Virologia: Métodos Diagnósticos

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VITÓRIA NOVAIS - MED 
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL VIRAL: 
A detecção do vírus é importante para: 
 Auxiliar na escolha da terapêutica adequada 
 Avaliar a progressão da doença 
 Prevenir o uso não adequado de antibióticos 
 Implementar medidas de controle de infecções 
 Monitorar a eficiência do tratamento antiviral (quando ele 
existe) 
 Saúde Publica 
o Monitorar e contolar surtos 
o Implementar testes diagnósticos e programas de 
vacinação apropriados 
o Reconhecer patógenos comuns e emergentes 
INTRODUÇÃO: 
Testes diagnósticos utilizados em virologia: 
1) Detecção Direta 
 Detecção de proteínas virais ou material genético viral 
o Microscopia eletrônica 
o Imunofluorescência (IF) 
o Testes rápidos (point-of-care) 
o Métodos moleculares 
2) Detecção Indireta 
 Visualização da multiplicação viral e seus efeitos 
o Cultura celular 
o Ovos embrionados 
o Animais de laboratório 
3) Sorologia 
 Marcadores da resposta imune
 
o ELISA (Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay) 
 
Cuidados iniciais necessários antes da realização dos exames: 
 Coleta, embalagem e transporte 
 Local da coleta do material 
 Armazenamento correto: freezer -80°, nitrogênio líquido 
 Tempo de inicio dos sintomas 
o Importante pois, para alguns testes, existem períodos ideais 
de coleta 
 
 Cuidado com a escolha do método. Falta de resultados, 
resultados falsos ou incompletos  diagnóstico errado 
o A maior parte dos erros ocorrem-na fase pré-analítica, isto é, 
antes da análise laboratorial 
DETECÇÃO DIRETA: 
MICROSCOPIA ELETRÔNICA: 
 Baseada em feixe de elétrons para formação de imagens 
 Possibilita a visualização da partícula viral tanto em cortes 
como tridimensional 
 Usada para: 
o Confirmação do isolamento viral 
o Identificação de novos vírus 
o Identificação de patógenos em surtos 
 
IMUNOFLUORESCÊNCIA: 
 
 
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 Apesar de ser um método sorológico, procura por 
antígenos através de anticorpos 
 Anticorpo marcado com fluorescência é colocado na 
amostra e se o antígeno estiver presente o anticorpo se 
liga a ele 
 Imunofluorescência Indireta: 2 anticorpos, 1º não 
marcado e o 2º marcado  aumenta a sensibilidade do 
teste 
 Utilização: 
o Viroses respiratórias 
o Varicela Zoster 
o Rotavírus 
o CMV (citamegalovírus) 
TESTES RÁPIDOS – POINT-OF-CARE: 
 Baseados na ligação Ag-Ac em fase sólida (uma 
membrana que vem no aparelho) 
 É um teste imunocromatográfico = acontece mudança 
de cor 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Vantagens: 
o Rápido (15 minutos) 
o Fácil realização 
 
 Desvantagens: 
o Baixa sensibilidade (50-70%) 
 Utilização: 
o SARS-Cov-2 
o Vírus influenza 
o Vírus respiratório sincicial (RSV) 
o Rotavirus 
o Dengue 
o HIV (triagem e confirmatório) 
DETECÇÃO INDIRETA: 
ISOLAMENTO EM CULTURA CELULAR: 
 Crescimento de vírus in vitro em culturas de células específicas 
 Inicialmente era utilizado para diagnóstico 
 Atualmente é mais usado para 
o Estudos de vacinas e antígenos para sorologia 
o Estudos de replicação viral e patogênese 
 3 tipos de culturas celulares: 
o Primária: coleta diretamente no órgão ou tecidos, porém 
tem vida limitada (pode ser mantida no laboratório apenas 
por algumas semanas) 
o Semi-contínuas ou Diplóides: tecido fetal (pode durar 
alguns meses) 
o Linhagens contínuas: de origem tumorais (“imortais”  se 
multiplicam em laboratório por tempo indeterminado) 
 Identificação do crescimento viral (não é possível ver o vírus) 
através de: 
o Observação do efeito citopático: efeito do vírus nas células 
o Hemadsorção 
o IF 
o Métodos moleculares 
 Vantagens: fácil realização, amplo espectro e boa sensibilidade 
 Desvantagens: manutenção, variabilidade, contaminação e 
demora no resultado (10-14 dias ou mais) 
 Utilização: 
o Identificação de vários tipos de vírus: AdV, CMV, HEV, HSV, 
Influenza, PIV, RSV, VZV, etc 
o Identificação de novos vírus 
o Pesquisas de dinâmica de infecção, mecanismos de 
replicação, antivirais e resposta imune 
CÉLULA HELA – HENRIETTA LACKS: 
 
 Henrietta Lacks foi 
uma jovem norte-
americana, 
diagnosticada com 
tumor de colo de 
útero em fase 
avançada 
 Um médico colheu material de Henrietta para biopsia e isolou 
as hoje denominadas células de HeLa 
 a paciente não foi informada desta coleta e teste e faleceu 
algumas semanas depois 
 
 
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 Henrietta foi reconhecida como grande contribuidora 
para a ciência, pois atualmente diversos laboratórios 
utilizam as células de HeLa (células “descendentes” 
das células de Henrietta) para estudo de diversos tipos 
de câncer, desenvolvimento de vacinas (pólio), 
mapeamento de genes, tratamentos (AIDS, leucemia) 
e mecanismos de apoptose. 
 Foram fundamentais para o estudo da Tuberculose, 
HIV e HPV 
 Primeira célula humana clonada 
OVOS EMBRIONADOS: 
 Isolamento e cultivo de vírus aviários, mas outros tipos 
de vírus também crescem nesse tipo de tecido 
 Ovos Specifc Pathogen Free (SPF) 
 Inoculação de vírus no ovo livre de patógeno 
 Pouco utilizados em diagnóstico por ser um método 
muito trabalhoso e demorado 
 Usados em pesquisa e na produção de vacinas 
ANIMAIS DE LABORATÓRIO: 
 Pouco utilizados em diagnóstico 
 Usados em pesquisa 
o Patogênese 
o Imunidade 
o Tumores 
SOROLOGIA: 
ELISA: 
 Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay 
 Interação Ag-Ac 
 Ag ou Ac imobilizado (ligado a placa) 
 Reação enzimática (colorimétrica = mudança de cor) 
 Leitor de ELISA 
 Vantagens: rápido, sensível, especifico e pratico 
 Desvantagens: mão de obra especializada, reagentes 
refrigerados e custo do leitor de ELISA 
 Utilização: 
o SARS-CoV-2 
o HIV 
o West Nile Virus 
o Rotavírus 
o Vírus da Hepatite B 
 
ELISA DIRETO: 
 Antígeno é preso em base e um anticorpo marcado com uma 
enzima é colocado  a reação enzimática provoca a mudança 
de cor 
ELISA INDIRETO: 
 Antígeno é preso na placa e um anticorpo é colocado. Em 
seguida, adiciona-se um anti-anticorpo ligado a uma enzima 
MÉTODOS MOLECULARES: 
POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR: 
 Síntese de DNA in vitro dependente de um molde e catalisado 
por uma DNA Polimerase termoestável 
 3 passos: denaturação (abertura da fita)  anelamento 
primers (pequenos pedaços do DNA que iniciam a formação 
de novas fitas0  extensão (síntese das novas fitas) 
 Teste extremamente sensível 
 Vantagens: alta sensibilidade, alta especificidade, amplo 
espectro e rapidez 
 Desvantagens: custo dos equipamentos, mão de obra 
especializada, contaminação 
Variações da PCR BÁSICA: 
1. RT-PCR: parte do RNA ao invés de DNA
 
 
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 RNA é uma molécula muito instável e para ser 
trabalhada precisa ser transformada em DNA 
através da enzima Transcriptase Reversa 
 AMV: Vírus da Mieloblastose Aviária 
 MMLV: Moloney Murine Lukemia Virus 
 Superscript II e III: AMV Recombinante 
 
2. Real Time (qPCR): 
 PCR padrão com adição de sonda ou fluorófolo 
para o produto final gerar sinal de fluorescência 
 Detecção do sinal é realizada em tempo real 
 Permite a quantificação do material inicial 
 O produto cresce em escala exponencial (dobra em 
cada ciclo) 
 Resultado da qPCR é observado como uma curva 
exponencial comuma fase latência (Lag), fase 
logarítmica (Log) e fase linear ou estacionária 
 
Para um ensaio focado na expressão de genes por 
exemplo, a partir do gráfico gerado ao término da reação, 
é traçada uma linha de maneira paralela ao eixo 
referente ao número de ciclos (abscissas), na altura em 
que se inicia a fase exponencial da amplificação gênica 
(início da elevação exponencial na emissão da 
fluorescência). Este parâmetro representa o limiar de 
detecção, ou seja, o número mínimo de ciclos para 
amplificação, e é denominado“threshold”. 
O ponto em que o “threshold” cruza com a linha de 
amplificação da amostra, permite determinar o número 
de ciclos necessários para o início da amplificação da 
sequência gênica-alvo presente no DNA de cada amostra. 
Este valor é denominado Ct (“Cycle Threshold”) e permite 
a quantificação relativa do DNA de cada uma das 
amostras, após ser corrigido pelos Ct dos genes-controle 
endógenos e das amostras-controle. 
O Ct é proporcional ao logaritmo da quantidade inicial de 
expressão do gene-alvo em uma determinada amostra, quanto 
menor for o número inicial do Ct obtido do gene-alvo na 
amostra, é porque houve maior amplificação do gene-alvo e, 
consequentemente, ele apresenta maior expressão.