Biomedicina

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35Biomedicina na prática: 
da teoria à bancada SUMÁRIO
10. Enquanto a máquina aquece, terminar de preparar a pós adicionando a enzima na 
pós. Manter o tubo no gelo até a hora de pipetar, pois pode ocorrer a formação de 
dímeros de primers; 
11. Após a desnaturação inicial dar PAUSE no programa, abrir a máquina retirar os tubos 
colocando-os no gelo por 1 minuto;
12. Adicionar 10 µL da pós em cada tubo ( sempre trocar de ponteira );
13. Fechar os tubos e colocar novamente na máquina;
14. Apertar UNPAUSE;
15. O programa pode ficar de um dia para outro na máquina.
Observe: Cuidar para os tubos estarem bem fechados e sem bolhas, pois isso pode 
prejudicar a reação de PCR.
Programa para amplificação do gene VEGF
1- Desnaturação inicial: 94°C 5min
35 ciclos de:
2- Desnaturação: 94°C 1min
3- Anelamento: 60°C 1min
4- Extensão: 72°C 2min
5- Extensão final: 72°C 5min
6- END ou manter na máquina 10° por 24h. 
Analisar a amplificação através da técnica de eletroforese em gel de agarose a 2% 
corado com brometo de etídeo.
Responda as seguintes perguntas: 
1) Quais as aplicações da técnica de PCR para a área da saúde?
2) O que são primers? Como se obtém?
3) Por que a enzima Taq DNA polimerase é adicionada sempre por último?
4) Como se garante a especificidade da reação de PCR evitando a contaminação e 
resultados falsos positivos ou falsos negativos?
5. PRÁTICA: Eletroforese de ácidos nucleicos em gel de agarose
Uma propriedade das cargas elétricas em solução é que quando uma diferença de 
potencial é aplicada à solução - ou seja, quando os polos de uma bateria são conectados 
à solução as cargas positivas são atraídas pelo polo negativo e as cargas negativas, pelo 
polo positivo, deslocando-se em direção a eles. Os ácidos nucleicos, como são carregados 
negativamente, propriedade conferida pelo grupamento fosfato, e desta forma migram em 
direção ao polo positivo. Essa migração das cargas quando são submetidas a uma diferença 
de potencial é chamada de eletroforese. A eletroforese deve ser realizada em matrizes rígidas, 
como os géis de agarose e poliacrilamida para minimizar alterações que a solução na qual 
a corrente elétrica será aplicada poderia sofrer. O principal fator que deve ser observado na 
técnica é o tamanho do fragmento a ser analisado, pois isso interfere em sua velocidade de 
migração. Em geral, quanto maior a macromolécula, menor a sua velocidade de migração 
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da teoria à bancada SUMÁRIO
em direção ao polo de sinal oposto e vice-versa. Desta forma quanto maior o fragmento a ser 
analisado, menos concentrado deve ser o gel, pois isso limitaria sua migração. Se o fragmento 
for menor, o gel deve ser mais concentrado, pois sua velocidade de migração será maior. 
Materiais:
- Cuba de eletroforese;
- Fonte de energia;
- Suporte para gel com pente;
- Erlenmeyer ou Becker;
- Proveta;
- Pipetador automático P20;
- Ponteiras amarelas;
- Plástico-filme;
- Forno micro-ondas;
- Balança de pesagem;
- Papel alumínio;
- Tampão TBE1x;
- Brometo de etídio em solução de 2mg/mL;
- Amostra de PCR;
- Tampão de carregamento (ou de corrida);
- Marcador de peso molecular (em geral se usa de 100 pares de bases);
Preparo de TBE 10X Para 1 litro: 
- 1 litro de água destilada (Mili-Q)
- 55 g de ácido bórico; 108 g de trisbase; 9,25 g de EDTA 
Pesar os sais e dissolvê-los em parte da água (em um becker, com barrinha magnética)
O pH deve ser 8,6. Verificar com a fita de pH, que deve estar entre 8 e 9
Distribuir em duas garrafas de meio litro e autoclavar. Deixar esfriar e estocar em 
temperatura ambiente.
Obs.: se o pH não estiver entre 8 e 9, desprezar o tampão e fazê-lo novamente. 
Preparo de brometo de etídio 2 mg/mL
- 70 mg de brometo de etídio
- 35 mL de água sem DEPC
Colocar o brometo e a água em um tubo falcon de 50 mL e fechar bem. Agitar no vórtex. 
Embalar o tubo com papel alumínio e estocar em temperatura ambiente.