MÉTODOS DIAGNOSTICOS DAS DOENÇAS VIRAIS

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MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
DAS DOENÇAS VIRAIS
DIAGNÓSTICO DAS INFECÇÕES
VIRAIS
● O diagnóstico virológico pode ser
feito a partir de métodos diretos e
indiretos;
● Os indiretos podem ser tanto
qualitativo quanto quantitativo;
● Os diretos podem ser tanto
qualitativo quanto quantitativo;
● Buscar o vírus ou seu genoma:
Biologia molecular;
● Avaliam a presença dos anticorpos
ou até mesmo do próprio vírus;
● Esses anticorpos podem ser totais,
IgM, IgG, IgA;
● Analisar a cicatriz vacinal, a
doença prévia e tempo para
produzir anticorpos;
● Tu precisa de um tempo para que
seja produzido os anticorpos, é de
7 a 10 dias para tu ter pelo menos
um IgM, para IgG tu precisa de
mais de 10 dias;
● Os antígenos são exames que
possuem mais especificidade dos
que os anticorpos, porque eles são
específicos para cada vírus;
● A grande vantagem dos antígenos
é que eles precisam de menos
tempo;
● O antígeno é muito mais versátil
para identificação de doenças,
porque ele não tem tempo grande
igual os anticorpos;
● Anticorpos ficam até 3 meses
depois que tomou a vacina, lembra
da vacina do COVID-19;
● O teste rápido da intermediário,
reagente e não regante, então ele
é qualitativo;
● O exame de antígeno identifica
alguma proteína, que constitui
capsídeo, está associado a
alguma região viral;
● Teste muito sensível tem baixa
especificidade;
● Teste super específico é menos
sensível;
● Quando tu usa especificada e
sensibilidade eles são
inversamente proporcionais;
● Padrões ouro- são técnicas que
consegue colocar os dois, sem
prejudicar e um ficar
desproporcional;
● As técnicas diretas são
heterogêneas. Elas mesclam
sensibilidade e especificidade;
● Nada mais específico que os
ácidos nucleicos: RNA e DNA;
● Ou os vírus têm DNA ou tem RNA;
● O DNA dele é muito mais
específico que qualquer coisa;
● Qualquer área de diagnóstico, o
genoma consegue ser o mais
específico;
● PCR: reação em cadeia da
polimerase;
● PCR: técnica que amplifica DNA a
partir de uma enzima que
consegue ser bastante resistente a
temperaturas; só funciona com
DNA, tu usa o DNA para realizar
ele;
● Vírus que são adenovírus tu pode
fazer a técnica de PCR;
● Os vírus RNA tem uma enzima
que fazem uma transcrição
reversa; Eles produzem uma fita
de DNA, quando eu tiver DNA eu
posso fazer PCR;
● RT- PCR- para vírus de RNA;
● A partir de agora se eu disser que
é um adenovírus- PCR. Se é um
retrovírus é RT- PCR;
● Tanto PCR quanto o RT- PCR
podem ser tanto qualitativo quanto
quantitativo;
● Quando eu falo RTqPCR ou qPCr:
significa um teste quantitativo;
● SABER QUAL TÉCNICA
RESPONDE MINHAS DÚVIDAS;
● Buscar a resposta do organismo
(especialmente anticorpos):
imunologia.
- Pesquisa de antígenos;
- Pesquisa de anticorpos- IgM,
IgA, IgG.
● Exame molecular x exame
sorológico;
● Um exame molecular, como a
Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR), detecta a
presença do material genético
do patógeno (por exemplo, DNA
ou RNA) no organismo do
paciente;
● Um exame sorológico detecta a
presença de anticorpos no
sangue, que são proteínas
produzidas pelo sistema
imunológico em resposta a uma
infecção;
● Os exames que buscam o
diagnóstico direto. Esse
diagnóstico direto é por
amplificação;
● Só amplifica esse DNA ou RNA se
temos o DNA alvo;
● Técnica de amplificação, como
PCR: separa essas duas fitas de
DNA que terão que se replicar. Só
irão se duplicar se tiver o DNA alb
na amostra;
● Testes indiretos estão relacionados
com esse tempo dependente;
● A maior parte dos exames
imunológicos irão fazer a detecção
do vírus- seja antígenos ou
anticorpo;
● Hemaglutinação - teste que
usamos VDRL que é a pesquisa
de anticorpo não treponêmico;
Ele é o técnico mais utilizado.
Depende de um tempo para que
ela tenha uma quantidade grande
de antígenos;
● Teste imunocromatográfico: é um
teste de triagem, ele tem muita
sensibilidade;
● Teste rápido são os de mais ampla
cobertura e que são mais fáceis;
● Teste de imunologia pesquisa o
antígeno ou anticorpo;
● Elisa e quimioluminescência (são
indiretos) - CLIA e ECLIA;
● Os testes de triagem são só de
alta sensibilidade; é mais sensível
e menos específico;
● Padrão ouro- alta sensibilidade e
alta especificidade;
● Se eu avalio o desempenho dos
métodos moleculares raramente
terão problemas com falso positivo
ou falso negativo;
● Essa técnica não pode ser feita em
qualquer lugar.
DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO
● Detecção do vírus - antígenos ou
anticorpos
● Isolamento e cultura viral com
detecção imunológica
● Microscopia eletrônica e
Microscopia de
Imunofluorescência
● Aglutinação, Hemaglutinação (HA)
e Testes Imunocromatográficos
● ELISA e Quimioluminescência -
CLIA E ECLIA
OBS.: avaliar a sensibilidade e
especificidade dos métodos: falsos
negativos x falsos positivos.
HEMAGLUTINAÇÃO
A hemaglutinação indireta é
frequentemente usada para detectar a
presença de anticorpos específicos no
soro do paciente, ou para identificar
antígenos em uma amostra. Um
exemplo é o teste de inibição da
hemaglutinação, usado em virologia
para detectar anticorpos contra vírus:
● Preparação dos Reagentes: O
antígeno (por exemplo, um
vírus ou parte dele) é misturado
com hemácias de um tipo
específico que se aglutinam na
presença do antígeno.
● Preparação das Amostras: O
soro do paciente é adicionado à
mistura. Se o soro contém
anticorpos contra o antígeno,
esses anticorpos se ligarão ao
antígeno.
● Incubação e Aglutinação: A
mistura é incubada. Se os
anticorpos no soro do paciente
neutralizarem o antígeno, a
aglutinação das hemácias será
inibida, indicando um resultado
positivo para a presença de
anticorpos específicos no soro
do paciente.
Análise da aula:
● Agregação de eritrócitos devido à
presença de anticorpos (ou vírus
ou lecitinas);
● Hemácias sensibilizadas por
antígenos específicos para um
patógeno são usadas para testar o
soro do paciente;
● Quando na ausência de agente
hemaglutinante (anticorpo), as
hemáceas sedimentam na forma
de botão;
● Quando há aglutinação das
hemácias sedimentam na forma
de tapete (difusa);
● Na foto são as hemácias com
moléculas antigênicas;
● Quando tu usa antígeno tu está
procurando anticorpo e vice
versa;
● Quando tu trabalha com antígeno
tu consegue detectar com mais
precocidade;
● Doenças de curto prazo, agudas,
tu não terá antígeno, só terá
anticorpos;
● Feito em placas de elisa;
● Vai ter uma concentração da
amostra;
● Pesquisar como é realizada;
● Isso representa no momento em
que as hemácias não aglutinam tu
não tem mais antígeno/ anticorpo;
● Ele é quantitativo;
● Ele é teste indireto;
● Hemácia + anticorpo= pesquisa
antígeno;
● Hemácia + antígeno= pesquisa
anticorpo;
● Efeito prozona na segunda foto;
● É um frasco com hemácias
sensibilizadas e daí pinga dentro
dos poços.
OBS.: Alguns vírus não hemoaglutinam:
Influenza (gripe), Rubéola Parvovírus,
Coronavírus, Arbovírus, Adenovírus
e vários outros.
ELISA
● Ensaio imunoenzimático;
● Anticorpo conjugado a uma
enzima capaz de modificar um
cromógeno, através da reação
com seu substrato específico,
gerando colorações diferentes de
acordo com o cromógeno;
● Superior a hemaglutinação;
● Testes rápidos só são qualitativos;
● Quanto mais incidência de cor,
mas…
● É um ensaio quantitativo de alta
sensibilidade e alta
especificidade;
● É um dos testes utilizados para
confirmar HIV;
● O teste ELISA baseia-se na
interação específica entre
antígenos e anticorpos, usando
uma enzima ligada a um
anticorpo ou antígeno para
gerar um sinal detectável;
● A intensidade da cor produzida
é medida usando um
espectrofotômetro. A
intensidade da cor é
proporcional à quantidade de
anticorpos ou antígenos
presentes na amostra;
● Diagnóstico de Doenças
Infecciosas: HIV, hepatites,
COVID-19, dengue, zika, entre
outras;
● Elisa direto: o antígeno é
diretamente adsorvido na placa
e detectado por um anticorpo
ligado a uma enzima.
● Elisa indireto: O antígeno é
adsorvido na placa, e o
anticorpo primário da amostra é
detectado por um anticorpo
secundário enzimático;
Existem vários tipos de Elisa:
● Pesquisa de antígenos-placas
contém anticorpos específicos;
● Pesquisa de anticorpos- placas
estão sensibilizadas por antígenos.
IMUNOFLUORESCÊNCIA
● A imunofluorescência é uma
técnica baseada na ligação de
anticorpos com fluorocromos;
● A imunofluorescência pode ser
direta ou indireta;
● IF direta detecta-se o antígeno
pesquisado: amostra recebe o
conjugado (anticorpo específico
marcado com fluorocromo);
● IF indireta detecta o anticorpo
pesquisado: a placa de
fluorescência é produzido com
antígenos específicos, testa-se o
soro do paciente, posteriormente
adiciona-se o anti-anticorpo
marcado com fluorocromo;
QUIMIOLUMINESCÊNCIA - CLIA
● Padrão ouro;
● Irão combinar mais
especificidade, mais
sensibilidade e são em
controlados;
● Laboratorialmente: utilizam-se de
anticorpos ligados a um marcador
luminescente (cromógeno). Ex.:
hormônios, drogas e
microrganismos podem ser
identificados por testes
colorimétricos.
● Reação química - gera energia
luminosa;
● Reagentes atingem estados
intermediários eletronicamente
excitados
● Ao passarem para um estado de
menos excitado, liberam a energia
absorvida na forma de luz;
● Reagente luminol;
ELETROQUIMIOLUMINESCÊNCIA-
ECLIA
● Emissão de luz através da
aplicação de potenciais de
oxidação ou redução;
● Utiliza micropartículas revestidas
de estreptavidina: anticorpo
monoclonal específico biotinilado e
um anticorpo monoclonal
específico para cada analito;
● Aplicação de corrente elétrica no
eletrodo que induz uma emissão
quimioluminescente, medida por
um fotomultiplicador;
RADIOIMUNOENSAIO
● Competição de um antígeno
presente na amostra em análise
com um antígeno marcado com
isótopo radioativo pelo mesmo
anticorpo;
● A concentração do antígeno em
análise será inversamente
proporcional à radiação emitida;
● Técnica com alta especificidade e
sensibilidade: custo elevado e
grande risco operacional (material
radioativo).
PCR E RT PCR
Sensibilidade
● Sensibilidade analítica: limite de
detecção de 100 cópias/mL;
● A sensibilidade clínica é variável
conforme o dia da coleta em
relação ao início da infecção;
● Capacidade de detecção viral e
quantificação da carga viral.
Especificidade
● Sondas utilizadas são específicas
para ácido nucleico viral;
● Não ocorre detecção cruzada de
outros vírus;
● Especificidade = 100%.
PRINCIPAIS TÉCNICAS
Testes rápidos- imunocromatográficos
● Teste qualitativo;
● Menor sensibilidade e
especificidade do que os outros
métodos.
Elisa
● Teste quantitativo;
● Maior sensibilidade e
especificidade.
Clia e Eclia
● Teste quantitativo;
● Maior sensibilidade e
especificadade.