Tubos Múltiplos Análises de coliformes

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COLÉGIO AGRÍCOLA DOM AGOSTINHO IKAS
Tubos Múltiplos 
Análises de coliformes
Relatório referente à disciplina de microbiologia básica.
Na turma de alimentos-manhã, 2º Período.
 
Aluno: José Gilberto
Orientação: Aurenice Pontes Loio Vaz
CODAI / UFRPE
2019
Análises de coliformes por tubos múltiplos
INTRODUÇÃO
A técnica de tubos múltiplos é a mais tradicional para a análise de coliformes. A metodologia permite a identificação por “número mais provável” (NMP) de microrganismos, onde o objetivo do relatório é identificar a presença de coliformes no hambúrguer.
MATERIAL
Almofariz e Pistilo
Tubos de ensaio e estantes 
Pipetador automático e ponteiras
Erlenmeyer
Balança
Espátula
Alça de Níquel
Lamparina
Tubos Durhan 
Placa de Petri
PROCEDIMENTO (MÉTODOS)
Homogeneização da amostra
Com ajuda do almofariz e pistilo foi homogeneizado 25g do hambúrguer para ser diluído.
Pesagem da amostra: 25g
Na balança com o erlenmeyer em solução salina foram adicionadas as 25 g do hambúrguer.
Diluições
As gramas homogeneizadas foram colocadas na solução diluída em 10 vezes, e consequentemente diluídas em 100 e 1000 em tubos de ensaios com ajuda do pipetador automático.
Etapas
Para a avaliação dos coliformes utilizou-se a técnica do (NMP). Na primeira etapa, foram retirados assepticamente 25 g de amostra e preparadas três diluições sucessivas e para cada diluição foram utilizados três tubos contendo 10 mL de Caldo Lauril Sulfato de Sódio (LST) com tubos de Durhan invertidos, os quais foram posteriormente incubados em 36ºC por 24-48 horas. 
Os tubos que apresentaram formação de gás no Caldo LST, tiveram alíquotas semeadas em tubos contendo 5 mL de Caldo verde brilhante (VB) contendo tubos de Durhan invertidos para o crescimento de coliformes totais. Na segunda etapa, os tubos positivos para VB foram transferidos para tubos contendo caldo com Escherichia coli (E.C.), meio confirmatório para coliformes termotolerantes (E.C.) e deixados em banho-maria de 45ºC durante 24 horas.
Inoculação 
Após 24h os tubos que estavam na incubadora se encontravam com névoas, resíduos e gases, com a alça de níquel foi inoculado as diluições três vezes em três tubos diferentes com o caldo verde brilhante.
Inoculação na placa
Com a alça de níquel foi colocado o caldo da amostra com as diluições, na placa de Petri identificada com (-1) onde já se encontrava o meio de cultura pelo método de Spread Plate.
	 
 OBS: Função da Lamparina 
Ao trabalhar com substâncias ou solução salina é necessário usar a lamparina, pois o calor não vai permitir a replicação de microrganismos.
DISCUSSÃO
A positividade do teste foi observada pela produção de gás no interior dos tubos de
Durhan, os resultados foram analisados em tabela do Número Mais Provável (NMP). Por fim, a caracterização dos coliformes termotolerantes foi evidenciada pelo crescimento de colônias com centros enegrecidos e brilho verde metálico.
Na primeira etapa (presuntiva) a acidificação, com produção de gás, a partir da fermentação no meio de cultura, é prova presuntiva positiva para presença de bactérias do grupo coliforme.
Já na segunda fase (confirmativa) consiste na transferência de cada cultura com resultado presuntivo, sendo a incubação efetuada também a 36º C, durante 24 horas. A produção de gás a partir da fermentação neste meio é prova confirmativa positiva para a presença de bactérias do grupo coliforme. Esta etapa reduz a possibilidade de ocorrência de resultados falso-positivos, decorrentes da atividade de bactérias esporuladas e de bactérias Gram-positivas fermentadoras.
CONCLUSÃO
Avaliando os resultados da pesquisa, em relação aos valores obtidos que foram de 3 3 1, é possível concluir que todas as amostras se encontram não adequadas para o consumo humano. Contudo não houve crescimento de UFC’s de Coliformes Totais e Termotolerantes para nenhuma das amostras. A incoerência dos valores obtidos entre os fatores, temperatura de conservação a quente, quando comparado ao crescimento microbiológico, levantam suspeita a respeito do uso indevido de aditivos de conservação pela indústria produtora do hambúrguer. 
REFERÊNCIAS (BIBLIOGRÁFIA CONSULTADA)
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuária. Instrução Normativa Nº 62, de 26 de Agosto de 2003. Métodos Analíticos Oficiais para Analises Microbiológica para Controle de Produtos. Diário Oficial da União de 18/09/2003, Seção 1, Brasília – DF, 2003.