Infecções urinarias Uropatógenos (UITs)

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Microbiologia - Caso 05
Infecções urinarias – Uropatógenos (UIT’s)
•São infecções do trato urinário (UTIs) causadas principalmente por bactérias. Pode haver infecções por protozoários, mas as infecções por bactérias prevalecem. 
•Os principais agentes envolvidos são E. coli uropatogênica (UPEC)-80%, Proteus mirabilis, klebsiella pneumoniae, S.saprophyticus e outras Enterobactérias. Prevalecem as infecções por bactérias gram negativas. 
•As UTIs estão relacionadas principalmente com a susceptibilidade individual, gênero, como também idade, diabetes e o uso de cateter. 
Os diabéticos podem apresentar algum grau de glicosuria na urina, e isso favorece o crescimento e proliferação microbiana. Por isso são mais propensos às infecções.
O uso de cateter facilita muito as infecções urinarias, pelo fato de ser um corpo estranho e facilitar a entrada de patógenos.
Infecções urinarias não complicadas: o indivíduo desenvolve a infecção urinaria, mas o indivíduo é sadio. Não houve nenhuma pré disposição para o aparecimento da infecção. Grupo de risco: gênero feminino, idoso e crianças. As bactérias que causam infecção no trato urinário (TU), são normalmente bactérias do TGI.
Infecções urinarias complicadas: o indivíduo possui alguma anormalidade anatômica, neurológica (bexiga neurogênica), está em coma, uso de cateter ou fez transplante. Essa infecções urinarias são mais graves. Grupo de risco: uso do cateter, imunossupressão, anormalidades no trato urinário e uso exagerado de antibióticos causando resistência.
O foco é a UPEC e o Proteus mirabilis.
E. coli (UPEC) :
•Bacilo gram-negativo. 
•Anaeróbio facultativo. 
•Móvel – flagelo flexível em toda extensão da bactéria. Ajuda a vencer a barreira física que é o fluxo urinário unidirecional.
•Fermenta lactose. 
•Pouco exigente nutricionalmente. 
•Capaz de invadir e se replicar dentro das células uroepitélias. Pode formar colônias dentro das células uroepitéliais. Isso ajuda a invadir o sistema imune, encurtar a resposta imunológica, para que elas possam infectar outras células e formar novas colônias.
•Identificação das cepas por seus sorotipos de antígenos O, H e K. 
Sítios de colonização E. coli 
•Extra-intestinais 
•Intestinais 
O foco é a UPEC e suas infecções no rim e na bexiga.
Fatores de virulência da UPEC 
•Comunidade bacteriana intracelular (IBCs). Resulta da invasão das células uroepitéliais. E serve para se protegerem da resposta imune; os macrófagos não vão conseguir reconhecer o patógeno porque ele vai estar escondido na célula uroepitélial. Isso ajuda na recorrência de infecções no trato urinário e em outros locais do corpo, formando novas colônias.
- Resulta da invasão bacteriana em células epiteliais da bexiga 
- Estão protegidos dos componentes do sistema imune 
- Podem contribuir para recorrência das UTIs
- Tanto a UPEC quanto a Proteus mirabilis, possuem aderência à célula uroepitélial através das suas diversas fimbrias e seu flagelo. Isso não quer dizer que a bactéria vai infectar tudo ao mesmo tempo, ela infecta 2 em um momento, 3 em outro momento. Isso é um mecanismo de enganar o sistema imunológico, porque as fimbrias e as adesinas vão levar a produção de anticorpos. Quando ela deixa emprestar um fimbria ou uma adesina, elas enganam o sistema imune, que já tem anticorpos pré formados, para que não ocorra o reconhecimento.
- Produzem várias toxinas 
- Mecanismo de evasão do sistema imune
- Vão produzir – uciderocitos- proteínas para se ligar firmemente ao ferro
- Flagelos
- O Proteus mirabilis, forma uréases, que leva a formação de cálculos urinários no paciente infectado.
*Patogenia da UPEC (IBCS): Formação das colônias de bactérias intracelular – Upec
A bactéria reconhece que é uma célula epitelial da bexiga
Invade e se multiplica
O neutrófilo não consegue atacar e fagocitar essa bactéria, pois ela está dentro da célula. Além de dificultar o sistema imune, impede a ação de antibióticos, também. 
Algumas bactérias, podem se tornar filamentosas. É uma bactéria que não conseguiu se dividir e aumenta sua área de superfície. Isso para a patogenia e para virulência da bactéria é ótimo, pois ela aumenta sua superfície de aderência na célula epitelial, então o virulência torna-se maior e mais patogênica devido as bactérias filamentosas (mudança morfológica).
A bactéria continua a se multiplicar dentro da célula uroepitélial, até matá-la. Então o neutrófilo vai ter contato com algumas bactérias e pode fagocita-las e outras vão infectar outras células uroepiteliais. 
*Patogênese da UPEC:
1- Contaminação da área periuretral por E.coli uropatogenica da microbiota intestinal.
2- Aderência as células epiteliais da vias urinarias mediadas pela fimbria P, um dos fatores de adesão + outras adesinas.
3 – Invasão: multiplicação intracelular observada por determinadas linhagens. Dessa forma se escondendo dos neutrófilos. Alguns neutrófilos vão conseguir fagocitar algumas bactérias.
4 – Apoptose e exfoliação de células epiteliais da bexiga.
5- Influxo dos PMNs
6- E.coli ascendente para o rim
7- Fimbria se liga as células tubulares renais
8- Indução de citocinas e toxinas. Essa citocinas evitam uma inflamação e um recrutamento maior de células de defesa.
9- Dano epitelial provocado por hemolisina 
10 – Vacuolização de células epiteliais e dano glomerular provocado por toxinas.
11- E. coli atravessa a barreira de células epiteliais tubulares para iniciar a bacteremia.
Tal estado de infecção só vai ocorrer se não houver uma ação com antibióticos.
A morte celular causada pelas bactérias, também serve de forma de nutrição bacteriana. Ajudando a chegada da bactéria até os rins e formação de novas colônias e biofilmes.
No caso de infecções complicadas, como no caso do uso de cateter, só pelo fato do corpo estranho estar na bexiga já leva a uma reposta inflamatória local. O ato do corpo estranho estar ali, leva a um dano tecidual, esse dano leva o recrutamento de proteínas de coagulação, como o fibrinogênio. Algumas bactérias produzem proteínas que se ligam ao fibrinogênio e ajuda na formação de colônias ao redor do cateter, podendo levar até a obstrução do mesmo, por conta do agregado de fibrinogênio e bactérias e células de defesa.
Proteus mirabilis :No tocante a patogênese e tendo como foco as cepas de E. coli uropatogênicas (UPEC), é possível dizer que, ao alcançarem o trato urinário as cepas de UPEC enfrentam diversos mecanismos de defesa que incluem o fluxo da urina, numerosas moléculas anti-bacterianas e o influxo de células imunes. Para superar ou evitar essas defesas e persistir na colonização das vias urinárias, cepas de UPEC desenvolveram uma série de mecanismos para aderir e invadir as mucosas do trato urinário estimulando resposta inflamatória deletéria ao hospedeiro (GUAY, 2008; ZHAO et al., 2009). A bem-sucedida utilização destes mecanismos de virulência por cepas de UPEC é refletida, em parte, pela prevalência e recorrência de infecções do trato urinário (ITU), o que posiciona este agente etiológico como a principal causa de ITU.
Entre os fatores de virulência associados à UPEC, a expressão de fatores de adesão, mesmo em meio à expressão de toxinas ou quaisquer outros fatores de virulência, é o mais importante determinante da patogenicidade, visto que a adesão de UPEC a células do trato urinário evita a depuração provocada pelo fluxo de urina. Fatores de adesão podem também contribuir para a virulência de várias outras formas, por exemplo, ao desencadear ativação de vias de sinalização das células do hospedeiro, podendo proporcionar o aumento da adesão bacteriana e a invasão das células hospedeiras (GUAY, 2008). Estudos têm demonstrado que E. coli é capaz de invadir e replicar dentro da mucosa da bexiga formando comunidades bacterianas intracelulares, o que pode estabelecer reservatórios intracelulares quiescentes para infecções recorrentes.
Além disso, fatores de adesão são os principais mediadores na formação inicial de biofilmes. Biofilmes são comunidades bacterianas, inseridas em uma matriz extracelular impermeável que forneceproteção contra condições deletérias, como a ação de células imunes e uso de antibióticos. Diante destes fatos, é possível dizer que os biofilmes geram grande impacto clínico e são reconhecidos como responsáveis por grande parte das infecções crônicas e de difícil tratamento.
•Gram-negativa 
•Anaeróbica facultativa, bastonete 
•Móvel 
•Produz grandes quantidades de urease (uma reação que produz co2 e amônia. Isso eleva o ph da urina, favorecendo a formação de cálculos. As bactérias vivem dentro dessas pedras, e serve como um fator de evasão do sistema imune.)
*UREASE 
•Uma das principais características das UTIs causada por P. mirabilis é a litíase urinária (produção de pedras no trato urinário). A formação destas pedras é o resultado da atividade da enzima urease que hidrolisa a ureia em amônia e CO2. 
• A produção de amônio aumenta significativamente o pH, resultando na precipitação de íons que são normalmente solúveis na urina. Estas pedras, tais como o fosfato de amônia magnesiano, podem bloquear o fluxo de urina através de cateteres e resultar em cicatrizes renais devido a formação do cálculo dentro da pelve renal. 
• As bactérias podem ser encontradas dentro destes cálculos urinários, onde elas estarão protegidas das defesas do hospedeiro e do tratamento com antibióticos. 
*Patogênese do Proteus mirabilis:
A bactéria hidrolisa a ureia em amônia e co2, através da enzima uréase. Isso vai levar a mudança de Ph no ambiente, e a posterior formação de cristais e aglomerados e novas culturas de bactérias ao redor e dentro do cateter. Essa formação de cristais protege o Proteus da ação das células do sistema imune. 
A obstrução do cateter pelas bactérias leva a retenção urinaria, melhorando o ambiente para as bactérias. 
Algumas outras bactérias não irão hidrolisar amônia, mas vão para o dentro de células uroepitéliais, se protegendo mais uma vez do sistema imune.
A bactéria forma poros, através da toxina Hpma, nas células uroepitéliais, levando a morte dessa célula que libera Ferro, e a bactéria utiliza esse Ferro para sua nutrição.
A bactéria libera a toxina Pta, que vai formar junções entre a bactéria e a célula uroepitelial, desestabilizando a célula, todo seu citoesqueleto, e os filamentos de actina, levando a destruição celular.
Proteus é um gênero de bactérias gram-negativas da família Enterobacteriaceae. Produtor de urease, cliva a ureia em dióxido de carbono e amônia aumentando o pH facilitando a formação de cálculos renais.
*Efeito da urease do P.mirabilis :
•Hidrólise 
•Elevação do pH 
•Precipitação de íons solúveis em urina normal 
*Mecanismo da resposta imune inata contra UTIs:
A ativação da resposta imune inata é tão rápida que na maioria das vezes não se desenvolve infecções no trato urinário. 
A células uroepitéliais produzem sequencias de peptídeos que destroem as bactérias. 
Na maioria das vezes a reposta imune inata consegue resolver o problema sem precisar ativar a resposta imune adaptativa. 
Uma resposta imune inata mais eficaz, automaticamente é direcionada da melhor forma possível a resposta imune adaptativa. Por isso, os pesquisadores estudam candidatos vacinais que tornem a resposta imune inata mais eficaz e melhor, ajudando na melhor atuação de toda a cascata imunológica. 
*Mecanismo de evasão do sistema imune:
A bactéria vai produzir uma serie de toxinas e proteínas que vão desviar e enganar a resposta imunológica. 
A enterobactina, é um sideroforo (proteína) que se liga ao ferro para levar para a bactéria utilizar como nutrição. Então, o neutrófilo produz uma proteína chamada de lipocaina, que se liga à enterobactina impedindo que ela leve o ferro para a bactéria. Assim, a bactéria deixa de produzir a enterobactina e produz outro tipo de sideroforo para enganar o sistema imune, e o neutrófilo não consegue reconhecer. 
Outro mecanismo de evasão é quando as bactérias deixam de expressar suas fimbrias, para evitar que ocorra a opsonização.
A bactéria deixa de expressar antígenos nas fimbrias, para enganar o sistema imune.
A bactéria também produz proteases ( ZapA) que vão degradar os anticorpos.
*Fatores de virulência em comum da UPEC e o P.mirabilis :
•Evasão imune 
•Toxinas 
•Sideróforos 
•Aderência através das fimbrias 
•Motilidade através dos flagelos
Além disso, produzem proteínas que diminuem a inflamação local causada pelo infecto, pois assim menos células de defesa serão deslocadas para o local.
A uréase é particularidade o Proteus mirabilis.
O Proteus está envolvido mais com infeções complicadas.
Obs: Deve saber os fatores de virulência e a função de cada um. 
*Resumindo... 
•O trato urinário é um local comum de infecções bacterianas 
•Os uropatógenos Escherichia coli e Proteus mirabilis são patógenos que representam as UTIs 
• Fatores de virulência que são comuns para esses patógenos incluem: fímbrias, flagelos, sideróforos, toxinas e mecanismos de evasão do sistema imune 
•Fatores adicionais que contribuem para a infecção da E. coli são as comunidades bacterianas intracelular e a produção de urease pelo P. mirabilis no qual pode resultar em formação de pedras no trato urinário. 
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
 Bactérias Álcool-Ácido Resistentes
Bacilos Álcool-ácido Resistentes (BAAR):
São bactérias resistentes à coloração, mas que uma vez coradas vão resistir fortemente à descoloração, mesmo por ácidos fortes diluídos e álcool absoluto. 
97% de álcool e 3% de ácido clorídrico. 
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN 
Coloração de escolha para a identificação de bactérias do gênero Mycobacterium.
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae.
A parede das micobactérias possui uma espessa camada de lipídios (ácido micólico) que evita a penetração de diversos corantes de gram. Então usa-se um corante que é mais lipofílico, pois a parede é lipídica. Logo usa um corante com afinidade aos lipídeos. 
É uma coloração a quente, é preciso aquecer para que ocorra a penetração do corante. A coloração de gram é a frio.
Por outro lado, quando o corante penetra alcançando o citoplasma da célula, ele não é removido com facilidade, nem mesmo com a utilização de agentes descolorantes (mistura álcool-ácido). 
A célula que permanece corada após a mistura álcool-ácido ter sido aplicada é álcool-ácido resistente, enquanto aquelas que se descoram, são denominadas álcool-ácido sensíveis (maioria das bactérias)
PROCEDIMENTO 
Preparo do esfregaço. 
Cubra a lâmina com o corante Fucsina de Ziehl (Carbol-fucsina) e aqueça a lâmina até à emissão de vapores (é importante não deixar ferver para que não ocorra a perda da morfologia da célula); 
Aguarde por 5 minutos; 
A alta temperatura facilita a penetração do corante pela parede da bactéria. 
Lave a lâmina em um filete de água corrente. 
Cubra a lâmina com Álcool-Ácido verifique a descoloração que deve ocorrer em cerca de 20 segundos. Lave a lâmina. 
Cubra a lâmina com Azul de Metileno (contra corante) deixe agir por 2 minutos e lave a lâmina. 
Seque a lâmina com papel filtro. 
Leve a lâmina ao microscópio e observe em objetiva de imersão. 
Resultados 
células vermelhas: álcool-ácido resistentes - Mycobacterium . Por causa da fucsina.
células azuis: álcool-ácido sensíveis. 
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS: Divide-se a lamina em campos e faz a contagem dos BAAR