Ensaio digital CRISPR-assistido para detecção rápida de SARS-CoV2

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Ensaio digital CRISPR-assistido para detecção rápida de
SARS-CoV2
O primeiro ensaio digital CRISPR/Cas-assisted que pode detectar SARS-CoV2 em menos de 30
minutos.
Crédito da imagem: Testalize.me em Unsplash
A descoberta de enzimas CRISPR isoladas de bactérias não só transformou nossa capacidade de editar
o genoma e, portanto, tratar uma série de distúrbios genéticos, mas também abriu a porta para testes de
diagnóstico aprimorados.
Testes de ácido nucleico detectam informações genéticas, como DNA e RNA, e são frequentemente
usados na identificação de vírus ou bactérias. Atualmente, eles estão sendo amplamente utilizados na
detecção do vírus SARS-CoV-2 – para o qual houve uma demanda sem precedentes em resposta à
pandemia COVID-19 – com o teste de amplificação isotérmica LMAP (mediado por loop) sendo um dos
mais comuns.
Os ensaios de ácido nucleico à base de CRISPR são mais rápidos, mais confiáveis, específicos e mais
baratos em comparação, e já encontraram aplicação na detecção do vírus da dengue (DENV), do
papilomavírus humano (HPV) e do vírus Zika (ZIKV).
No entanto, sua falta de digitalização os prejudicou, diz uma equipe de cientistas liderada pelo professor
Jeff Wang, da Universidade Johns Hopkins. “Todos os ensaios baseados em CRISPR até o momento
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são realizados em tubos de reação ou poços de reação”, disse Wang. “Este formato de reação tem duas
deficiências: a carga viral em uma amostra é difícil de quantificar porque está apenas vagamente
relacionada com a intensidade do sinal, [e] as amostras com baixas cargas virais exigem mais tempo
para produzir um sinal detectável”.
A detecção digital também é uma ferramenta poderosa e confiável que melhorou os recursos de
diagnóstico de testes como PCR e LAMP, mas nenhum aprimoramento digital foi realizado para suas
contrapartes baseadas em CRISPR.
Criando um ensaio CRISPR digital e sensível
Para resolver este problema, a equipe desenvolveu um ensaio que eles chamam de deCOViD
(digitization'enhanced CRISPR/Cas-assisted one-pot detection), que é o primeiro ensaio digital CRISPR /
Cas-assisted que pode detectar SARS-CoV 2 RNA e calor-inativado SARS-CoV -2 em uma única etapa.
Os resultados foram publicados recentemente na Advanced Science.
“Nosso ensaio digital baseado em CRISPR pode contar vírus individuais em uma amostra”, disse Wang.
“Também mantém um tempo de ensaio constantemente rápido para amostras com cargas virais altas e
baixas”.
O ensaio usa sinalização fluorescente para detectar a presença ou ausência do vírus - integra a
transcrição e a amplificação do RNA viral em uma etapa e, em seguida, esses fragmentos de RNA
ativam complexos CRISPR guiados por RNA para desencadear fluorescência em amostras positivas.
“Detectar o vírus SARS-CoV-2 em uma amostra é como o problema proverbial de encontrar uma agulha
em um palheiro”, explicou Wang. “Imagine que, mesmo que a agulha possa fazer cópias de si mesma,
ainda pode levar muito tempo para fazer cópias suficientes de agulhas e se tornar visível no palheiro.
Mas se o palheiro é dividido primeiro em muitas pilhas menores e a agulha está em uma das pilhas de
feno menores, então a agulha precisa fazer menos cópias de si mesma para ser visível o suficiente nas
pilhas menores, assim, levará menos tempo para ser detectado. Usamos a mesma estratégia. Quando
dividimos nosso ensaio e vírus SARS-CoV-2 em 20000 pequenos poços, cada vírus em seu pequeno
poço pode ser detectado mais rapidamente e ao mesmo tempo que vírus em outros poços.
Para testar a viabilidade do deCOViD em testes clínicos, os pesquisadores testaram quatro amostras
obtidas de swabs nasais, que incluíram duas amostras positivas SARS-CoV-2, uma amostra negativa
SARS-CoV2 e uma amostra de gripe, e comparou-a com um ensaio convencional baseado em CRISPR
em várias etapas, eles chamaram de “sensaio de bulk”. Para confirmar os resultados, todos os testes
foram executados contra um ensaio de PCR padrão.
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202003564
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“Tanto o ensaio em massa quanto o deCOViD produziram sinais mais altos das duas amostras positivas
do que as da amostra negativa – indicando resultados de detecção bem-sucedidos que concordam com
o RT-qPCR”, escreveram os autores. “Além disso, para a amostra de gripe, tanto o ensaio em massa
quanto o deCOViD produziram sinais indistinguíveis daqueles da amostra negativa, que coincide com o
RT-qPCR, ao mesmo tempo em que ilustra a especificidade de ambos os métodos”.
Em um teste final, a equipe diluiu suas amostras nasais em duas vezes e descobriu que o vírus se
tornou indetectável para o ensaio em massa, mas foi detectado com sucesso pelo deCOViD. Isso ocorre
porque a amplificação e amostragem de RNA são realizadas em poços de reação digital, onde cada
cópia do alvo é isolada em uma concentração localmente elevada, facilitando a amplificação rápida que
é independente da concentração da amostra inicial. Isso não apenas fornece um teste mais sensível,
mas melhora o tempo de detecção.
Quando serão usados na linha de frente?
“Nosso trabalho até agora tem sido uma busca acadêmica, mas certamente estamos interessados em
comercializar nosso ensaio e contribuir para a triagem e testes em massa para o SARS-CoV-2 em um
futuro próximo”, acrescentou Wang. “Espera-se que várias melhorias na facilidade de uso possam
facilitar a comercialização do nosso trabalho, que incluem a simplificação da detecção de fluorescência
do chip digital e a automação do processo de carregamento de amostras.”
Os componentes do ensaio também podem ser otimizados para detectar o SARS-CoV-2 ainda mais
rápido e diretamente de diferentes amostras, como a saliva, continuou ele. A detecção de fluorescência
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também pode ser simplificada usando um leitor de chip comercializado que é compatível com o chip
digital ou implementando um sistema de detecção de fluorescência baseado em telefone celular.
“Como o deCOViD pode ser facilmente projetado para outros alvos de DNA ou RNA, prevemos aplicá-lo
em direção a outras doenças”, escreveu a equipe em seu artigo. “Com base nos resultados
encorajadores e no potencial de melhoria, acreditamos que a deCOViD pode abrir uma nova via para o
avanço dos ensaios de diagnóstico assistidos CRISPR/Casassisted e fornecer uma nova ferramenta
para combater a pandemia COVID-19 e além.”
Referência: Joon Soo Park, et al., Digital CRISPR/Cas-Assisted Assay for Rapid and Sensitive Detection
of SARS-CoV-2, Advanced Science (2020). DOI: advs.202003564
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https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202003564