Miopátia mitocondrial

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Miopatia mitocondrial 
Em animais. 
Parte 01.
Neste primeiro caso, cão pastor alemão O. PACIELLO, P. MAIOLINO, G. FATONE E S. PAPPARELLA Departamento de Patologia e Sanita` Animação - Setor Anatomia Patológica (OP, PM, SP) e Departamento de Science Clínica Veterinária - Seção de Clínica Cirúrgica (GF), Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Estudos dos Napoli Federico II, Nápoles, Itália Abstrato. 
Um cão pastor alemão, 9 meses de idade, foi encaminhado para avaliação do exercício progressivo intolerância. O exame clínico revelou uma marcha rígida e acentuada atrofia e hipotonia do esqueleto e Músculo. 
O cão havia criado creatina quinase (181 U / litro), lactato desidrogenase (510 U / litro) e aspartato níveis de aminotransferase (123,6 U / litro), sugerindo uma doença muscular.
 Avaliação histoquímica de biocombustíveis revelaram a presença de atividade oxidativa subsarcolêmica, redução do dinucleotídeo de nicotinamida adenina, e succinato desidrogenase, e a ausência de atividade do citocromo oxidase. Fibras vermelhas irregulares foram revestido com mancha tricrômica de Gomori. O exame ultra estrutural do músculo confirmou a presença de acumulações subsarcolêmicas de mitocôndrias e mitocôndrias 
morfologicamente atípicas.
Introdução 
Os distúrbios mitocondriais são um grupo heterogêneo doenças com apresentação multissistêmica.10,13 muitos processos metabólicos ocorrem na mitocôndria drial, a alteração da produção de adenosina trifosfato devido à diminuição da atividade mitocondrial cadeia respiratória é o fator causador da maioria dessas doenças.(5) A cadeia respiratória está embutida na membrana mitocondrial interna e é composto de quatro complexos enzimáticos de várias subunidades codificados por ácido desoxirribonucleico mitocondrial (mtDNA) e DNA nuclear. Portanto, doenças mitocondriais podem surgem de mutações mitocondriais ou nucleares genomas. Mutações no mtDNA são transmitidas por herança internacional e são geralmente heteroplásmicos, que os mtDNAs de tipo selvagem e mutante coexistem no mesmo celular.5,7,9 Nos distúrbios mitocondriais, os mais graves órgãos afetados são os mais dependentes da oxidação metabolismo, incluindo músculos cerebrais, esqueléticos e cardíacos cles; Órgãos sensoriais; e rim.8 Poucos casos de doenças mitocondriais foram descritos em medicina veterinária.2,3,4,11 Relatamos a achados bioquímicos e ultra estruturais da mitocôndria miopatia drial em um cão pastor alemão.
Histórico de casos.
Um pastor alemão de 9 meses de idade foi encaminhado ao Departamento de Ciências Clínicas Veterinárias - Universidade de Nápoles, com uma história de intolerância ao exercício, relutância em se mover e dor intensa. Os sinais clínicos surgiram um mês antes e aumentou progressivamente em gravidade. O cão apresentou atrofia muscular sistêmica, principalmente nos músculos truncais e dos membros, mialgia e anormalidade da marcha (marcha rígida, cifose toracolombar e coque- ny-hopping em membros pélvicos). Os exames ortopédicos e neurológicos não foram notáveis. Foram coletadas amostras de sangue para avaliação hematológica e exame sorológico. Um diagnóstico de miopatia esquelética de etiologia desconhecida foi realizada a antibioticoterapia (amoxicilina-clavi- ácido lânico, 20 mg / kg bid po) e ventiladores (aspirina, 25 mg / kg qid po) foram administrados enquanto aguardavam resultados de a análise. Cinco dias depois, o cão não mostrou prova. A hematologia de rotina não revelou anormalidades. Bio- química mostrou níveis aumentados de creatina quinase a 37 ° C (181 U / litro), lactato desidrogenase (510 U / litro) e aspartato aminotransferase (123,6 U / litro). Radiografias das articulações coxofemoral e joelho tomadas, mas nenhuma anormalidade foi encontrada. Biópsias musculares foram coletadas do bíceps femoral músculo para exame histopatológico.
Materiais e métodos. 
Amostras de biópsia muscular do músculo bíceps femoral foram congelados em isopentano pré-resfriado em nitrogênio líquido. 
Segundo coradas pelas seguintes informações histológicas e técnicas químicas: hematoxilina e eosina (HE), modificadas tricromático gomori, óleo-vermelho-O, ácido periódico - Schiff (PAS), citocina citocromo oxidase (COX), succinato desidrogenase (SDH), e nicotinamida adenina dinucleotídeo tetrazólio reduzido redutase (NADH-TR). 
Utilizamos uma amostra do músculo bíceps de um cão sacrificado por uma doença neoplásica como controle para manchas histoenzimáticas para microscopia eletrônica de transmissão, músculo adicional as amostras foram fixadas em glutaraldeído a 2,5%, pós-fixadas em tetróxido de sódio e incorporado em resina Spurr de baixa viscosidade. Cortes ultrafinos foram cortados, contrastados com 0,5% de uranil acetato e citrato de chumbo e examinados usando um Zeiss Electron Microscópio 902.
Resultados 
A coloração com HE mostrou fibras atróficas únicas e fibras com borda basofílica ao longo do sarcolema (Fig. 1). 
Seções coradas com tricrômico de Gomori modificado tinha muitas "fibras irregulares vermelhas" (RRF) com subsarco- depósitos linfáticos e intermyofibrilares de granulado avermelhado material geral (Fig. 2). A coloração com PAS mostrou um aumento no glicogênio na periferia das fibras (Fig. 3), mas a coloração com óleo vermelho O não era digno de nota. SDH e As manchas de NADH-TR demonstraram concentração de oxi- atividade dativa na periferia das fibras (Fig. 4). Muitas fibras musculares e todos os tipos de fibras não conseguiram manchar para atividade COX (Fig. 5). Subsarcolêmico residual A atividade da COX foi observada em algumas fibras. Em contraste, músculo esquelético canino normal apresentou COX pontual coloração distribuída por todo o citoplasma de um sub- população de fibras musculares (Fig. 6). Exame ultraestrutural confirmou presença de mitocôndrias anormais, grandes e gigantes, com formas (por exemplo, "mitocôndria em forma de taco de golfe") em uma posição subsarcolêmica e próxima ao núcleo (Figs. 7, 8). Essas mitocôndrias continham matriz abundante e mostrou cristais desintegrantes ou irregularmente cristae ondulante (crista sinuosa). Muitos inchados tocôndrias foram observadas. A matriz mitocondrial apareceu vacuolado, às vezes contendo osmio- corpos filos, densos em elétrons (Fig. 9). Em alguns minutos condrias, rupturas na parede eram evidentes. As mitocôndrias musculares foram incorporadas em um sarco- plasma contendo uma grande quantidade de glicogênio, conforme gestados por coloração com PAS.
(Imagem microscópica 1.)
Dados da imagem:
Fig. 1. Músculo esquelético; cachorro. Atrofia de fibras monomusculares e fibras com borda basofílica (setas) ao longo da sarcolema. Ele mancha. Barra 5 22 mm. Fig. 2. Músculo esquelético; cachorro. RRF com depósitos avermelhados subsarcolêmicos e intermyofibrilares de material granular (Setas; flechas). Mancha tricromática de Gomori modificada. Barra 5 22 mm. Fig. 3. Músculo esquelético; cachorro. Aumento do glicogênio na periferia das fibras (setas). Barra 5 40 mm. Fig. 4. Músculo esquelético; cachorro. Concentração de atividade oxidativa na periferia das fibras (seta). Mancha SDH. Barra 5 40 mm. Fig. 5. Músculo esquelético; cachorro. Altas proporções de fibras musculares e todos os tipos de fibras não reagiram à COX. Residual A atividade da COX é observável em algumas fibras (setas). Mancha COX. Barra 5 40 mm. Fig. 6. Músculo esquelético; cachorro. Controle positivo que mostra a distribuição normal da atividade COX. Mancha COX. Bar 5 40 mm.
Discussão.
A análise de DNA permitiu uma melhor compreensão das bases moleculares das doenças mitocondriais que resultou em miopatias ou encefalomiopatias.8 distúrbios condriais associados a mutações envolvendo O mtDNA pode ter várias características genéticas características, incluindo:
 1) Herança materna.
 2)Hetero- plasmática devido à alta taxa de mutação do mtDNA e segregação aleatória de mitocôndrias durante a divisão celular.
 3) Expressão limiar do fenótipo. 
 4) Variação fenótipo clínico confiável resultante de diferenças defeitos e até que ponto um tecidodepende de produção de energia tocondrial.7,8 Distorções mitocondriais fatores devidos a mutações no mtDNA nem sempre são de uma mãe afetada. Alguns casos podem ser esporádicos. 
Casos esporádicos provavelmente resultam de mtDNA deleções durante a embriogênese, o que é favorecido desenvolvimento porque o DNA excluído reproduz mais rapidamente do que sua contraparte normal. Porque a maioria as mutações no mtDNA alteram ou eliminam as taxas de transferência. Genes do ácido bonucleico (tRNA), alterando assim a Na maioria das proteínas codificadas por mitocôndrias (mt), a diversidade das consequências clínicas e bioquímicas é intrigante. Os efeitos pleiotrópicos dessas doenças sugerem que fatores adicionais podem ser importantes para terminando os fenótipos clínicos e bioquímicos.8 O diagnóstico de miopatia mitocondrial é baseado na apresentação clínica e nos seguintes critérios: 
*Evidência de mutações ou deleções no mtDNA, defi- eficiência das enzimas da cadeia respiratória em fibroblastos ou muscular.
*Alterações características como FRR ou de- coloração SDH ou COX aumentada na biópsia muscular.
*Presença de estrutura mitocondrial anormal e uma membro familiar com doença mitocondrial comprovada. Un- felizmente.
Não tínhamos dados sobre a linhagem dos animais. No presente caso, mas o proprietário não conhecia outro parente afetado da mesma forma. 
Poucos casos de miopatias mitocondriais2,3,11 têm foram relatados em animais domésticos. Citologia alterada atividade de cromo C, oxidase e mensageiro mt reduzido O RNA (RNAm) foi demonstrado, por ensaio enzimático, em fibroblastos e músculo esquelético de um inglês antigo. Alguns autores sugeriram que a disfunção mt pode ser o fator causador de meta-esforço miopatia bolica com acidose láctica em cães.4,11 A biópsia muscular muda, embora inespecífica, 
Geralmente fornecem a pista de diagnóstico inicial e investigações adicionais para descobrir os detalhes subjacentes defeitos.
A marca morfológica das mitocôndrias mitocondriais opatias, devido à mutação nuclear ou mtDNA envolvendo a cadeia respiratória, é a presença de FRR. Eles são de contorno irregular e mostram sub- depósitos granulares sarcolemais e intermiofibrilares com a mancha tricrômica de Gomori modificada. 
O sar- o coplasma parece fragmentado; mudanças se assemelham a rachaduras factuais. Essa aparência representa a acumulação de mitocôndrias sob o sarcolema e entre miofibrilas. No entanto, RRF também pode ocorrer na deficiência de maltase ácida adulta e como inespecífica achado isolado em várias miopatias. 
Em hu- músculos do homem, sua frequência aumenta com a idade, atingindo um máximo de cerca de 0,4% no oitavo cade. Provavelmente reflete o acúmulo relacionado à idade de mitocôndrias anormais com dano ao DNA.1 A FRR é mais comumente observada com mutações primárias no mtDNA, geralmente nos genes do RNA de transferência, e raramente com mutações no DNA nuclear.3 SDH, que indica um número anormalmente aumentado mitocôndrias, tem sido frequentemente usado como marcador histoquímico qualitativo para FRR em pacientes esqueléticos músculos SDH é o complexo II das vias respiratórias encadeada na memória mitocondrial interna brana e está especificamente envolvido na oxidação de succinate.
Carrega elétrons da flavina adenina di-nucleotídeo (forma reduzida) à coenzima Q. SDH é a única enzima no complexo da cadeia respiratória que é totalmente codificado pelo genoma nuclear. (12) deficiências essenciais da atividade do SDH ou aumento da atividade do SDH atividade pode ser observada na miopatia mitocondrial.12 No nosso caso, um achado peculiar foi o fracasso de fibras musculares para manchar histoquimicamente para a ativação da COX ity. As fibras COX-negativas estão invariavelmente presentes em pacientes do sexo masculino com oftalmopatia externa progressiva gia, síndrome de Kearns-Sayre e reversível benigna forma de deficiência de citocromo c oxidase, mas eles dez ocorrem em outras encefalomiopatias mitocondriais e em pacientes com miopatia isoladamente.
Estudos recentes mostraram que as mitocôndrias com mtDNA deletado já são concentrados exclusivamente em segmentos das fibras que não possuem atividade COX.8 Esses estudos também mostraram que a maioria dos mtDNAs excluídos são transcritos internacionalmente ativo, mas os mRNAs mt abundantes, transcritas principalmente a partir de geografias parcialmente excluídas nomes, não são traduzidos em proteínas. Falha no vermelho irregular, os segmentos de fibra COX-negativos.
Dados da imagem 2. 
Fig. 7. Músculo esquelético; cachorro. Micrografia eletrônica. Ab- mitocôndrias normais e grandes nas posições subsarcolêmicas e perto do núcleo. Barra 5 2,5 mm. Fig. 8. Micrografia eletrônica. Músculo esquelético; cachorro. Um gi- mitocôndria em forma de taco de golfe. Barra 5 6 mm. ← Fig. 9. Micrografia eletrônica. Músculo esquelético; cachorro. Mitocôndrias inchadas com cavitação da matriz e dis- ruptura da crista. Barra 5 8 mm.
Foi atribuído à falta de genes tRNA indispensáveis eliminado pelas deleções ou depleções de tipos selvagens mtDNA ou interferência na expressão de quase-normais níveis de mtDNA de tipo selvagem por uma superabundância de moléculas anormalmente curtas.8 As fibras musculares COX-negativas superaram o RRF, determinando uma distribuição mais ampla de mitocôndrias do que era esperado com base na frequência do RRF. Essa constatação foi confirmada em nosso caso por ultra- exame estrutural, que mostrou grande número de mitocôndrias musculares estruturalmente anormais. Ultra- mudanças estruturais nas mitocôndrias são inespecíficas e não estão correlacionados com o tipo de mutação do mtDNA, o local bloqueio da cadeia respiratória ou fenótipo clínico. (6). Entretanto, o exame microscópico eletrônico de espécimes de biópsia muscular é um método útil de triagem para selecionar amostras para análises bioquímicas adicionais e para confirmar o diagnóstico microscópico da luz.
Referências: 
1 Batty Q, Engel AG: Reações básicas do músculo em My- ology, 2a ed., vol. 1, cap. 35, pp. 832–888. McGraw- Hill, Nova Iorque, NY, 1994 2 Breitschwerdt EB, Kornegay JN, Wheeler SJ, Stenens JB, Baty CJ: Fraqueza episódica associada ao exercício acidose láctica internacional e miopatia no inglês antigo companheiros de ninhada de cães pastores. J Am Vet Med Assoc. 201 (5): 731– 736, 1992 3 De Vivo DC: O espectro clínico em expansão de doença condrial. Brain Dev 15: 1–22, 1993 4 Di Mauro S, Moraes C: Encefalomiopatia mitocondrial thies. Arch Neurol 50: 1197–1208, 1993 5 Ghadially NF, ed .: Patologia Ultraestrutural da Célula e Matrix, 4a ed., vol. 1, pp. 195–327. Butterworths- Heinemann, Boston, MA, 1997 6 Houlton JEF, Herrtage ME: Miopatia mitocondrial em o spaniel de Sussex. Vet Rec 106: 206, 1980 7 Moraes C, Shanske S, Tritschler HJ, et al: MtDNA conclusão com expressão variável: uma nova anormalidade genética doença na doença mitocondrial. Am J Hum Genet 48: 492–501, 1991 8 Morgan-Hughes JA: Doença mitocondrial em miologia, 2a ed., Vol. 2, cap. 62, pp. 1610–1660. McGraw-Hill, Nova York, NY, 1994 9 Olby NJ, Chan KK, Targett MP, Houlton JEF: Suspeita miopatia mitocondrial em um terrier de Jack Russell. J Small Anim Pract 38: 213-216, 1997 10 Spiro AJ, Prineas JW, Moore CL: Uma nova mitocondrial miopatia em um paciente com desejo de sal. Arch Neurol 22: 259, 1970 11 Vijayasarathy C, Giger U, Prociuk U, Patterson DF, Breitschwerdt EB, Avadhani NG: Canino mitocondrial miopatia associada a mRNA mitocondrial reduzido e atividade do citocromo c oxidase alterada em fibroblastos e músculo esquelético. Comp Biochem Physiol A Physiol 106 (4): 887-894, 1994 12 Vladutiu GD, Heffner RR: Succinato desidrogenase avaliação qualitativa e quantitativa em mus- cle. Arch Pathol Lab Med 124: 1755–1758, 2000 13 Zeviani M, Bertagnolio B, Uziel G: presença neurológica de doenças mitocondriais. J Herdar Metab Dis 19: 504-520, 1996. 
Parte 02.
A neuropatia ataxia sensorial em cães Golden Retriever, é causada por uma exclusão no gene mitocondrial tRNATyr.
Izabella Baranowska1, Karin HultinJaëderlund2,3, Inger Nennesmo4Erik Holmqvist5, Nadja Heidrich5,Nils-Goë correu Larsson4, Goë correu Andersson1E. Gerhart H. Wagner5, A˚ ke Hedhammar2Rolf Wibom4, LeifAndersson1,6 *1 Departamento de Melhoramento Animal e Genética, Universidade Sueca de Ciências Agrícolas, Uppsala, Suécia, 2 Departamento de Ciências Clínicas, Universidade Sueca de Ciências Agrícolas, Uppsala, Suécia, 3 Departamento de Ciências Clínicas de Animais de Companhia, Escola Norueguesa de Ciência Veterinária, Oslo, Noruega, 4 Departamento de Laboratório de Medicina, Karolinska Institutet, Estocolmo, Suécia, 5 Departamento de Biologia Celular e Molecular, Universidade de Uppsala, Uppsala, Suécia, 6 Departamento de Bioquímica Médica e Microbiologia, Universidade de Uppsala, Uppsala, Suécia Abstrato.
 A neuropatia ataxia sensorial (SAN) é um distúrbio neurológico recentemente identificado em Golden Retrievers. Análise de linhagem revelou que todos os cães afetados pertencem a uma linhagem materna e uma análise estatística mostrou que o distúrbio tem uma origem mitocondrial. Uma deleção de um par de bases no gene mitocondrial tRNATyr foi identificada na posição 5304 nos cães após re-sequenciar o genoma mitocondrial completo de sete indivíduos. A exclusão não foi encontrada entre cães representando 18 raças diferentes ou em seis lobos, descartando isso como um polimorfismo comum. A mutação pode ser remonta a um ancestral comum de todos os cães afetados que viveram na década de 1970. Utilizamos um oligonucleotídeo quantitativo ensaio de ligação para estabelecer o grau de heteroplasmia em amostras de sangue e tecido de cães e controles afetados. Os cães afetados e seus parentes do primeiro ao quarto grau tiveram de 0 a 11% de sequência do tipo selvagem (peso), enquanto os parentes mais distantes variou entre 5% e 60% em peso e todos os Golden Retrievers não relacionados tinham 100% em peso. Northern blotA análise mostrou que o tRNATyr apresentava um nível de estado de equilíbrio 10 vezes menor nos cães afetados, em comparação com os controles. Quatro de cinco cães afetados apresentaram diminuição das taxas de produção de ATP mitocondrial e atividades enzimáticas da cadeia respiratória com alterações morfológicas no tecido muscular, semelhantes às alterações relatadas na patologia mitocondrial humana. No total, esses resultados fornecem evidências conclusivas de que a exclusão no gene tRNATyr mitocondrial é o causador mutação para SAN. Citação: Baranowska I, Jaëderlund KH, Nennesmo I, Holmqvist E, Heidrich N, et al. (2009) A neuropatia sensorial atáxica em cães Golden Retrievers é causada por um Deleção no gene mitocondrial tRNATyr. PLoS Genet 5 (5): e1000499. Doi: 10.1371 / journal. Pgen.1000499Editor: Michel Georges, Universidade de Lie`ge, BélgicaRecebido em 23 de fevereiro de 2009; aceito em 30 de abril de 2009; publicado 29 de maio de 2009Direitos autorais: 2009 Baranowska et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Creative Commons Attribution License, que permite uso, distribuição e reprodução irrestritos em qualquer meio, desde que o autor e a fonte originais sejam creditados. Financiamento: Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Sueca para Pesquisa Estratégica, Conselho Sueco de Pesquisa para o Meio Ambiente, Agricultura Ciências e Planejamento Espacial, Agria Insurance Company, Suécia, Fundos do Karolinska Institutet, Clube Golden Retriever da Suécia e Suécia Kennel Club. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise dos dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito Interesses concorrentes: Os autores declararam que não existem interesses concorrentes. 
Introdução:
A neuropatia atáxica sensorial (SAN) é uma doença recentemente identificada desordem neurológica em golden Retrievers [1]. SAN tem um início insidioso durante a infância, seguido de progressão lenta. Machos e fêmeas são afetados em frequências semelhantes. Afetados cães são atáxicos, apresentam déficits de reação postural e redução ou reflexos espinhais ausentes. Eles não têm atrofia muscular pronunciada, e os cães não parecem sentir dor. Eletrofisiológico O exame revelou que eles reduziram as velocidades de condução de impulsos nervosos nos nervos sensoriais. Exame patológico indicaram alterações degenerativas tanto na região central quanto na periférica sistema nervoso. Aproximadamente cinquenta por cento dos cães afetados foram sacrificados antes dos três anos de idade. Uma preliminar. O exame dos dados de linhagem mostrou que todos os cães afetados poderiam remontam a uma mulher do lado materno que vivia no1970, sugerindo que a SAN poderia ser causada por uma mutação no genoma mitocondrial (mtDNA). Distúrbios mitocondriais, causados por mutações na mãe mtDNA herdado, são um grupo de doenças heterogêneas em humanos. Mais de 250 mutações pontuais patogênicas, bem como rearranjos de pequena e grande escala do mtDNA foram identificados [2] e com incidência estimada em aproximadamente 1em 8000.
assim, é determinado por uma interação complexa entre o mtDNA(níveis e distribuição de mutações) e a genética nuclear fundo. Um exemplo bem conhecido da interação entre mtDNA mutado e genes nucleares é a óptica hereditária de Leberneuropatia (LHON), onde a penetração reduzida dão fenótipo é influenciado por loci nucleares [7]. Dois terços das mutações do mtDNA causadoras de doenças ocorrem no tRNA genes, que constituem apenas aproximadamente 9% do genoma mitocondrial. Isso sugere que os genes de tRNA são "hotspots" para mutação mitocondrial [8,9]. Estudos experimentais no mouse apoia esta ideia e mostrou que as mutações do gene tRNA são é muito mais provável que seja transmitida maternalmente do que mutações em genes codificadores de proteínas [10]. As mutações do tRNA são tipicamente heteroplasmático e afetam a tradução mitocondrial, causando expressão reduzida de todas as proteínas codificadas por mtDNA. Contudo, tradução prejudicada e deficiência da cadeia respiratória ocorrerá apenas se o nível de mtDNA mutado exceder um certo limite. Estão disponíveis vários modelos animais que imitam a patologia estado de distúrbios mitocondriais em humanos [11,12]. Muito poucos eles, no entanto, se assemelham a uma situação natural que permite a herança de uma única mutação do tRNA a ser estudada em várias gerações. Mostramos aqui que a SAN nos golden Retrievers é causada por uma mutação no gene mitocondrial tRNATyr. Graças a um registro de reprodução detalhado, conseguimos rastrear a mutação mais de 10 gerações no tempo. Resultados Análise de Pedigree e Re-Sequencia. A análise genealógica dos 25 cães afetados revelou que todos eles pertencem à mesma linhagem materna e podem ser rastreados até uma fêmea X que viveu na década de 1970 (Figura 1). Para testar se esses dados excluem uma possível herança nuclear, calculamos a prevalência da doença na prole de todos os machos e fêmeas em ninhadas onde as mães dos cães afetados eram uma das irmãs. Se o fator de risco estava presente no genoma nuclear, a proporção de progênie afetada deve ser aproximadamente os mesmos pais masculinos e femininos nesta linhagem materna. Por outro lado, todos casos devem derivar de pais do sexo feminino se o fator de risco for codificado no genoma do mtDNA. Observamos 25 cães afetados entre 272 descendentes de cadelas, mas não cães afetados.
177 descendentes gerados por machos (P, 1026; Teste exato de Fisher). Este fornece evidências conclusivas de que a SAN mostra mitocondrial transmissão. Sequenciamos novamente o genoma mitocondrial completo de sete cães: quatro Golden Retrievers (Grs.) Afetados, um parente próximo e dois Grs. não relacionados. Uma exclusão de um par de bases foi identificada em posição 5304 em tRNATyr dos cães afetados e de seus familiares (Figura 2A). Esta foi a única variante de sequência que foi exclusivamente associado à doença. Esta variante não foi encontrada em nenhuma outra raça de cães e esta posição no mtDNA é altamente conservada entre vertebrados. Avaliação da heteroplasmia. Foram avaliadosdois métodos diferentes, piro sequenciamento e ensaio quantitativo de ligação oligonucleotídica (qOLA), para quantificar a nível de heteroplasmia da deleção no gene tRNATyr (Texto S1; Figura S1). O método qOLA forneceu resolução superior e foi, portanto, aplicado (Figura 2B). Tivemos acesso a amostras de sangue de 20 dos 25 golden Retrievers afetados e de 13 primeiro, parentes de segundo, terceiro ou quarto grau que não apresentavam afenótipo clínico da doença. Parentes adicionais mais distantes (n = 8) descendentes da fêmea Z também foram analisados (Figura 1). 
Fomos incapaz de coletar amostras de sangue localizadas mais para trás do que para fêmea porque esses cães estão mortos ou o registro está incompleto. Também pesquisamos a exclusão em 71 indivíduos saudáveis. Golden Retrievers não relacionados, em 86 cães representando 18 outras raças e em seis lobos. Todos os cães não relacionados tiveram sequência de 100% em peso, enquanto entre os parentes distantes (remontando ao Z feminino, mas não ao X feminino; Figura 1) observamos uma grande variação na carga de mutação, variando de 5 a 60% em peso, indicando que a fêmea X que inicialmente assumiu ser o fundador não era de fato. O indivíduo afetado teve um nível muito baixo de sequência em peso (0-11,2%). Baixos níveis de peso. Também foram encontradas sequências entre parentes próximos clinicamente saudáveis, e a proporção da sequência% em peso sobreposta entre os dois grupos (Figura 2B). Não houve forte correlação entre o grau de heteroplasmia e grau de parentesco entre os parentes. Assim, este teste muito sensível não teve ambiguidade distinguir indivíduos afetados de seus parentes próximos que mostraram sem sinais clínicos da doença quando analisados no sangue. Também analisamos o grau de heteroplasmia em diferentes tecidos de três cães afetados. O lobo frontal, medula espinhal com dorso gânglios radiculares (7º torácico e 5º lombar), nervo óptico, recorrente nervo laríngeo, pâncreas, glândula tireoide e músculo esquelético de os membros pélvicos e torácicos foram analisados pelo qOLA. Os resultados revelaram que todos os tecidos analisados apresentaram maior carga de mutação, a 0% em peso, comparado com o encontrado em células sanguíneas dos mesmos indivíduos afetados. Infelizmente, não temos acesso a tecidos de parentes clinicamente saudáveis com um nível igualmente alto carga de mutação como a encontrada nos cães afetados. Análise de Northern Blot. Os níveis de estado estacionário de três espécies de tRNAs de mtDNA foram avaliados por análise de Northern Blot. Análise de RNAt extraídos do músculo tecido de três cães afetados pela SAN e dois controles, um Dachshund, um golden Retrievers saudável, mostraram que todos os três afetados pela SAN cães tiveram níveis significativamente reduzidos de tRNATyr em comparação com os dois controles (Figura 2C); a intensidade da hibridação foi em média cerca de 10 vezes menor do que nos controles (P, 0,001 no teste t de um aluno).Por outro lado, todos os cães afetados apresentaram expressão normal de tRNACyse tRNAGln comparado com os controles (Figura 2C).Sondagem da estrutura O peso transcrito in vitro e o tRNATyr mutante foram marcados radioativamente na extremidade 59 e submetido à digestão parcial usando o chumbo (Pb2 +). 
Figura 1. Uma linhagem esquemática de Golden Retrievers afetados pela neuropatia ataxia sensorial (SAN) e seus familiares. No total, tivemos acesso a amostras de sangue de 20 dos 25 cães afetados (marcados em vermelho ou preto) que podem ser rastreados no lado materno até a fêmea X. Também tivemos acesso a amostras de 13 parentes de primeiro, segundo, terceiro ou quarto grau de cães afetados (marcados em amarelo). Parentes mais distantes descendentes das fêmeas Y ou Z são marcadas com verde. Somente ninhadas com cães afetados e ninhadas incluídas na amostra estão incluídas.
Figura 2. Caracterização da deleção DT5304 no gene tRNATyr. (A) A mutação excluiu o A do par de bases mais interno do TYC, como indicado na estrutura da folha de trevo de tRNATyr. (B) um ensaio quantitativo de ligação de oligonucleotídeos (qOLA) foi usado para estimar a relação entre moléculas do tipo selvagem e mutantes em amostras de sangue de Golden Retrievers. W representa 71 cães golden Retrievers independentes que todos mostram100% em peso de moléculas. As barras verdes representam o grau de heteroplasmia de parentes distantes (34,8 (22,0); média (DP)), as barras amarelas representam parentes (5,1 (2,8)) e as barras vermelhas representam cães afetados (4,9 (3,5)). (C) Análises de Northern blot usando sondas para mt tRNATyr, mt tRNACys e mttRNAGln e RNA de três golden Retrievers afetados por SAN e dois cães não afetados; um Dachshund (Controle 1) e um Golden Retriever (Controle2) Os valores dados na parte inferior das transferências para mt tRNATyr e mt tRNACys é a intensidade de hibridação relativa normalizada usando a hibridação intensidade para mt tRNAGln. A amostra com a maior intensidade de hibridação normalizada recebeu o valor 1,00.
com glutamato + succinato, não foi significativamente reduzido. Medição das atividades de diferentes cadeias respiratórias complexos enzimáticos mostraram atividades diminuídas do complexo I (263%), complexo I-III (253%) e complexo IV (259%) nos cães afetados em comparação com controles saudáveis (Figura 3B; Tabela S1). As duas medidas envolvendo o Complexo II não mostrar atividades significativamente alteradas. Medições da enzima atividades dos complexos da cadeia respiratória e produção de ATP dessa forma, deu resultados consistentes indicando disfunção de complexo, I e IV, que dependem de subunidades codificadas por DNA mitocondrial por sua função. A função 
o complexo, II depende apenas de genes nucleares e era normal. Houve elevação da atividade da citrato sintase no tecido muscular (+ 47%)
(Figura 3B) consistente com uma proliferação mitocondrial frequentemente observado em tecidos deficientes da cadeia respiratória. Um dos cinco animais afetados que contribuíram para os dados apresentados na Figura 3 não mostraram reduções no ATP produção nem nas atividades enzimáticas da cadeia respiratória, e foi, portanto, não é possível distinguir dos controles saudáveis comesses ensaios. Histoquímica e Microscopia Eletrônica de Fibras Musculares. A coloração com hematoxilina-eosina mostrou morfologia normal para todas biópsias examinadas. Para as enzimas oxidativas, as reações foram mais uniformes e compacto sobre a superfície cortada das fibras por quatro dos cães afetados e em um cão saudável controle (Tabela S1).
Figura 3. Produção de ATP mitocondrial e atividade enzimática da cadeia respiratória. Análises bioquímicas da função da cadeia respiratória em animais afetados (barras cheias) e controle (barras abertas). As barras representam os níveis médios 6SEM. n = 5 em ambos os grupos. *, P, 0,05; **, P, 0,01. (A) Mitocondrial Taxa de produção de ATP na presença das combinações de substrato glutamato + succinato, TMPD + ascorbato, piruvato + malato, palmitoil-Lcarnitina + malato e succinato + rotenona, que entram na cadeia respiratória em diferentes pontos. (B) Atividades relativas da citrato sintase (SC) no músculo, enzimas teciduais e da cadeia respiratória em mitocôndrias isoladas. Coenzima NADH Q redutase (NQR), correspondente ao complexo I; Citocromo NADH credutase (NCR), complexo I-III; succinato desidrogenase (SDH), complexo II; succinato de citocromo c redutase (SCR), complexo II-III; citocromo coxidase (COX), complexo IV. As atividades enzimáticas relativas apresentadas como 100% na figura correspondem aos seguintes valores absolutos: CS 61 mmol /min / kg de músculo, NQR 0,13, NCR 1,4, SDH 0,36, SCR 0,76 e COX 2,8 unidades / unidade CS. Dados brutos para cães individuais são apresentados na Tabela S1.
A reação combinada para succinato desidrogenase (SDH) ecitocromo oxidase (COX) também mostraram coloração azulada comparado com os controles e o número de cães afetados. 3 (Figuras 4A e B). As fibras que mostram total falta de atividade do citocromo oxidase foramnão detectado. A microscopia eletrônica revelou apenas sinais claros de mitocondrial patologia de um dos cães (cão afetado nº 3), que à luz microscopia, no entanto, não mostrou a coloração azulada na reação SDH / COX combinada. Inclusões para cristalinas foram presente em algumas das fibras deste cão (Figuras 4C e D).
Discussão:
A análise de linhagem forneceu evidências conclusivas de que a SAN é um distúrbio herdado pela mãe. Sequenciamento completo. O mtDNA revelou uma deleção de um par de bases no gene mt tRNATyr, em uma região que é conservada entre espécies de mamíferos. A qOLAO ensaio da proporção de mtDNA mutante e selvagem mostrou que os diferentes grupos de cães carregam diferentes cargas de mutação, no entanto, a carga de mutação no sangue de cães afetados e seus parentes próximos se sobrepõem. A falta de uma correlação perfeita entre nossa estimativa de heteroplasmia e o fenótipo clínico é mais provavelmente devido, ao fato, de a doença se manifestar no SNC enquanto medimos a carga de mutação nas células sanguíneas. Está bem se sabe que o fundo genético nuclear pode afetar a penetração de mutações patogênicas do mtDNA, portanto, pode não se deve excluir que polimorfismos nucleares, bem como fatores ambientais não identificados podem contribuir para o risco de manifestação da doença. Parentes mais distantes (remontando às mulheres Y e Z) mostraram uma maior variação na carga de mutação e uma fração mais alta do tipo selvagem cópia comparada a cães rastreados até a fêmea X (Figura 2B). Que a doença só ocorreu no ramo da linhagem coma maior proporção da exclusão de um par de bases no tRNATyr sustenta que esta é a mutação causadora. A análise de Northern blot demonstrou níveis mais baixos de tRNATyr no tecido muscular de cães afetados, em comparação com saudáveis controles. Isso pode ser explicado por um defeito de processamento prejudicar a formação do tRNATyr maduro ou por um aumento, rotatividade do mutante tRNATyr. Podemos refutar a opção anterior. Em primeiro lugar, as manchas do norte com sondas que detectam tRNATyr não mostraram RNAs adicionais de alto massa molecular, indicativos de berrante.
Figura 4. Histoquímica e microscopia eletrônica de fibras musculares de cães afetados por SAN (B, C e D) e de controle (A). (A e B). Histoquímica mostrando a reação combinada para SDH e COX. Observe a reação azulada do cão afetado, indicando falta de atividade da COX. Barra = 200 mm. (C e D) Microscopia eletrônica mostrando inclusões para cristalinas em um caso. Barra = 0,5 mm
Em processamento. 
Em segundo lugar, tRNATyr e tRNACys são transcritos como um precursor policistrônico e um defeito de processamento devem afetar tanto moléculas. O fato que o nível de estado estacionário dos tRNACys parece não afetado argumenta fortemente contra um processamento aberrante. Portanto, nossos dados indicam que a exclusão prejudica a estabilidade do tRNATyr mutado. Embora os animais afetados não mostrassem nenhuma evidência óbvia sinais clínicos no músculo, um músculo mitocondrial severamente afetado. A função foi observada na maioria dos indivíduos examinados. As diminuições na produção de ATP mitocondrial e nas atividades da cadeia respiratória do complexo I e IV são todos achado consistente com as alterações encontradas em humanos e camundongos afetados por distúrbios do mtDNA [11,13–15]. O aumento da atividade da citrato sintase é frequentemente observado em distúrbios mitocondriais e acredita-se que refletem a proliferação mitocondrial em resposta ao deficit de energia e no tecido doente [12,15]. Um dos cães afetados teve quase enzimas normais da cadeia respiratória, possivelmente devido a distribuição de tecido em mosaico da heteroplasmia [16]. A função mitocondrial do músculo perturbado foi acompanhada por um padrão divergente na coloração histoquímica combinada paracitocromo com oxidase (COX) e succinato desidrogenase (SDH). Os animais afetados mostraram uma coloração azulada, indicando uma mudança para uma atividade COX mais baixa em comparação com a atividade SDH. Fibras totalmente desprovidas de atividade COX e fibras vermelhas irregulares são descobertas comuns em humanos que abrigam deleções em grande escala e mutações de tRNA no mtDNA [13,14,17]. Surpreendentemente, essas fibras não foram encontradas em amostras musculares dos cães. Uma possível explicação para esta observação e, o fato de que, as SAN afetadas cães não apresentavam sinais clínicos evidentes de doença muscular, a composição muscular diferente em cães, com maior densidade mitocondrial em comparação com humanos [18]. Apesar da falta de fibras vermelhas irregulares, inclusões para cristalinas mitocondriais encontrado em um dos animais, achado característico em humanos miopatias mitocondriais de adultos [17]. Desde que os cães foram sacrificados antes de adquirirem risco clínico de morte sinais, a patologia da fase final da doença é desconhecida. De acordo com DiMauro e Davidzon (2005) [19], um estudo mitocondrial é provável que a mutação seja patogênica se 1) a mutação não estiver presente em indivíduos normais saudáveis, 2) altera evolutivamente local conservado, 3) a mutação causa uma enzima da cadeia respiratória deficiência nos tecidos afetados ou defeitos na proteína mitocondrial síntese e respiração demonstráveis em linhagens de células híbridas e 4) uma correlação entre heteroplasmia e fenótipo clínico é observado. A exclusão relatada neste estudo atende a todos os critérios listados acima, exceto o primeiro, como observamos clinicamente parentes próximos saudáveis e com alta carga de mutação. No entanto, alguns casos excepcionais de mutações patogênicas que são homoplasmáticas humanos não afetados também foram relatados [6,20]. Além disso, todos os casos no presente ocorreram na parte do pedigree com a maior carga de mutação e todos os cães não relacionados foram 100%. 
Tipo selvagem para a posição 5304 em tRNATyr. Assim, este estudo tem forneceu evidências conclusivas de que a SAN é um distúrbio mitocondrial e que o DT5304 no tRNATyr é a mutação causadora. Este é o segundo relatório de um distúrbio do mtDNA em cães. Em um estudo anterior, Li et al. (2006) identificaram uma mutação no gene do citocromo b mitocondrial associado à encefalomielopatia em famílias de cães pastor de Shetland e australianacães de gado [21]. Outros estudos que relatam suspeita de mitocondriais distúrbios em cães (isto é, miopatias ou encefalopatias mitocondriais) são baseados em um ou poucos casos e estão restritos a aspectos clínicos, patológicos e bioquímicos dos distúrbios, portanto não incluindo sequenciamento completo ou parcial do mtDNA para identificar a mutação causadora de doença [22–24]. Nos seres humanos, mutações no gene tRNATyr mitocondrial têm foi associado a distúrbios mitocondriais [25–28]. Estes casos envolvem mutações em outras posições (A5843G, A5874G, G5877ADT5885) que o associado à SAN em cães (DT5304), que corresponde à posição 5848 em humanos. Sahashi et al. [25]e Raffelsberger et al. [26] descreveram duas pacientes do sexo feminino com CPEO (oftalmoplegia externa progressiva crônica) com idade de aos 28 e 41 anos de idade e intolerância ao exercício, enquanto Scaglia et al. [27] relataram uma paciente do sexo feminino com doença mitocondrial citopatia progredindo para glomerulosclerose segmentar focal e cardiomiopatia. Sinais clínicos semelhantes não foram observados em Golden Retrievers relatados neste estudo. Este estudo documenta um dos mais extensos pedigrees comuns distúrbio do mtDNA em qualquer espécie. Identificamos 25 cães afetados rastreou a mutação pelo menos até a fêmea Z (Figura 1), nascida em 1971. Foi transmitido silenciosamente desde então, e o primeiro. O caso de um cão afetado identificado por nós nasceu em 1997. Com base em informações do studbook estimamos que cerca de 5% das cadelas na população sueca de golden Retrievers nascida2001-2005 carregam essa mutação. A prevalência em outros países é atualmente desconhecida porque não conseguimos rastrear a mutação mais para trás do que para a fêmea Z. Omais interessante. O aspecto deste estudo é o efeito fenotípico leve da mutação que permite cargas de mutação muito altas (até quase 0% de sequência do tipo selvagem nas células sanguíneas) em indivíduos clinicamente saudáveis. Isto constitui, portanto, um modelo interessante para o mtDNA humano distúrbios que podem ser usados para testar abordagens terapêuticas para tratamento de distúrbios mitocondriais. Materiais e métodos Tecidos de Animais Amostras de sangue e tecido foram coletadas de cães de propriedade privada com o consentimento por escrito dos proprietários. O DNA extraído (QIAamp DNAMini Kit de Sangue, Qiagen, Valencia, CA) foi mantida a 220uC até foi usado. Amostras de tecido foram coletadas em conjunto imediato com eutanásia, no Instituto Nacional de Veterinária da Suécia, Uppsala, na Suécia, e foram mantidos a 280uC antes do uso. Frescobiópsias musculares para estudos funcionais, microscopia eletrônica e histopatologia foram coletadas de m. quadríceps vasto medial de cinco cães afetados (1-5 anos de idade) e cinco grupos de controle de acordo com a idade cães sob sedação e anestesia local. O estudo foi aprovado por Comitê de Ética Animal de Uppsala. Análise de Pedigree.
O pedigree foi analisado utilizando informações de parentesco do registro do sueco Kennel Club (www.skk.se).Sequenciamento de mtDNA. O genoma mitocondrial completo foi sequenciado novamente quinze amplicons sobrepostos. Todos os iniciadores de PCR gerados amplificadores variando de aproximadamente 1200 a 1500 pb e foram projetados usando o software Primer3 [29]. Os iniciadores de PCR foram reutilizados para sequenciamento, juntamente com quatro iniciadores de sequenciarão por ampliação (Tabela S2). Os contigs foram alinhados e analisado usando o Códon Codes (Dedham, MA). Completo sequências mitocondriais de quatro cães afetados (GenBankFJ817358, FJ817359, FJ817360, FJ817361), um parente próximo (FJ817362) e dois recuperadores de ouro não relacionados (FJ817363, FJ817364) foram depositados no GenBank. A numeração deposições nucleotídicas refere-se à sequência completa do mtDNA do cão com o número de acesso GenBank NC_002008.Quantificação da deleção de tRNATyr. O método quantitativo de ligação de oligonucleotídeo (qOLA) foi usado para estimar a carga de mutação em amostras de sangue e tecido, mas também para fins de avaliação. Cada amostra foi amplificada por PCR de acordo com o procedimento padrão usando os primers listados na TabelaS3 Os produtos de PCR foram tratados com proteinase K (20 ng / ul) a98uC por 1 he depois usado para uma reação de ligação contendo16Tampão de reação, 1 pmol de iniciador F, 0,5 pmol de iniciador R1,Iniciador R2 de 0,5 pmol, biotecnologias de epicentro ampligase de 1,5 U, Madison, WI) a 94uC 10 min, 10 ciclos a 94uC 30 s e 50uC1,5 min. Os produtos de ligação foram separados usando gel capilar eletroforese em um MegaBACE (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) e analisados usando o MegaBACE Fragment Profiler. Versão 1.2. Todas as amostras de sangue, exceto duas, foram analisadas em triplicados. Cães representando as seguintes 18 raças também foram analisados quanto à presença da mutação: hovawarts (n = 5), gigante Schnauzers (n = 4), Dachshunds (n = 7), pedágio da Nova Escócia Retrievers (n = 5), boxeadores (n = 5), Fox Terriers (n = 4), dálmatas(n = 4), basenjis (n = 4), cães de montanha de Berna (n = 4), fronteira Collies (n = 4), Bullterriers (n = 5), Beagles (n = 5), Sharpeis (n = 5),poodles (n = 5), Collies barbudos (n = 5), Wolfhounds irlandeses (n = 5),Pastores alemães (n = 5) e terrier branco das montanhas ocidentais(n = 5)Northern Blot. O RNA total foi extraído usando o Isolamento mirVana miRNAKit (Ambion, Austin, TX). Um mg de RNA foi desnaturado em corante de carregamento de formamida (FD; formamida a 90%, EDTA 15 mM,0,05% de azul de bromofenol, 0,05% de xileno cianol), fervido, carregado e correr com um gel de poliacrilamida desnaturante a 12,5%. Um rotulado. A escada de RNA pUC19 (Fermentas, Burlington, Canadá) foi usada como marcador de tamanho. O RNA foi eletroblotado em Nylon N +membranas (GE Healthcare) a 10 V por 15 h. A transferência foi realizada em uma câmara de Biorad blotting em tampão 16TBE a 4uC.A pré-hibridação foi realizada por 2–4 h a 60uC em 15 mltampão de pré-hibridação (56SSC, 1006Denhardt, 50 mM de sódio fosfato pH 6,7, 1% de sulfato de dextrano, 0,1% SDS) com 75 mlDNA de esperma de arenque (20 mg / ml). A hibridização foi realizada o / não a 60uC no mesmo buffer sem DNA de esperma Herring, mas contendo sonda oligonucleotídica marcada. As sondas foram rotuladas (Sonda de 40 pmol, tampão de 106 quinase, polinucleotídeo quinase T4(PNK, Ambion, Austin, TX), [c32P] ATP) a 37uC por 45 min. Antes da hibridação, a sonda marcada era executada através de um G-50coluna (GE, Healthcare, Uppsala, Suécia). Sequências de sonda são listado na Tabela S4. As membranas foram lavadas uma vez por 20 min a60uC em 26SSC, 0,5% SDS e uma vez por 20 min em 0,56SSC, SDS a 0,5%. Os sinais foram detectados e quantificados usando um Molecular Dynamics PhosphorImager modelo 400S (Sunnyvale,CA) e ImageQuant versão 4.2a. A hibridação as intensidades de tRNATyr e tRNACys foram normalizadas usando o intensidade de hibridação obtida para tRNAGln do mesmo cão.
Sondagem da estrutura Produtos amplificados por PCR de um GR afetado e um não relacionado foram clonados usando o kit TOPO TA Cloning (Invitrogen, Carlsbad, CA). O iniciador direto continha um RNA T7tag de sequência promotora da polimerase para gerar transcrição in vitromodelos (Tabela S5). Produtos de PCR validados por sequência (em peso oumutante) foram utilizados em NTPs de reação de transcrição in vitro (25 mM). Tampão 46 Trx, protetor de RNA, polimerase de RNA T7 (200 U / ml, Ambion, Austin, TX) a 37uC por 4 h. DNAQ RQ1 foi adicionado (37uC aos 30 min) para remover o molde de DNA, seguido de extração de fenol / clorofórmio e precipitação com Et OH. O RNA foi girado através de uma coluna G-50 (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) e desfosforilados (40 pmol RNA, 106 camarões tampão fosfatase alcalina [SAP] e SAP a 37uC, 1 h). Depois deum tratamento adicional com fenol / clorofórmio e precipitação, o RNA redissolvido foi marcado com 59 terminais por tratamento com polinucleotídeo-quinase (RNA de 40 pmol, tampão de 106 quinase, PNK,[c32P] ATP a 37uC por 1 h) e separados em uma desnaturação de 8%gel de poliacrilamida (PA) (1 mg de RNA / via).Após curta exposição ao filme de raios X, o gel contendo RNA as fatias foram excisadas e eluídas agitando o / n na eluição do RNA tampão (acetato de sódio 0,1 M, pH 5,6, EDTA 10 mM, SDS a 0,5%).Após a extração com fenol / clorofórmio e precipitação com Et OH, foram utilizadas alíquotas de um ml dos RNAs redissolvidos (em peso e mutantes)para a preparação de escadas alcalinas (escada OH), escada T1,Controle (não tratado) ou para digestão parcial sob condições nativas condições por RNase T1 (0,01 U, Ambion, Austin, TX) ou Pb2 +(25 mM) de acordo com a Tabela S6. Reações e etapas subsequentes foram realizados conforme descrito [30]. As amostras de RNA foram realizadas em um gel de PA a 12% (40 W, 1,5 h), seguido de transferência para um papel de filtro, seco a vácuo (secador de gel de laje SGD5040, Artisan Scientific, Champaign, IL) e analisado por PhosphorImager como acima. Taxa de Produção de ATP Mitocondrial e Respiratório Atividade enzimática em cadeia as mitocôndrias foram isoladas do tecido muscular fresco e atividades enzimáticas da cadeia respiratória e ATP mitocondrial taxas de produção (MAPR) foram determinadas às cegas, conforme descrito[31] Atividade da citrato sintase no tecido muscular e em isolados as mitocôndrias foram determinadas de acordo com o mesmo artigo. Histoquímica, Microscopia Eletrônica e de Luz as biópsias musculares foram rapidamente congeladas em 2-metilbutano / gelo. Oito mm de espessura foram coradas com hematoxilina-eosina e tricromromo de Gomori, bem como para enzimas oxidativas (NADH tetrazólio redutase, succinato desidrogenase, citocromooxidase e a reação combinada para succinatodesidrogenasee citocromo oxidase). Pares de biópsias (um caso e um controle) foram corados na mesma ocasião. As amostras musculares foram também fixadas em glutaraldeído a 2,5% para microscopia eletrônica. Informações de Apoio Figura S1 Avaliação dos métodos de quantificação: pirosequenciamento e ensaio quantitativo de ligação de oligonucleotídeos (qOLA). (UMA) Pirosequenciamento de grandes séries de diluição. (B) Pirosequenciamento de série de diluição estreita. (C) qOLA de ampla série de diluições. (D) qOLA, de ampla série de diluições. Comparando os extremos opostos (0 e100%) das séries de diluição das Fig. S1 A e C, é evidente que O qOLA fornece uma estimativa mais precisa desses valores. Isto é confirmado ainda pela comparação das figuras S1B e D, onde linearidade é óbvia em D, mas não em B. Encontrado em: doi: 10.1371 / journal. Pgen. 1000499.s001 (0,25 MB TIF) figura S2 Sondagem da estrutura de tRNATyr. A transferência RNATyr estava em transcrito in vitro, marcado e clivado com RNase T1 ou Pb2 +. Por comparando faixas de peso e mutante, não há alteração óbvia na estrutura do mutante tRNATyr. Encontrado em: doi: 10.1371 / journal. Pgen. 1000499.s002 (4.46 MB TIF) Tabela S1 Visão geral da heteroplasmia no sangue e músculo, e exame morfológico e bioquímico nos cinco pares de cães testado. Encontrado em: doi: 10.1371 / journal. Pgen. 1000499.s003 (0,05 MBDOC) Tabela S2 PCR e iniciadores de sequenciação. Encontrado em: doi: 10.1371 / journal. Pgen. 1000499.s004 (0,10 MBDOC) Tabela S3 Primários de quantificação. Encontrado em: doi: 10.1371 / journal. Pgen. 1000499.s005 (0,03 MBDOC) Tabela S4 Sondas do Norte. Encontrado em: doi: 10.1371 / journal. Pgen. 1000499.s006 (0.02 MBDOC) Tabela S5 Sequências de sondagem de estrutura. Encontrado em: doi: 10.1371 / journal. Pgen. 1000499.s007 (0.03 MB TIF) Tabela S6 Preparação da escada OH, escada T1, controle, T1(0,01 U), Pb2 + (25 mM). Encontrado em: doi: 10.1371 / journal. Pgen. 1000499.s008 (0.04 MBDOC) Texto S1 Avaliação dos métodos de quantificação – pirosequenciação e ensaio quantitativo de ligação de oligonucleotídeo. Encontrado em: doi: 10.1371 / jornal. Pgen. 1000499.s009 (0.02 MBDOC) Agradecimentos Agradecemos a Ulla Gustafson e Vahid Edrisi pela assistência técnica, Dr. Ema Kikovska pela assistência no projeto de primer na sondagem de estruturas experimento, e Kjell Hultenby pela assistência eletronicroscópica. Nós agradecer ao Prof. Leis Kirse bom por aconselhamento sobre a estrutura experimento, a equipe do Instituto Nacional de Veterinária (Uppsala, pela ajuda excelente com post mortems, a Dra. Eva Oërind e equipe técnica da Clínica Universitária (Universidade Sueca de Agricultura Science, Suécia) por excelente assistência na amostragem de biópsias musculares, e todos os donos de cães, criadores e veterinários que contribuíram com informações e amostras. Contribuições do autor concebeu e projetou os experimentos: IB KHJ RW LA. Realizou os experimentos: IB KHJ EM EH NH RW. Analisou os dados: IB KHJ IN RWLA. Reagentes contribuídos / materiais / ferramentas de análise: GA EGHW A˚ H RWLA. Escreveu o artigo: IB IN RW LA. Contribuiu para a preparação do Artigo: KHJ, EH, NH, NGL, GA, EGHW, AA.
Referências1. Jaëderlund KH, Oëindind E, Johnsson E, Matiasek K, Hahn CN, et al. (2007) Aneurológica em Golden Retrievers apresentando-se como atáxico sensorial neuropatia. J Vet Intern Med 21: 1307–1315.2. Greaves LC, Taylor RW (2006) Mutações no DNA Mitchondrial em doenças humanas. IUBMB Life 58: 143–151.3. Chinnery PF, Johnson MA, Wardell TM, Singh-Kler R, Hayes C, et al. (2000) A epidemiologia das mutações patogênicas no DNA mitocondrial. Ann Neurol 48:188-193.4. DiMauro S, Schon EA (2003) Doenças da cadeia respiratória mitocondrial.N Engl J Med 348: 2656–2668.
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