldo corresponde à miniatura da técnica de diluição. Ao contrário
da anterior, a microdiluição em caldo utiliza placas de Elisa estéreis, com 96 poços, com
o fundo em formato de “U”, para permitir a melhor visualização do crescimento
bacteriano.
A vantagem deste método, em relação ao da diluição em tubo, é que em uma placa
podemos testar uma bactéria utilizando um número variável de antimicrobianos, em
torno de 12 drogas, com distintas concentrações (4 a 8 diluições logarítmicas).
As placas de microdiluição podem conter o antimicrobiano liofilizado ou congelado e são
inoculadas com o auxílio de um dispositivo plástico, para obter uma concentração
bacteriana final de aproximadamente 5 x 104 a 105 UFC/mL em cada poço da placa de
microdiluição.
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2. Microdiluição em caldo
Os painéis de microdiluição, após a inoculação, são incubados a 35°C por 16 a 20 horas
ou de acordo com o microrganismo em teste:
para amostras de Haemophilus spp. e Streptococcus spp., o período de incubação deve
ser de 20 a 24 horas;
para cepas de Staphylococcus spp. e Enterococcus spp., a incubação deve ser realizada
por um período de 24 horas completas para avaliação da sensibilidade aos
antimicrobianos oxacilina e vancomicina.
Após a incubação, a leitura da placa com a determinação da CIM será
realizada visualmente (Figura 3). A interpretação é feita da mesma forma que a
da macrodiluição.
Esta metodologia é bastante utilizada pelos laboratórios de microbiologia clínica em
países desenvolvidos, pois o processo de confecção das placas é mecanizado e a
comercialização de placas de microdiluição congeladas ou liofilizadas é realizada por
vários fabricantes. O teste quantitativo de microdiluição em caldo é utilizado pelos
sistemas automatizados, podendo ser combinado com a identificação da espécie
bacteriana pela incorporação de provas bioquímicas na mesma placa.
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2. Microdiluição em caldo
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3. Ágar-diluição
O teste de ágar-diluição é realizado pela incorporação de concentrações seriadas e
logarítmicas de um antimicrobiano em meio de cultura na forma de ágar e distribuído
em placas de Petri individuais.
Cada placa representa uma única concentração de antimicrobiano. Portanto, se for
necessário testar mais de uma concentração, múltiplas placas devem ser
confeccionadas para cada antimicrobiano. Podem ser avaliadas, incluídos os controles,
até 32 bactérias simultaneamente, quando se utiliza a placa de 90 x 60 mm. Em geral,
são necessárias de 6 a 12 placas para avaliar a sensibilidade a um antimicrobiano.
As amostras bacterianas são inoculadas simultaneamente sobre a superfície do ágar
utilizando o multi-inoculador, que dispensa de 1 a 3 μL de solução contendo
aproximadamente o inóculo final de 1 x 104UFC/mL. O multi-inoculador possui de 32 a
96 pinos, permitindo que este número de amostras seja inoculado simultaneamente
sobre o ágar contido na placa de Petri.
As placas inoculadas são incubadas por 18 a 24 horas, a 35°C. Após este período,
a CIM é determinada como a concentração que não permite o crescimento
macroscópico bacteriano (Figura 4).
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3. Ágar-diluição
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4. Etest®
O Etest® (AB Biodisk, Solna, Suécia) é uma fita plástica, disponível comercialmente, que é
impregnada por concentrações crescentes de antimicrobiano em uma de suas faces. Na
face oposta, está impressa a escala das concentrações testadas, a fim de orientar a leitura
do resultado. Este teste baseia-se na difusão de um gradiente antimicrobiano no ágar,
para a determinação da suscetibilidade da amostra bacteriana ao antimicrobiano testado
(Figura 5).
A preparação do inóculo é feita da mesma maneira que no teste de disco-difusão. Com o
auxílio de um swab, o inóculo bacteriano contendo 1 a 2 x 108 UFC/mL é semeado na
superfície do ágar. Após 15 minutos, em média, as fitas de Etest® são dispensadas sobre o
ágar, com o cuidado de acomodar a fita com a face que contém o antimicrobiano voltada
para a superfície do ágar.
Em placas de 150 mm de diâmetro, são aplicadas no máximo seis fitas.
Em placas de 90 mm, somente uma fita é aplicada.
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4. Etest®
A leitura é realizada após o período de incubação. A determinação da CIM é feita como o
ponto de interseção entre a fita de Etest® e a zona de inibição do crescimento do
microrganismo, que assume a forma elíptica, o que dá origem ao nome do
teste, Episilometer test.
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4. Etest®
Vários estudos demonstram que a CIM determinada pelo Etest® apresenta concordância
com os métodos de ágar-diluição e microdiluição em caldo, para diferentes
antimicrobianos, em geral, com uma variação permitida de ± 1 diluição (Figura 6).
Este método é considerado tolerante ao inóculo e pode ser, facilmente, adaptado a
diferentes condições que possam favorecer a expressão da resistência bacteriana, por
exemplo: aumentar a tonicidade do meio para a detecção de amostras de Staphylococcus
aureus resistentes à oxacilina. Além disto, permite a avaliação da sensibilidade aos
antimicrobianos de bactérias fastidiosas, como H. influenzae, S. pneumoniae e bactérias
anaeróbias, que exigem meios de cultura enriquecidos ou condições de incubação
especiais.
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4. Etest®
Alguns cuidados deverão ser levados em consideração, pois diferenças acentuadas na
determinação das CIMs de antimicrobianos sensíveis à mudança de pH têm sido notadas
entre o Etest® e a microdiluição em caldo. Estas diferenças podem ser atribuídas à
alteração do pH do meio, ocasionada pela incubação da placa de Etest® a 5 a 7% de CO2.
Nesta situação ocorre diminuição da atividade de antimicrobianos, como macrolídeos e
lincomicinas, ocasionando elevação da CIM. Como as placas de microdiluição em caldo
não precisam ser incubadas em CO2, não há alteração da CIM secundária à mudança
significativa do pH.
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5. Disco-difusão
O teste de disco-difusão em ágar foi descrito em 1966, por Bauer e Kirby. O teste fornece
resultados qualitativos. É um dos métodos de suscetibilidade mais simples, confiável e
mais utilizado pelos laboratórios de microbiologia. O seu princípio básico é a difusão do
antimicrobiano na superfície do ágar, a partir de um disco impregnado com o mesmo
antimicrobiano (Figura 7).
O teste é realizado dispensando os discos de papel-filtro, impregnados com
antimicrobianos em concentrações fixas, sobre a placa de ágar, após a semeadura do
inóculo bacteriano com aproximadamente 1 a 2 x 108 UFC/mL.
Para evitar interferências, que possam dificultar a leitura e interpretaçãodos halos após a
incubação, está padronizado que:
em uma placa de 150 mm, devem ser colocados no máximo 12 discos;
em uma placa de 90 mm, no máximo 5 discos.
As placas são incubadas por 18 a 24 horas em ar ambiente ou a 5 a 7% de CO2 a 35°C,
antes dos resultados serem determinados.
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5. Disco-difusão
Os diâmetros dos halos de inibição de crescimento ao redor de cada disco são
mensurados em milímetros e relacionados à:
sensibilidade da amostra bacteriana e
velocidade de difusão do antimicrobiano no ágar.
Após a medição dos halos, é feita sua interpretação, utilizando os critérios
estabelecidos pelo CLSI específicos para a bactéria testada. Quando os halos de
inibição são correlacionados aos valores logarítmicos da CIM, pela análise de
regressão linear, encontra-se uma relação linear consistente demonstrando que o halo
de inibição é inversamente proporcional à CIM daquele antimicrobiano (Figura 8).
Desta maneira, as amostras bacterianas são categorizadas
em sensíveis, resistentes ou intermediárias. Na maioria das situações clínicas, o teste
qualitativo é suficiente para orientar a escolha terapêutica, mas em algumas
situações, é necessário quantificar a suscetibilidade (sensibilidade ou resistência), isto
é, fazer a detecção da CIM. Neste caso, será necessário recorrer a um método
quantitativo.
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5. Disco-difusão
A realização de um controle de qualidade rigoroso é obrigatória, considerando-se que um
grande número de variáveis pode afetar o teste de disco-difusão. Dentre estas variáveis
destacam-se:
o preparo dos meios de cultura;
o controle do pH do meio;
a espessura do ágar na placa;
o tempo de armazenamento das placas;
a temperatura e a atmosfera de incubação;
a concentração do inóculo;
o estoque adequado dos discos de suscetibilidade;
o rigor na execução da técnica.
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5. Disco-difusão
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6. Sistemas automatizados
Os dois sistemas automatizados mais utilizados, no Brasil, para a realização dos testes de
suscetibilidade são o Vitek®, da bioMérieux e o Walk-Away®, da Dade International. No
entanto, o BD PhoenixTM, da BD Diagnostic Systems também pode ser encontrado no
mercado nacional.
O uso desses instrumentos permite a execução dos testes de suscetibilidade com mais
rapidez, pois estes aparelhos possuem recursos capazes de detectar alterações discretas
do crescimento bacteriano. Também são capazes de realizar simultaneamente a
identificação de bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas e o TSA, por meio de painéis
ou cartões combinados.
Os métodos automatizados avaliam 2 a 4 diluições, em geral, que representam as
concentrações referentes aos limites de sensibilidade ou resistência de cada
antimicrobiano. O BD PhoenixTM apresenta diluições seriadas e, às vezes, mais de 4
diluições. Dessa maneira, o sistema relata se a bactéria apresentou CIM superior ou
inferior aos limites de resistência ou sensibilidade, respectivamente. O sistema também
pode reportar se o valor da CIM encontra-se na categoria intermediária. Por isso, é
possível afirmar que os resultados fornecidos por estes sistemas são semi-quantitativos.