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18/01/2023

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

MARCOS ANTONIO MARTINS DA SILVA

AVALIAÇÃO DO EFEITO DA TALIDOMIDA SOBRE OS DANOS
INTESTINAIS E HEPÁTICOS INDUZIDOS PELA INDOMETACINA EM
RATOS WISTAR

FORTALEZA
2011
MARCOS ANTONIO MARTINS DA SILVA

AVALIAÇÃO DO EFEITO DA TALIDOMIDA SOBRE OS DANOS INTESTINAIS E
HEPÁTICOS INDUZIDOS PELA INDOMETACINA EM RATOS WISTAR.

Dissertação submetida ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Médicas da
Faculdade de Medicina da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial
para obtenção do título de Mestre.

Orientadora: Profª. Drª. Geanne Matos de
Andrade

FORTALEZA-CE
2011

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências da Saúde

S582a Silva, Marcos Antonio Martins da.

Avaliação do efeito da talidomida sobre os danos intestinais e hepáticos induzidos
pela indometacina em ratos Wistar / Marcos Antonio Martins da Silva. – 2011.
85f. : il. color., enc. ; 30 cm.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências da
Saúde, Departamento de Medicina Clínica, Programa de Pós-Graduação em Ciências
Médicas, Fortaleza, 2011.
Orientação: Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade

1. Talidomida. 2. Indometacina. 3. Hemorragia Gastrointestinal I. Título.

CDD 616.3

MARCOS ANTONIO MARTINS DA SILVA

AVALIAÇÃO DO EFEITO DA TALIDOMIDA SOBRE OS DANOS INTESTINAIS E
HEPÁTICOS INDUZIDOS PELA INDOMETACINA EM RATOS WISTAR

Dissertação submetida ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Médicas da
Faculdade de Medicina da Universidade
Federal do Ceará, como requisito parcial
para obtenção do título de Mestre.

Aprovado em: 08/07/2011

AGRADECIMENTOS

Ao meu Deus, por estar comigo nos momentos difíceis e tornar a minha vida
mais doce e tranquila.

À minha família, porque é nela que vou buscar incentivo para continuar e o
amparo nos momentos mais difíceis, especialmente a minha mãe Maria Lucimar
Martins da Silva, pelo amor e apoio incondicional e pela força para suportar todas as
adversidades do dia a dia.

À Profª. Drª. Geanne Matos de Andrade, minha orientadora, pela atenção,
dedicação, competência e por tudo o que fizera por mim durante todo esse período
do mestrado e, principalmente, por não me permitir desistir dessa jornada.

Ao Prof. Dr. Vietla Satyanarayana Rao, por sua amizade, colaboração e
disposição em sempre me ajudar, mesmo sabendo que por vezes me perco nas
bifurcações do caminho.

À Profª. Drª. Flávia Almeida Santos, pelo seu apoio e amizade.

Ao Prof. Dr. Dalgimar Beserra Menezes, do Departamento de Patologia e
Medicina Legal da Faculdade de Medicina da UFC, pelo auxilio na realização das
análises histopatológicas e prestimoso suporte a mim dispensado, por seu altruísmo
sui generis.

Ao Dr. Francisco Vagnaldo Fechine Jamacaru, da Unidade de Farmacologia
Clínica da UFC, por seu auxílio valioso nas análises estatísticas.

Ao Dr. Hemerson Yuri Ferreira Magalhães, pelo apoio inconteste, amizade e
pelos momentos compartilhados.

À Drª. Rosangela Albuquerque Ribeiro e ao Dr. Gentil Claudino Galiza Neto,
pelo apoio e incentivos constantes ao longo deste período e por terem me ensinado
a gostar de coagulação.
À Eunice Bobo de Carvalho, doutoranda do Programa de Pós-Graduação
em Ciências Médicas da UFC, pela sua amizade, dinamismo e constante incentivo
na execução deste trabalho.

À Julianna Catharina Neves, Carolina Melo Souza, mestranda e doutoranda
do Laboratório de Neurociência e Comportamento da UFC, pelo companheirismo e
pela valiosa cooperação na fase final deste trabalho.

Ao Professor Doutor Hélio Vitoriano Nobre, do Departamento de Farmácia
da UFC, por seus incentivos na conclusão deste mestrado.

Agradeço às secretárias Ivone Fontenele e Rita Almeida, da coordenação do
Curso de Pós-Graduação em Ciências Médicas da UFC, pela atenção que sempre
disponibilizaram, não só a mim, mas também a todos os pós-graduandos.

À Vilanny Rodrigues Bastos, técnica do Laboratório de Neurofarmacologia,
por sua enorme ajuda durante a execução deste trabalho.

A Carlos Jorge, Eloneide Vasconcelos, Fátima Marques, Kátia Maria
Carneiro, Rita Marinei, funcionários da Unidade Laboratorial em Hematologia do
Hemoce, pela ajuda na realização das análises laboratoriais.

À coordenação do Curso de Pós-Graduação em Farmacologia e aos
professores da área pelos ensinamentos durante as disciplinas cursadas.

A todos os professores, funcionários e equipe da coordenação do Programa
de Pós-Graduação em Ciências Médicas da UFC, que foram infinitamente
responsáveis pela concretização deste sonho. O meu eterno e inesquecível! Muito
Obrigado!

“É melhor tentar e falhar, que se
preocupar e ver a vida passar; é melhor
tentar, ainda que em vão, que se sentar
fazendo nada até o final. Eu prefiro na
chuva caminhar, que em dias tristes em
casa me esconder. Prefiro ser feliz,
embora louco, que em conformidade
viver...”. (Martin Luther King)
RESUMO
O uso clínico de indometacina, embora eficaz na supressão da dor, febre e
inflamação, é frequentemente associado a efeitos deletérios sobre o sistema
gastrointestinal, hematológico e renal, que limitam o seu uso terapêutico. Este
estudo analisou se a talidomida poderia reduzir a letalidade induzida pela
indometacina e as alterações hematológicas e bioquímicas no sangue, os danos
intestinais, além do efeito da talidomida sobre o epitélio intestinal e o aumento nos
níveis de fibrinogênio plasmático induzido pela indometacina em ratos. Os ratos
foram tratados com indometacina (5,0 mg/kg), talidomida 100,0 mg/kg e 200,0
mg/kg, e ampicilina (200,0 mg/kg), via oral, num período de cinco dias. Os animais
foram submetidos à coleta de sangue no quinto dia de tratamento, mediante a
punção do plexo-orbital do olho. Os parâmetros estudados foram: eritrograma,
contagem de leucócitos, tempo de protrombina (TP), tempo de tromboplastina
parcial ativada (TTPA), fibrinogênio, contagem de plaquetas, cultura do lavado
peritoneal e dosagem de mieloperoxidase (MPO) nesse lavado, avaliação hepática
(ALT, AST, FA, GGT) e glicose. Os resultados do TP, TTPA, antitrombina, contagem
de plaquetas, mantiveram-se normais em relação ao grupo controle. Nos animais
tratados com indometacina, observamos um aumento (p <0,001) nos níveis de
fibrinogênio (637,50±13,19 mg/dL) sendo o mesmo revertido pelo tratamento com
talidomida 100,0 mg/kg e 200,0 mg/kg, (381,80 ± 50,79 mg/dL; 389,30± 65,13
mg/dL) respectivamente. Os animais que receberam indometacina apresentaram
positividade em 100% das culturas realizadas para enterobactérias, demonstrando
assim a presença de bactérias do trato gastrintestinal na cavidade peritoneal. A
atividade da MPO no líquido peritoneal dos ratos que receberam indometacina (5,0
mg/kg, v.o, 5d) foi significativamente maior (1217 ± 341,4 U/mL) quando comparada
com o grupo-controle (3,33 ± 3,33 U/mL). O tratamento com talidomida (100 e 200
mg / kg, v.o, 5d) reduziu significativamente (p <0,05) este aumento (375,8 ± 149,1 U/
mL), sendo a inibição de 69,2%. Os resultados demonstram que a lesão intestinal
inflamatória induzida pela indometacina foi revertida parcialmente pelo tratamento
com a talidomida. Além disso, os dados obtidos evidenciam o efeito hepatoprotetor
da talidomida contra a indometacina, provavelmente por sua atividade
antiinflamatória diminuindo ou minimizando o aumento dofibrinogênio e
recrutamento leucocitário no ambiente hepático.

PPaallaavvrraass--cchhaavvee:: TTaalliiddoommiiddaa.. IInnddoommeettaacciinnaa.. SSaannggrraammeennttoo iinntteessttiinnaall..

AABBSSTTRRAACCTT

The clinical use of indomethacin, although effective in suppressing pain, fever and
inflammation is often associated with deleterious effects for the gastrointestinal
system, and hematological and renal functions, which limit its therapeutic use. This
study examined in rats whether thalidomide could reduced the lethality induced by
indomethacin and hematological, biochemical, blood, and intestinal damage. This
study analyzed the effect of thalidomide on the intestinal epithelium and increased
levels of plasma fibrinogen induced by indomethacin in rats. The rats were treated
with indomethacin (5.0 mg / kg), thalidomide 100.0 mg / kg or 200.0 mg / kg, and
ampicillin (200.0 mg / kg) orally over a period of 5 days. The animals were submitted
to blood collection on the fifth day of treatment by puncturing the orbital plexus of the
eye, after being anesthetized with ether. The blood was placed in tubes containing
anticoagulant, EDTA, sodium citrate and 3.8% in tubes without anticoagulant. The
parameters studied were: erythrogram, leukocyte count, prothrombin time (PT),
activated partial thromboplastin time (APTT), fibrinogen, platelet count, and culture of
peritoneal lavage, measurement of MPO and evaluation of liver function (ALT, AST,
FA, GGT and glucose). The results of the PT, APTT, antithrombin, platelet counts
remained normal in the control group. In animals treated with indomethacin, we
observed a significant increase (p <0.001) in fibrinogen levels (637.50 ± 13.19 mg /
dL) and this increase reversed by treatment with thalidomide 100.0 mg / kg or 200.0
mg / kg, (381.80 ± 50.79 mg / dL, 389.30 ± 65.13 mg / dL, respectively). Animals that
received indomethacin were positive in 100% of the cultures performed for
enterobacteria, thus demonstrating the presence of bacteria in the gastrointestinal
tract into the peritoneal cavity, probably due to a drug-induced intestinal perforation.
The MPO activity in peritoneal fluid of rats given indomethacin (5.0 mg / kg, po, 5d)
was significantly higher (1217 ± 341.4 U / mL) compared with the control group (3.33
± 3, 33 U / mL). Treatment with thalidomide (100 or 200 mg / kg, vo, 5d) significantly
reversed this effect (p <0.05), (375.8 ± 149.1 U / mL). As inhibition of 69.2%. The
results showed that inflammatory intestinal injury in rats induced by indomethacin
was partially reversed by treatment with thalidomide. In addition, the data showed a
hepatoprotective effect of thalidomide against indomethacin, by its anti-inflammatory
activity that might prevent the increase of fibrinogen and leukocyte recruitment in the
liver environment.

Keywords: Thalidomide, Indomethacin, Intestinal bleeding.

LISTA DE QUADROS
1 Classificação de AINEs, de acordo com atividade inibitória sobre as
isoformas COX-1 e 2 ............................................................................

20
2 Classificação intestinal, segundo Chiu e colaboradores (1970) ........... 42

LISTA DE TABELAS
1 Efeito do tratamento com talidomida nas alterações hematológicas
induzidas pela indometacina..................................................................

46
2 Efeito do tratamento com talidomida, nas alterações coagulométricas
induzidas pela indometacina..................................................................

47
3 Efeito do tratamento com a talidomida nas alterações bioquímicas
induzidas por indometacina em ratos....................................................

48
4 Estudo microbiológico do lavado peritoneal nos animais tratados com
indometacina, talidomida e ampicilina...................................................

49
5 Efeito do tratamento com a talidomida no dano intestinal induzido por
indometacina em ratos ..........................................................................

LISTA DE FIGURAS
1 Estrutura molecular da talidomida............................................................. 16
2 Proposta de mecanismo de ação da talidomida em células de
mieloma......................................................................................................

17
3 Cascata do ácido araquidônico e os sítios de ação de antiinflamatórios
não esteroidais ..........................................................................................

21
4 Fatores agressivos e mecanismos de defesa da mucosa gástrica........... 23
5 Ulcerações hemorrágicas na porção gastroduodenal em estômago de
cães, induzidas pela indometacina............................................................

24
6 Esquema resumido da cascata de coagulação e os fatores
envolvidos..................................................................................................

29
7 Efeito da indometacina sobre os níveis de fibrinogênio plasmático.......... 47
8 Efeito da talidomida sobre os níveis de mieloperoxidase no líquido
peritoneal de ratos tratados com indometacina.........................................

50
9 Efeito da talidomida sobre a lesão intestinal induzida pela
indometacina..............................................................................................

51
10 Efeito da talidomida sobre a lesão intestinal induzida pela indometacina
– Avaliação histológica..............................................................................

53
11 Curvas de sobrevida referentes aos grupos controle e tratados com
indometacina..............................................................................................

54
12 Relação entre a dose de indometacina e a sobrevida mediana................ 55
13 Curvas de sobrevida referentes aos grupos tratados com indometacina
isoladamente e indometacina associada à talidomida..............................

LISTA DE ABREVIATURAS
-GT
5-HT
12-HETE
12-HPETE
AINEs
ALT
AT
Ca++
CIVD
COX-1
COX-2
DMSO
EGF
EPM
FI
FII
FIII
FIV
FTC- 1
FV
FVII
FVIII
FVIIIa
FIX
FXa
FXI
FXII
Gama glutamiltransferase
5 - hidroxitriptamina
12 - ácido graxo hidroxi
12 - ácido hidroperoxieicosatetraenóico
Antiinflamatórios não esteroides
Alanina aminotransferase
Antitrombina
Cálcio
Coagulação intravascular disseminada
Cicloxigenase - 1
Cicloxigenase - 2
Dimetilsufóxido
Fator de crescimento epidermal
Erro-padrão da média
Fibrinogênio
Protrombina
Fator tissular ou tromboplastina tissular
Cálcio
Fator transformador do crescimento 1
Fator ou Proacelerina
Fator VII ou Proconvertina
Fator VIII ou Fator antihemofilico
Fator VIII ativado
Fator IX
Fator X ativado
Fator XI
Fator Hageman

FXIII
HMWK
IL-1
IL-2
IL-6
IL-8
IL-10
iNOS
LPS
LTB4
NO
PAF
PDF
PDGF
PGE2
PGG2
PGH2
PGI2
PGs
TNF-
TP
t-PA
TT
Fator XIII ou Fator estabilizador da fibrina
Cininogênio de alto peso molecular
Interleucina - 1
Interleucina - 2
Interleucina - 6
Interleucina - 8
Interleucina - 10
Óxido nítrico sintetase induzido
Lipossacarídeos
Leucotrieno B4
Óxido nítrico
Fator de ativação plaquetária (platelet-activing factor)
Produtos de degradação da fibrina/fibrinogênio
Fator de crescimento derivado de plaquetas
Prostaglandinas E2
Prostaglandinas G2
Prostaglandinas H2
Prostaciclina
Prostaglandinas
Fator de necrose tumoral -
Tempo de protrombina
Ativador tissular do plasminogênio
Tempo de trombina
TTPA
TXA2
Vit. k
VWF
Tempo de tromboplastina parcial ativada
Tromboxane A2
Vitamina K
Fator de Von Willebrand

SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...................................................................................... 16
1.1 A talidomida .......................................................................................... 16
1.2 A talidomida em eventos inflamatórios ................................................. 18
1.3 Os antiinflamatórios não esteroides (AINEs) em eventos inflamatórios 19
1.4 A indometacina, o AINE deste estudo .................................................. 25
1.5 A inflamação, os AINES e o choque séptico ........................................ 26
1.6 A relação inflamação, trombose e coagulação ..................................... 27
1.7 A talidomida em eventos trombóticos ................................................... 30
1.8 Relevância e justificativa do estudo ...................................................... 32
2 OBJETIVOS .......................................................................................... 34
2.1 Geral ..................................................................................................... 34
2.2 Específicos ............................................................................................ 34
3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................... 36
3.1 Animais ................................................................................................. 36
3.2 Drogas .................................................................................................. 36
3.3 Protocolo experimental ......................................................................... 36
3.4 Análise do perfil bioquímico, hematológico e coagulométrico.............. 37
3.4.1 Estudo da coagulação .......................................................................... 38
3.4.1.1 Tempo de protrombina (TP/TAP) .......................................................... 38
3.4.1.2 Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) ................................. 38
3.4.1.3 Dosagem de fibrinogênio ...................................................................... 39
3.4.1.4 Antitrombina .......................................................................................... 39
3.4.2 Avaliação da função hepática ............................................................... 39
3.5 Cultura do lavado peritoneal ................................................................. 41
3.5.1 Avaliação do número de células na cavidade peritoneal ...................... 41
3.5.2 Medida da atividade enzimática da mieloperoxidase (MPO) ................ 41
3.6 Análise histológica ................................................................................ 42
3.7 Exame histopatológico .......................................................................... 42
3.8 Avaliação da sobrevida (curva de sobrevivência) ................................. 43
3.9 Análise estatística ................................................................................. 43

4 RESULTADOS ...................................................................................... 45
4.1 Efeito do tratamento com talidomida em alterações hematológicas
sanguíneas e no líquido peritoneal induzidas pela Indometacina ........

45
4.2 Efeito da talidomida nas alterações dos parâmetros de coagulação
induzidas pela Indometacina ................................................................

46
4.3 Efeito do tratamento com talidomina nas alterações bioquímicas
induzidas por Indometacina ..................................................................

48
4.4 Estudo microbiológico do lavado peritoneal nos animais tratados com
indometacina, talidomida e ampicilina ..................................................

49
4.5 Efeitos da talidomida sobre a atividade da mieloperoxidase (MPO) no
líquido peritoneal em animais tratados com indometacina ...................

50
4.6 Efeito da talidomida sobre a lesão intestinal induzida pela
indometacina – avaliação macroscópica ..............................................

51
4.7 Efeito da talidomida sobre o dano intestinal induzido pela
indometacina – avaliação histológica ...................................................

52
4.8 Efeitos da talidomida sobre a letalidade induzida pela indometacina
em ratos ................................................................................................

53
5 DISCUSSÃO ......................................................................................... 57
CONCLUSÃO ...................................................................................................... 70
REFERÊNCIAS ................................................................................................... 72

IINNTTRROODDUUÇÇÃÃOO

1 INTRODUÇÃO

1.1 A talidomida

A talidomida é um derivado sintético do ácido glutâmico desenvolvido no início
dos anos de 1950, pela companhia alemã Chemie Grunenthal. Chegou à clínica em
outubro de 1957 como um anticonvulsivante sedativo e tranquilizante (MELCHERT;
LIST, 2007).
Também conhecida como 3-ftalimidoglutamimida, é constituída por uma
estrutura com dois anéis (Figura 1) com um carbono assimétrico na glutarimida
(DAL LAGO; RICHTER et al, 2003). Em razão deste centro quiral, a molécula existe
em duas formas opticamente ativas D(+) ou L(-) (WNENDT; ZWINGENBERGER,
1997).

Figura 1 – Estrutura molecular da talidomida

Fonte: (DAL LAGO; RICHTER, 2003).

Por conta dos inúmeros eventos adversos, em 1961 a talidomida foi retirada
do mercado europeu e nunca chegou a ser comercializada nos Estados Unidos, o
risco teratogênico estimado foi de 20% para os fetos expostos entre o 34º e 50º dias
de gravidez (WNENDT; ZWINGENBERGER, 1997). Em um ano, a droga foi retirada
de circulação em todos os países, à exceção do Brasil, país onde nunca deixou de
consumir o medicamento por vários motivos como desinformação e automedicação.
No ano de 1965, observações feitas por um dermatologista israelense, após
administração de talidomida a um paciente com eritema nodoso da lepra (ENL),
inicialmente, tentando tratar a insônia apresentada pelo paciente, obteve como
resposta a melhora do quadro inflamatório com cicatrização total das feridas em três
17

dias de terapia. Estudos realizados posteriormente comprovaram a ação
antiinflamatória da droga (PANNIKAR, 2003).
Apesar de ter sido afastada do mercado mundial na década de 60 em função
do efeito teratogênico em milhares de crianças, a talidomida começou a despertar
nos órgãos de regulamentação a necessidade de aumentar as exigências no que
tange à comprovação da segurança para comercialização do fármaco. Assim, nos
últimos anos, realizaram-se vários estudos, explorando outros alvos terapêuticos,
como a ação sobre mediadores inflamatórios e imunológicos (Figura 2)
(MATTHEWS; McCOY, 2003; MELCHERT; LIST, 2007).
Figura 2 – Proposta de mecanismo de ação da talidomida em células de mieloma. A
talidomida inibe a angiogênese, realça os efeitos do sistema imunológico, inibe a ligação das
células do tumor do estroma e também várias citocinas. A talidomida pode ter efeitos diretos
sobre o tumor; NK: natural killer; TNF: fator de necrose tumoral, IL-6: interleucina-6; VEGF:
fator de crescimento endotelial vascular; NF-kB: fator nuclear kappa B.

Fonte: (MELCHERT; LIST, 2007).

A talidomida revolucionou a maneira de pensar sobre os efeitos adversos de
fármacos no feto e a forma de tentar preveni-los, com um alto preço pago por essa
percepção (MELCHERT; LIST, 2007). Talvez também venha a revolucionar a
maneira de trataro câncer e outras condições graves que possam ser controladas
em vez de curadas, justificando dar uma nova chance a este fármaco tão temido
(CHEN; DOHERTY; HSU, 2010). Embora existam, porém, especulações dos
benefícios da talidomida em diversos tratamentos, além da hanseníase, mieloma
múltiplo, doenças crônico-degenerativas e algumas patologias oportunistas que
afetam portadores de HIV, não há sustentabilidade científica para tais afirmações em
outros casos. O aproveitamento das possibilidades terapêuticas da talidomida, no
entanto, deve ser algo a se pensar, a ser viabilizado, porque a humanidade não
pode desperdiçar as propriedades terapêuticas da talidomida. Ante às evidências
contemporâneas, o melhor que se tem a fazer é contrabalançar riscos e benefícios
no uso dos medicamentos, pois os primeiros são reais e continuam acontecendo,
enquanto os outros são focados mais em desfechos substitutos do que nos
clinicamente relevantes.

1.2 A talidomida em eventos inflamatórios

A investigação farmacêutica tem como intuito o desenvolvimento de outros
agentes terapêuticos direcionados à resolução de situações clínicas, integrando
conhecimentos, ou mesmo uma aplicabilidade alternativa para fármacos já
consagrados (RAMA et al., 2005).
Há algum tempo o mecanismo de ação da talidomida aponta para suas
propriedades imunomodulatórias e antiinflamatórias (MURIEL et al., 2003). A
aplicação da talidomida no tratamento das desordens inflamatórias demonstra a
eficácia desse fármaco, por exemplo, na redução de sintomas em pacientes com
doença de Crohn (DC), uma moléstia inflamatória que se caracteriza por
envolvimento transmural e descontínuo dos intestinos, podendo atingir todo o tubo
digestivo. Acomete, com maior frequência, o intestino delgado, principalmente o íleo
terminal e o cólon, iniciando-se tipicamente com crises de diarreia, febre, dor
abdominal e emagrecimento, mas seu mecanismo de ação é desconhecido
(BAUDITZ; WEDEL; LOCHS, 2002).
19

Um possível mecanismo da talidomida seria o da supressão do fator de
necrose tumoral alfa (TNF-α), considerado o agente central no processo inflamatório
da DC e encontrado em grande concentração sérica nos portadores dessa doença
(BAUDITZ; WEDEL; LOCHS, 2002).
Apesar de, a talidomida ser menos eficaz do que outras terapias recentes,
como o infliximab, análogos dessa droga, com atividade anti-TNFα aumentada, são
desenvolvidos, supondo-se que sejam menos tóxicos e não teratogênicos, e
podendo vir a servir de opção terapêutica no futuro (BAUDITZ; WEDEL; LOCHS,
2002).

1.3 Os antiinflamatórios não esteroides (AINEs) em eventos inflamatórios

Desde a inserção dos salicilatos na terapêutica, por volta de 1875, as
pesquisas de antiinflamatórios desenvolveram-se de forma acelerada, após as
primeiras constatações clínicas dos notáveis efeitos da cortisona e fenilbutazona, em
1948 (JONES, 2001). Na década de 1960, a procura por substâncias alternativas
capazes de debelar o processo inflamatório levou ao surgimento de outras propostas
terapêuticas (JONES, 2001; RICHY et al., 2004). Assim, em 1963, a indometacina
foi introduzida e demonstrou proeminentes efeitos no tratamento da espondilite
anquilosante e da artrite gotosa aguda (BECH et al., 2000; CHAN; GRAHAM, 2004;
FOUAD et al., 2010).
Apesar dos objetivos terapêuticos a que se destinam os antiinflamatórios não-
esteróides (AINEs) como as doenças reumáticas, calor, eritema, edema e dor,
polêmicas sobre a eficácia e, principalmente, a toxicidade ainda ensejam muitas
discussões (VONKEMA; VAN DE LAAR, 2010).
Os AINEs podem ser classificados de acordo com sua atividade inibitória
sobre a COX-1 e/ou COX-2 (RAO; KNAUS, 2008), como demonstrado no Quadro 1.

Quadro 1 - Classificação de AINEs, de acordo com atividade inibitória sobre as
isoformas COX-1 e 2.
Classe Propriedades Exemplos
Grupo 1
AINEs que inibem completamente COX-1 e 2
com pequena seletividade
Aspirina, ibuprofeno,
diclofenaco, indometacina,
naproxeno, piroxicam.
Grupo 2
AINEs que inibem COX-2 com 5-50% de
seletividade.
Celecoxib, etodolac,
meloxicam, nimesulida.
Grupo 3
AINEs que inibem COX-2 com seletividade >
50%.
Rofecoxibe, NS-398
Grupo 4
AINEs que inibem fracamente ambas as
isoformas (COX-1 e 2).
Ácido 5-Aminosalicilico,
salicilato de sódio,
nabumetona, sulfasalazina.
Fonte: (RAO; KNAUS, 2008).
Há algum tempo os metabólitos do ácido araquidônico (AA), prostaglandinas
(PGs) e outras substâncias biologicamente ativas recebem atenção especial por
muitos pesquisadores em todo o mundo, por exercerem funções cruciais na
fisiopatologia do processo inflamatório (TULASSAY; HERSZÉNYI, 2010).
A cicloxigenase existe em pelo menos duas isoformas: a cicloxigenase-1
(COX-1) é enzima constitutiva, destinada às funções fisiológicas decorrentes da
síntese de PGs, e a cicloxigenase-2 (COX-2) é induzível por processos inflamatórios,
ativação mitogênica para proliferação celular, interleucinas (IL-1 e IL-2), fatores de
crescimento (EGF e PDGF), lipopolissacarídeos bacterianos (LPS), promotores
tumorigênicos (como ésteres do forbol) e outros fatores presentes no soro normal
(RADI; KHAN, 2006; SOSTERS et al., 2010).
Vários compostos inibidores, preferencialmente da COX-2, como
nabumetona, meloxicam e nimesulide, podem induzir toxicidade gastrointestinal,
particularmente quando são empregadas em altas doses (RADI; KHAN, 2006;
TAKEUCHI et al., 2010b). Além disso, o benefício da inibição preferencial de COX-2,
em relação a COX-1, nos estados inflamatórios, ainda não foi completamente
comprovado (TANAKA et al., 2002; ABURAYA et al., 2006).
A ação enzimática da cicloxigenase sobre o ácido araquidônico baseia-se na
inserção de duas moléculas de oxigênio no ácido araquidônico, dando origem a
21

PGG2, e de peroxidase, que transforma esse intermediário em PGH2. A PGG2 tem
extrema reatividade química (RADI; KHAN, 2006).
O sítio catalítico dessa reação pode ser inibido irreversivelmente por aspirina
(ácido acetilsalicílico) que acetila a molécula da COX ou reversivelmente por
indometacina e outros antiinflamatórios não esteroides (AINEs), que competem com
ácido araquidônico, explicando o efeito antiinflamatório dos AINEs – Figura 3 -
(BERTOLINI; OTTANI; SANDRINI, 2001; HATMI; SAMAMA; ELALAMY, 2006).
Figura 3 - Cascata do ácido araquidônico e os sítios de ação de antiinflamatórios não
esteroidais.

Fonte: (BERTOLINI; OTTANI; SANDRINI, 2001).

As células endoteliais ativadas desempenham papel fundamental na
orientação das células circulantes para os locais inflamatórios (KRELIN, 2007). A
adesão celular parece ocorrer pelo reconhecimento das glicoproteínas e
carboidratos da superfície celular das células circulantes pelas moléculas de adesão,
22

cuja expressão mostra-se intensificada nas células residentes (DINARELLO, 2005;
2009a, 2009b).
Assim, a ativação endotelial resulta na adesão dos leucócitos por meio de sua
interação com as selectinas L e P recém-expressas, enquanto a selectina E
expressa pelo endotélio interage com a glicoproteína x sializada de Lewis e outras
glicoproteínas existentes na superfície dos leucócitos; a ICAM-1 endotelial interage
com as integrinas leucocitárias (MEYER-HOFFERT; HORNEF; HENRIQUES-
NORMARK, 2008). Os AINEs podem inibir a expressão ou a atividade de algumas
dessas moléculas da adesão celular, embora esse mecanismo não esteja
completamente elucidado (PROUDFOOT; POWER; SCHWARZ, 2010).
O recrutamento das células inflamatórias para os locais de lesão envolve
interações simultâneas de vários tipos de mediadores solúveis, além das moléculas
de adesão celular, incluindo o fator C5a do complemento, o fator ativador plaquetário
e o leucotrieno B4 (MARTIN; WALLACE, 2006). Várias citocinas também parecem
desempenhar um papel essencial na ativação do processoinflamatório,
especialmente a interleucina-1 (IL-1) e o fator de necrose tumoral (TNF). Esses dois
fatores são considerados os mediadores principais das respostas biológicas
desencadeadas por LPS (lipopolissacarídeos) e muitos outros estímulos infecciosos
(PLAYFORD; GHOSH, 2005). As citocinas IL-1 e TNF produzem as mesmas
respostas pró-inflamatórias, que incluem a indução da febre, mobilização e ativação
dos leucócitos polimorfonucleados, indução das enzimas COX e lipoxigenase,
aumento da expressão das moléculas de adesão, ativação dos linfócitos B, T e
células natural killer e estimulação e produção de outras citocinas (RAO; KNAUS,
2008).
Para compensar os efeitos tóxicos dos mediadores pró-inflamatórios há pouco
citados, outras citocinas e fatores de crescimento estão envolvidos na resposta
antiinflamatória, entre elas o fator transformador do crescimento 1 (TGF- ), o qual
aumenta a formação da matriz intracelular, no entanto, também atuam como
imunossupressores, a interleucina-10 (IL-10) e o interferon gama (INF- ) (D’AVILA et
al., 2006; DINARELLO, 2010).
23

O fator ativador plaquetário (PAF) é outro mediador derivado dos fosfolipídios
que apresenta múltiplos efeitos inflamatórios (FOLCO; MURPHY, 2006) Além de
estimular as plaquetas, o PAF causa vasoconstricção, broncoconstricção e, em
concentrações extremamente baixas, induz vasodilatação e aumento da
permeabilidade venular; gera também aumento da adesão leucocitária ao endotélio,
da quimiotaxia, da desgranulação e um “surto” oxidativo (VAKNIN; KURZWEIL;
SHERMAN, 2010). O leucotrieno (LTB4), um potente agente quimiotático, causa
agregação de neutrófilos, enquanto o óxido nítrico (NO) está envolvido na
vasodilatação e na toxicidade (HAEGGSTROM, 2004).
Além das diversas atividades terapêuticas em comum, os AINEs
compartilham vários efeitos adversos, presumivelmente em decorrência da inibição
da COX (WHITTLE, 2003; HAEGGSTROM, 2004). Os mais frequentes (6 - 33%) são
distúrbios gastrintestinais, atribuídos à redução do efeito citoprotetor gástrico das
prostaglandinas (Figura 4).
Figura 4 - Fatores agressivos e mecanismos de defesa da mucosa gástrica.

Fonte: (HAEGGSTROM, 2004).

O aumento do fluxo sanguíneo da mucosa gástrica, a estimulação da
secreção de muco e bicarbonato e a diminuição de ácido livre desaparecem com o
bloqueio da síntese de COX-1 (HAEGGSTROM, 2004; RADI; KHAN, 2006).
As manifestações digestivas incluem eritema e erosões gástricas, ulceração
gástrica e duodenal, dispepsia, dor epigástrica, náuseas e vômitos, anorexia,
flatulência, diarreia e perda de sangue pelo tubo digestivo (Figura 5) (RAINSFORD;
STETSKO; SIRKO, 2003).
Figura 5 – Ulcerações hemorrágicas na porção gastroduodenal em estômago de cães,
induzidas pela indometacina.
Fonte: (RADI; KHAN, 2006).
A frequência, natureza e gravidade dos efeitos tóxicos variam conforme o
fármaco, assim como a dose, mas basicamente todas são capazes de produzir
distúrbios gástricos (úlceras inclusive) como também fenômenos hemorrágicos
decorrentes de tratamentos prolongados. Para contornar esses graves eventos
adversos, são utilizadas substâncias gastroprotetoras ou antiácidos (LANE; KIM,
2006).
A função plaquetária é alterada porque os AINEs impedem a formação, pelas
plaquetas, do tromboxano A2 (TXA2), um potente agente agregante, o que explica a
tendência que estes medicamentos têm de aumentar o tempo de sangramento
(ABURAYA et al., 2006).

1.4 A indometacina, o AINE deste estudo
A indometacina, introduzida no mercado em 1963, foi um marco do começo
de uma nova direção das pesquisas dos antiinflamatórios (SCHMIDT et al., 2001;
KOMOIKE et al., 2002; TAKEUCHI et al., 2010b; FOUAD et al., 2010). Apresenta
propriedades analgésicas e antipiréticas, sendo seus efeitos antiinflamatórios
considerados marcantes, evidenciados em pacientes com artrite reumatóide, gota
aguda, espondilite anquilosante, osteoartrite do quadril e doença óssea de Paget,
mostrando-se também eficaz em afecções inflamatórias extra-articulares, como
pericardite e pleurite, e na síndrome de Batter (RAINSFORD; STETSKO; SIRKO,
2003; TAKEUCHI et al., 2010c). Também inibe a biossíntese de PGs e, além disso,
desacopla a fosforilação oxidativa na mitocôndria hepática e cartilaginosa e inibe a
motilidade de leucócitos polimorfonucleares. A sua ação antiinflamatória não
depende da estimulação adrenocortical (TAKEUCHI et al., 2010c).
Pesquisas mostram que a indometacina não modifica o efeito de
anticoagulantes orais, contudo, a administração simultânea poderia ser perigosa em
razão do risco aumentado de sangramento gastrintestinal, apesar de sua utilização
crônica raramente levar ao óbito (RAINSFORD; STETSKO; SIRKO, 2003). A
ulceração gastroduodenal é o efeito adverso mais severo em usuários do fármaco,
podendo evoluir para perfuração e podendo também causar hemorragia, atingindo,
porém, apenas 1% dos pacientes (CHAN; GRAHAM, 2004).
Está bem documentada na literatura a capacidade da indometacina de induzir
úlceras em animais de laboratório e no homem. Esta é considerada um poderoso
inibidor da ciclo-oxigenase, impedindo a biossíntese de prostaglandinas. A redução
da biossíntese dos prostanóides, diminui a resistência da mucosa à ação do HCl e
da pepsina. Os mecanismos subjacentes à proteção gástrica conferida pelos
prostanóides parecem estar relacionados à ativação de fatores gastroprotetores,
assim como a redução da secreção ácida de pepsinogênio e do aumento do fluxo
sanguíneo gástrico local (BORRELLI; IZZO, 2000).
Quanto aos aspectos bioquímicos, o uso, principalmente crônico ou sem
acompanhamento médico, pode levar à instalação de acidose tubular, diminuição da
filtração glomerular, com a consequente retenção de fluidos relacionada com a
26

inibição da síntese de PGs no rim (FILARETOVA et al., 2002; HAWKEY; SKELLY,
2002; REED, 2002). A ingestão crônica de indometacina induz a instalação de ileítes
crônicas e outras complicações graves, como síndrome de má absorção, perfuração,
hemorragia e oclusão intestinal, podendo levar a um choque séptico (NOLD et al.,
2007).
Atualmente, os antiinflamatórios não esteroidais (AINEs) são utilizados com
sucesso para o alívio de dor, febre e inflamação, sendo uma das classes de
medicamentos mais consumidas diariamente em todo o mundo por milhões de
pacientes (VONKEMA; VAN DE LAAR, 2010). Pesquisas mostram que a
administração de AINES em doses terapêuticas apresenta alta eficácia, porém, o
uso desses fármacos é associado com vários efeitos colaterais, como morbidez e
mortalidade (LANE; KIM, 2006; FOUAD et al., 2010).
Persiste ainda a necessidade que se desenvolvam novos agentes que sejam
eficazes no combate ao fator etiológico da doença. Os AINEs apenas diminuem a
intensidade dos sinais e sintomas da inflamação, não eliminando a moléstia
(DINARELLO, 2010; TAKEUCHI et al., 2010a).

1.5 A inflamação, os AINEs e o choque séptico
O choque séptico decorre da disseminação de microorganismos com origem
em infecções localizadas graves (ex., abscessos, peritonite e pneumonia) para o
sangue (REN et al., 2004). A maioria dos casos é causada por bacilos Gram-
negativos produtores de endotoxinas (lipopolissacarídeos - LPS da parede
bacteriana, que consistem em um componente central tóxico de lipídeo e em um
revestimento polissacarídico complexo), e também por bactérias Gram-positivas e,
ocasionalmente, por fungos (POVOA, 2002). Os mediadores inflamatórios liberados
pelo LPS são citados como causadores do choque, e incluem os seguintes: citocinas
(IL-1, TNF, IL-6, IL-8), PAF, NO, complemento (C5a e C3a), prostaglandinas,
leucotrienos, sistema cinina, metabólitos do oxigênio, catecolaminas, endorfinas e
fator depressor miocárdico (SERHAN; CHIANG, 2008; LI et al., 2009; DINARELLO,
2010).
27

A ativação mediadapelas endotoxinas do sistema fagócito mononuclear, com
a consequente liberação de IL-1 e TNF-α, no entanto, é um evento crucial na
patogenia do choque séptico (REN et al., 2004; SERHAN; CHIANG, 2008). Estas
citocinas geram ativação endotelial e adesão e agregação leucocitárias, além de
promoverem a coagulação intravascular e a trombose capilar (DINARELLO, 2009a,
2010).

1.6 A relação inflamação, trombose e coagulação
A relação entre inflamação e coagulação é inquestionável. A reação
inflamatória ativa a coagulação sanguínea, promovendo a expressão de fator tissular
no espaço intravascular e ativa moléculas de adesão de leucócitos na parede
vascular, diminuindo a atividade fibrinolítica e a função da via anticoagulante da
proteína C (PC) (ESMON et al., 1999). Diferentes investigações demonstraram que o
fator de necrose tumoral- (TNF- ) é o primeiro a se elevar, seguido da elevação
dos níveis plasmáticos de interleucinas 6 (IL-6) e 1 (IL-1). Estudos envolvendo a
administração dessas interleucinas em voluntários saudáveis ou em modelos
animais, bem como o uso de anticorpos bloqueando sua ação, sugeriram que a IL-6
é a principal responsável pela geração de trombina, possivelmente porque regula a
expressão de fator tissular. O papel do TNF- na ativação da coagulação é
relacionado à sua capacidade de induzir o aumento da IL-6. Adicionalmente, o TNF-
parece ser o principal mediador da depressão da atividade do sistema da PC, por
induzir diminuição da expressão de trombomodulina nas células endoteliais (LEVI;
TEN, 1999).

A coagulação sanguínea é um processo dinâmico de reações bioquímicas
envolvendo proteínas plasmáticas com atividade de proteases, lipídeos e íons, que
transformam o sangue circulante fluido em um gel insolúvel pela conversão do
fibrinogênio em fibrina (BROOMHEAD; MALLETT, 2010), muito embora a fibrina,
propriamente dita, só corresponda a 0,15% do total do coágulo sanguíneo
(LONGSTAFF, 2010).
É costume dividir o esquema de coagulação sanguínea em vias extrínseca e
intrínseca, que convergem para o ponto onde o fator X é ativado (NORRIS, 2003;
28

BOMBELI; SPAHN, 2004). A via intrínseca é iniciada in vitro pela ativação por
contato do fator de Hageman (fator XII). Essa via contém ainda os fatores XI, IX, e
VIII, necessários à formação do coágulo e que se acham presentes no sangue
circulante (BROOMHEAD; MALLETT, 2010). A via extrínseca é ativada pela ação da
lipoproteína denominada tromboplastina tecidual (FIII), que o endotélio lesado libera
para o sangue circulante (BOUMA; MEIJERS, 2004; BROOMHEAD; MALLETT,
2010).
O fígado sintetiza todos os fatores da coagulação, incluindo o FVIII e os
inibidores fisiológicos da coagulação, como proteína C, proteína S e antitrombina
(KAM; EGAN, 2002; BROOMHEAD; MALLETT, 2010). O fator XIII parece ser
encontrado também nos megacariócitos e plaquetas (BOMBELI; SPAHN, 2004,
BROHI et al., 2007; APPADU, 2010).
Antitrombina
A antitrombina (AT), importante inibidor fisiológico da coagulação, pertence à
família das serpinas e desempenha seu papel fisiológico na coagulação sanguínea,
ao lado da proteína C e S. Estudo realizado por Finazzi e Barbui (1994) mostrou que
pacientes com deficiência de antitrombina têm maior incidência de trombose do que
aqueles com deficiência de proteína C ou proteína S. A AT inibe várias
serinoproteases ativadas na cascata da coagulação, incluindo os fatores XIIa, XIa,
Xa, IXa e a trombina. Portanto sua deficiência implica maior atividade pró-
coagulante, com a consequente exacerbação na produção de fibrina, culminando
com a gênese de eventos trombóticos (Figura 6).
Fibrinogênio (Fator I)
O fibrinogênio, fator de coagulação mais abundante e que forma o coágulo de
fibrina (FRANCO, 2001; VAN HINSBERGH, 2001; LONGSTAFF; WHITTON, 2004),
é uma proteína plasmática, de alto peso molecular (320.000 - 400.000 dáltons),
sintetizada pelo fígado, cuja molécula forma três glóbulos, unidos entre si por
estruturas filamentosas enoveladas (FRANCO, 2001; VAN HINSBERGH, 2001;
KAM; EGAN, 2002; LONGSTAFF et al., 2007).
O fibrinogênio é um dos três principais componentes das vias da coagulação,
como também um componente-chave na agregação plaquetária. Parte do
29

fibrinogênio é efetivamente derivada das plaquetas (VAN HINSBERGH, 2001; KAM;
EGAN, 2002; GAILANI; RENNÉ, 2007). Níveis altos de fibrinogênio aparecem como
um fator de risco significante para a trombose arterial e também venosa (JACKSON,
2007).
O fibrinogênio é uma proteína de fase aguda cuja concentração plasmática
eleva-se sob a ação estimuladora das interleucinas (IL-1 e 6) e do fator de necrose
tecidual liberado pelo processo inflamatório (ANDREWS et al., 1994). Segundo
Schalm e colaboradores (1975), durante o processo de inflamação aguda, sua
concentração plasmática de fibrinogênio aumenta por vários dias, atingindo um pico
entre o quinto e o sétimo dia. Não sofre alteração perceptível em virtude de fatores
como a idade, sexo, exercício ou hemorragia, mas pode ser afetada por processos
inflamatórios (JAIN, 1993; THOMAS, 2000). O grau de hiperfibrinogenemia pode
refletir a severidade da inflamação (SCHALM et al., 1970).
Figura 6 - Esquema resumido da cascata de coagulação e os fatores envolvidos

Fonte: (EYRE; GAMLIN, 2010). FI: Fibrinogênio; FII: Protrombina; FIII: Fator tissular (FT); FIV:
Íons cálcio (Ca
2+
); FV: Pro-acelerina; FVII: Pro-convertina; FVIII: Fator antihemofílico; FIX: Fator
de Christmans; FX: Fator Stuart; FXI: Fator XI; FXII: Fator de Hageman; FXIII: Fator
estabilizador de fibrina.

1.7 A talidomida em eventos trombóticos
O tromboembolismo venoso é uma causa importante de morbidade e
mortalidade em muitas situações, como; por exemplo, em pacientes oncológicos.
Sabe-se que aproximadamente 20% dos pacientes com algum tipo de câncer,
certamente, desenvolverão tromboembolismo venoso, sendo essa a segunda causa
de morte nesse grupo (ALTER; STUKEL; NEWMAN, 2006; DELORENZO;
SIEWERS; WENNBERG, 2006; GIBBONS; ARAOZ; WILLIAMSON, 2009).
A etnia também se mostra como fator de risco importante para o
tromboembolismo venoso. Assim, asiáticos e habitantes das ilhas do Pacífico têm
menor risco de trombose associada à neoplasia quando comparados a caucasianos,
já em negros dos Estados Unidos, o risco de tromboembolismo venoso varia com o
tipo de câncer (ALCALAY et al., 2006; CHEW et al., 2006; KHORANA et al., 2006;
BROWNING; MARTIN, 2007).
A utilização de agentes antiangiogênicos, em esquemas de tratamento para
pacientes oncológicos, está particularmente associada à trombose. A talidomida está
fortemente implicada com o desenvolvimento de tromboembolismo venoso em
pacientes com mieloma múltiplo, onde o risco aumenta quando usada em pacientes
com diagnóstico recente e em combinação com esteróides, melfalam e outros
quimioterápicos e corticóides, particularmente doxorrubicina (TOSI et al., 2010). O
risco trombótico aparentemente se estende aos análogos como a lenalidomida
(FERRAROTTO et al., 2009).
O mecanismo pelo qual a talidomida isoladamente ou associada a outros
agentes tumorais pode favorecer a trombose é desconhecido. Os eventos
trombóticos não teriam relação com a dose utilizada de talidomida e, geralmente
ocorrem nos primeiros três meses de tratamento e apresentam maior frequência
quando a talidomida é usada em associação com quimioterápicos e corticóides,
particularmente doxorrubicina, e dexametasona, nos casos recém-diagnosticados, e,
portanto, com maior massa tumoral, e nos pacientes que exibem anormalidade no
cromossomo 11 (BARBUI; FALANGA, 2003; RODEGHIERO; ELICE, 2003; RUS et
al., 2004; ELICE et al., 2006; HUSSEIM, 2006; BEYER-WESTENDORF et al., 2010).
31

É importante lembrar que, em pacientes com mieloma, frequentemente estão
presentes outros fatores de risco para TEV (tromboembolismo venoso), como idade
avançada,imobilização, aumento da viscosidade plasmática, uso de cateter venoso
central, infecções associadas, diabetes e dislipidemia (D'AMICO; VILLAÇA, 2007).
O exato mecanismo de ação da talidomida ainda não foi esclarecido,
entretanto, se acredita estar relacionada a sua propriedade antiinflamatória,
imunomodulatória e antiangiogênica. Suas propriedades antiinflamatórias incluem a
inibição da quimiotaxia de linfócitos e neutrófilos. Adicionalmente, inibe a fagocitose
por neutrófilos e macrófagos. No eritema nodoso hanseniano, o TNF- e INF- estão
geralmente elevados e a melhora clínica dos pacientes tratados com talidomida
corresponde à redução destas duas citocinas, podendo ser observadas também
alterações nos níveis de proteínas (WU et al., 1994).
Nos processos inflamatórios locais, podem ser verificadas alterações das
concentrações de proteínas de fase aguda, tanto no plasma como no líquido
peritoneal (FAGLIARI et al., 1998). As proteínas de fase aguda são consideradas
como potenciais indicadores da presença de doenças e sua quantificação pode nos
fornecer informações importantes sobre a resposta inflamatória de fase aguda e sua
evolução, podendo ser utilizada para estabelecer parâmetros e explorar o impacto
dos vários agentes etiológicos e outros fatores envolvidos nas enfermidades
(MURATA et al., 2004).
Existe uma série de situações, como, por exemplo, trauma, necrose tissular,
infecção microbiana, doenças inflamatórias, que desencadeiam múltiplas respostas
inespecíficas, incluindo febre, leucocitose, catabolismo proteico, e ainda estimulam a
síntese, essencialmente a nível hepático, de numerosas proteínas. Na resposta de
fase aguda, as proteínas de fase aguda positivas aumentam de concentração, e
proteínas de fase aguda negativa diminuem em pelo menos 25% após o início da
resposta. O exemplo mais importante das proteínas cujos níveis diminuem é a
albumina (WU et al., 1994; FAGLIARI et al., 1998).
Assim, a talidomida pode interferir em alguns parâmetros relacionados aos
fenômenos coagulativos. Estudos randomizados demonstram maior risco
tromboembólico nos pacientes que recebem eritropoetina. Fatores de maior risco
são: história prévia de trombose, cirurgias, períodos prolongados de imobilidade.
32

Pacientes com mieloma múltiplo que recebem talidomida ou lenalidomida,
doxorrubicina e corticosteróides também têm maior risco trombótico (LEE, 2010).

1.8 Relevância e justificativa do estudo

Pelos inúmeros e variados dados da literatura citados anteriormente, percebe-
se a real imbricação que ocorre entre os mecanismos de resposta inflamatória, o uso
de AINE's e processos ou alterações de coagulação. Há entretanto, muito o que se
compreender nesta relação de sistemas tão diferentes, mas que muitas vezes por
motivações de natureza fisiopatológicas convergem e entrecruzam, culminando com
resultados extremamente danosos e até mesmo fatais.
Nesse sentido, a talidomida, detentora de potente ação inibidora da
angiogênese, demonstra resultados promissores na profilaxia de sangramentos
enterocólicos relacionados a angiodisplasias múltiplas, podendo ser usada em casos
refratários, com as contraindicações ou sem resposta a outras terapias (MOLINA et
al., 2007).
Desta forma, ressalta-se a relevância deste estudo, como um esforço
científico de melhor entender a inter-relação do uso de drogas antiinflamatórias com
inflamação e hemostasia.

OOBBJJEETTIIVVOOSS

2 OBJETIVOS

2.1 Geral
Avaliar os efeitos da talidomida sobre a toxicidade intestinal e hepática
induzida pela indometacina em ratos Wistar.

2.2 Específicos
Avaliar a toxicidade intestinal e hepática induzida pela indometacina e
possível efeito protetor da talidomida, avaliando os seguintes aspectos:

 avaliar os parâmetros hematológicos, coagulométricos e bioquímicos no
sangue;
 detectar e quantificar a presença de enterobactérias no lavado peritoneal;
 avaliar a atividade da mieloperoxidase no lavado peritoneal;
 observar possíveis alterações histopatológicas (infiltrado inflamatório, úlceras
e hemorragia); e
 determinar a sobrevida dos animais ao longo do tratamento.

MMEETTOODDOOLLOOGGIIAA
36

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Animais
Ratos, machos adultos, linhagem Wistar (180 - 220g), provenientes do
Biotério Central da UFC e mantidos no Biotério do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia da UFC, foram acondicionados em gaiolas-padrão de polipropileno (41
x 34 x 16 cm 6/caixa), a temperatura ambiente sobre condições controladas de
temperatura (22- 24°C) e luminosidade (ciclo claro/escuro de 12 h) com livre acesso
a água e ração (Purina, São Paulo). Os procedimentos experimentais foram
conduzidos de acordo com as recomendações do Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA-2008).

3.2 Drogas
Talidomida (Funed®-100mg, Fundação Ezequiel Dias – Brasil), indometacina
(Indocid®- 50mg-Merck Sharp & Dohme) e ampicilina (500mg, EMS /SA). Todos os
reagentes usados foram de grau analítico.

3.3 Protocolo experimental
Os animais foram distribuídos aleatoriamente nos grupos a seguir delineados.

Grupo 1 - controle/veículo: os ratos foram submetidos à administração por via oral
de DMSO a 2% em salina durante cinco dias consecutivos (n = 08).
Grupo 2 - indometacina: os ratos foram submetidos à administração por via oral de
indometacina 5,0 mg/kg em DMSO a 2%, durante cinco dias consecutivos (n = 08).
Grupo 3 - talidomida: os ratos foram submetidos à administração por via oral de
talidomida 200 mg/kg em DMSO a 2%, durante cinco dias consecutivos (n = 08).
37

Grupo 4 - indometacina + talidomida 100 mg/kg: talidomida na dose de 100 mg/kg
suspensa em DMSO a 2% por via oral duas horas após a indometacina, durante
cinco dias consecutivos (n = 08).
Grupo 5 - indometacina + talidomida 200 mg/kg: talidomida 200 mg/kg suspensa em
DMSO a 2%, por via oral duas horas após a indometacina, durante cinco dias
consecutivos (n = 08).
A dose de indometacina (5,0 mg/kg) e de talidomida (100 mg/kg e 200 mg/kg)
utilizadas teve como referência as citadas em trabalhos da literatura e em um
estudo- piloto de curva de sobrevivência com indometacina.

3.4 Análise do perfil bioquímico, hematológico e coagulométrico
No quinto dia de tratamento, foram retiradas amostras de sangue do plexo
orbital para a dosagem de ureia e creatinina, e assim analisar a possível toxicidade
renal, dosagem de alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase
(AST), fosfatase alcalina, -glutamil transpeptidase (GGT), albumina e glicose para
analisar possíveis danos hepáticos e glicose. As dosagens foram realizadas por
meio de kits segundo instruções de seus fabricantes.
Os animais foram sedados levemente com éter etílico, para a retirada de
sangue do plexo retrorbital. O sangue foi coletado em tubos contendo EDTA
(parâmetros hematológicos); citrato de sódio a 3,8% (parâmetros da coagulação) e
em tubos sem anticoagulante (parâmetros bioquímicos). Após a coleta, o material foi
devidamente identificado e levado imediatamente ao Laboratório de Coagulação do
HEMOCE para a realização dos exames: hemograma (leucócitos, hemácias,
hemoglobina e hematócrito, contagem de plaquetas), tempo de protrombina (TP),
tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa), dosagem de fibrinogênio e
antitrombina.
Antes do processamento das amostras, teve-se sempre o cuidado de verificar
a presença de qualquer indício de hemólise, e/ou de fibrina, se encontrados.
Eliminou-se o material para a obtenção de resultados confiáveisnos exames
realizados. Para a obtenção de soro ou plasma, o sangue foi centrifugado a 3000
rpm por 15 minutos.
38

As dosagens bioquímicas foram realizadas por meio de métodos cinéticos ou
enzimáticos em aparelho automatizado (BT 3000 PLUS – Wiener Lab), de acordo
com protocolos sugeridos pelo fabricante dos reagentes. Enquanto isso, as análises
hematológicas foram realizadas em um contador automático de células sanguíneas
(Cell Dyn® 1800 – Abbott Diagnostics). As análises coagulométricas foram
procedidas por método coagulométricos e cromogênicos, utilizando kit de
Diagnostico da Siemens (Thromborel S; ACTIN FSL; Dade® Fibrinogen
Determination Reagents, Antithrombin-Berichrom) realizadas no equipamento CA
1500 – Sysmex - Siemens Healthcare Diagnostics, segundo as orientações
sugeridas pelo fabricante dos reagentes.

3.4.1 Estudo da coagulação

3.4.1.1 Tempo de protrombina (TP/TAP)
Para a determinação do TP, foi utilizado o método de QUICK, o qual avalia a
recalcificação do plasma na presença de um excesso de fosfolípides
(tromboplastina). Considerando que a protrombina é convertida em trombina num
tempo uniforme, a recalcificação com quantidade conhecida de cloreto de cálcio
produz a coagulação do plasma. O TP é dependente do sistema extrínseco de
formação do complexo protrombínico (VII, V e X), da protrombina e fibrinogênio. O
TP/TAP é particularmente adequado para o diagnóstico de deficiências congênitas
de fatores do sistema extrínseco e deficiências adquiridas dos fatores da
coagulação; controle da atividade de síntese hepática em doenças do fígado.

3.4.1.2 Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA)
O teste de determinação do TTPA envolve a recalcificação do plasma, porém
em presença de cefalina proveniente de extrato etéreo de cérebro. A cefalina é uma
lipoproteína. Funciona como um substituto das plaquetas, fornecendo uma
concentração ótima de fosfolípidio. Dessa forma, as reações do sistema intrínseco
de coagulação são aceleradas. É considerado um teste de screening para detectar
anormalidades no sistema intrínseco da coagulação. Pode-se utilizar para
39

deficiências dos fatores II, V, VIII, IX, X, XI E XII, porém é insensível ao fator
plaquetário 3.

3.4.1.3 Dosagem de fibrinogênio
Para a dosagem de fibrinogênio, foi utilizado o método de Clauss (LOWE,
2004), que consiste em medir o tempo de coagulação do plasma em presença de
trombina concentrada. Quando há adição de trombina à amostra de plasma, o
fibrinogênio é convertido enzimaticamente em fibrina. A fibrina, por sua vez, por
polimerização, forma uma rede de fibrina. O fator XIII, ativado pela trombina, catalisa
a formação de ligações cruzadas estabilizadoras para produzir um coágulo visível.

3.4.1.4 Antitrombina
A antitrombina é o inibidor plasmático da trombina e do fator X ativado e
forma um complexo inativo irreversível com essas enzimas. A inativação dos fatores
de coagulação ativados é acelerada, em grande quantidade, pela heparina.
Berichrom* antitrombina serve para a determinação rápida da antitrombina
fisiologicamente ativa e permite o diagnóstico da deficiência de antitrombina
hereditária e adquirida, que representa um risco elevado de trombose.

3.4.2 Avaliação da função hepática
Demonstrou-se como de grande valor clínico a dosagem de várias enzimas
no soro para fins de avaliação do grau de disfunção hepatocelular no decurso de
doenças hepáticas. Baseia-se esse tipo de exame no conceito de que o achado no
soro de teores anormalmente elevados de enzimas intracelulares significa existir
alteração funcional ou orgânica das células que as contém, o que permite o
extravasamento das enzimas e sua passagem para o meio circulante. Como
marcadores da função hepática, foram utilizadas as enzimas alanina
aminotransferase, asparto aminotransferase, fosfatase alcalina e gama
glutamiltransferase, seguidas das dosagens de glicose e albumina.
40

A alanina aminotransferase (ALT) ou transaminase glutâmico-pirúvica
(GPT/TGP) é uma enzima encontrada predominantemente no fígado, em
concentração moderada nos rins e em menores quantidades no coração e nos
músculos esqueléticos. Na célula hepática, a ALT localiza-se no citoplasma (90%) e
na mitocôndria (10%). Qualquer injúria tissular ou doença afetando o parênquima
hepático liberará maior quantidade da enzima para a corrente sanguínea, elevando
os níveis séricos da ALT. Em geral, as causas mais comuns de elevação dos valores
de ALT, no sangue ocorrem por disfunção hepática. Desta maneira, a ALT além de
ser sensível, é também bastante específica para o diagnóstico de doença
hepatocelular.
A aspartato aminotransferase (AST) ou transaminase glutâmico-oxalacética
(GOT/TGO) é uma enzima encontrada em concentração muito alta no músculo
cardíaco, no fígado, músculos esqueléticos e em menor concentração nos rins e
pâncreas. Nas células hepáticas, a AST localiza-se no citoplasma (40%) e na
mitocôndria (60%). Qualquer lesão tissular ou doença afetando o parênquima
hepático liberará uma maior quantidade da enzima para o sangue circulante,
elevando os níveis séricos da AST. Sempre que ocorrer uma lesão hepatocelular de
qualquer etiologia, haverá uma grande liberação da enzima AST para a circulação
sanguínea, elevando seus níveis séricos.
A fosfatase alcalina (FA) compreende um grupo de enzimas fosfo-hidrolases
que apresentam atividade máxima em pH alcalino, próximo de 10. A enzima é
encontrada em vários tecidos, com maiores concentrações no fígado, no epitélio do
trato biliar e no osso. Também a mucosa intestinal e a placenta contêm também a
fosfatase alcalina.
A gama glutamiltransferase (GGT) é uma enzima encontrada
predominantemente nos hepatócitos, em menor concentração nos rins e, em
concentração bem menor, no epitélio do trato biliar, no intestino, coração, pâncreas,
baço e cérebro. A principal função dessa enzima é catalisar a transferência de
aminoácidos e peptídeos por meio das membranas celulares.

3.5 Cultura do lavado peritoneal
Logo após a coleta do sangue, os animais foram sacrificados por
deslocamento cervical, tendo sido coletado líquido da cavidade peritoneal para
realização de cultura microbiológica. Nos ratos que não apresentaram líquidos foram
injetados 5,0 mL de salina estéril na cavidade peritoneal, e, em seguida, retirados
4,0 mL do lavado e colocado em tubos estéreis e encaminhado ao Laboratório
Emilio Ribas, em Fortaleza-Ce, para análise microbiológica, onde foram semeados
para investigação e identificação de enterobactérias em meios Mac-Conkey e ágar-
sangue, seguido das provas bioquímicas para identificação da espécie bacteriana.

3.5.1 Avaliação do número de células na cavidade peritoneal
Uma parte do líquido peritoneal (1,0 mL) coletado de cada animal foi
encaminhada para a contagem global de leucócitos. Para contagem diferencial, o
fluido foi centrifugado (1000g, 10 min, 4°C) e removido o sobrenadante; foram feitos
esfregaços corados com MayGruwald-Giemsa e analisados sob microscopia óptica.

3.5.2 Medida da atividade enzimática da mieloperoxidase (MPO)
A atividade da enzima MPO, um marcador de infiltração de neutrófilos,
utilizada como indicativo da presença de leucócitos polimorfonucleares, foi avaliada
utilizando a metodologia de Bradley et al. (1982), com algumas modificações. As
amostras do líquido peritoneal foram centrifugadas e 0,1 mL dos sobrenadantes de
cada animal foram levados ao sonicador, em seguida, misturadas com 0,9 mL de
0,5% HTAB em tampão de fosfato de potássio. Em seguida, alíquotas de 30 µL
foram colocadas em placas de 96 poços, onde posteriormente foram adicionados
200 µL de solução contendo 0,9% de peróxido de hidrogênio e 0,52 mM de o–
dianisidina. A reação entre H2O2 e o–dianisidine é catalisada por MPO e gera uma
cor composta que é quantificada pelas medidas de absorbânciaem comprimento de
onda de 460 nm e representam o índice de atividade de MPO. Uma unidade de
actividade MPO foi definida como a que degrada 1,0 mmol de peróxido por minuto
em 25 oC. A atividade MPO foi expressa em unidades/mL.
42

3.6 Análise histológica
As amostras intestinais (n= 4 por grupo) foram constituídas de fragmentos de
intestino delgado com aproximadamente 15 cm, colhidos na margem anti-
mesentérica. As amostras colhidas foram imediatamente fixadas em solução de
formalina a 10% tamponada e, posteriormente, processada segundo técnicas
rotineiras de inclusão em parafina, cortadas em micrótomo em fragmento cinco
micrômetros cada fragmento, e coradas pela hematoxilina e eosina (HE). As lâminas
foram analisadas à microscopia óptica pelo patologista (Prof. Dr. Dalgimar
Menezes), que desconhecia a que grupo pertencia cada lâmina avaliada. Também
foram analisadas amostras do fígado e rim.

3.7 Exame histopatológico
Utilizou-se a classificação intestinal de Chiu e colaboradores (1970) com
modificações, para avaliar o grau de lesão tecidual. As alterações histopatológicas
do material avaliado foram pontuadas em uma escala de zero a três pontos,
conforme descrito no Quadro 2:

Quadro 2 – Classificação intestinal segundo Chiu e colaboradores (1970).
GRAU ACHADOS
0
Ausência de reação inflamatória, ulceração ou destruição tecidual.

1
Ligeira reação inflamatória, mas sem ulceração ou destruição tecidual.

2
Moderada infiltração inflamatória com destruição leve do tecido, vilosidades
e criptas, mas sem ulceração.

3
Intensa reação inflamatória, presença de ulceração e destruição tecidual
extensa.

Os resultados de todas as lâminas de cada grupo foram calculados para dar
uma nota final para os grupos, individualmente. Todos os estudos histológicos foram
realizados de forma que o patologista não tinha conhecimento prévio dos grupos
experimentais.

3.8 Avaliação da sobrevida (curva de sobrevivência)
Ratos machos adultos sadios foram divididos aleatoriamente em seis grupos
(n=06 para cada grupo) com pesos variando entre 150 e 220 g (p> 0,05). As doses
estabelecidas para a análise de sobrevivência foram as mesmas administradas no
tratamento das lesões induzidas pela indometacina: 5,0 mg/kg/dia v.o e 100 e 200
mg/kg/dia oral por gavagem de talidomida. O controle negativo foi representado
pelo tratamento por via oral com DMSO a 2%. Os animais foram observados
diariamente para o registro de sobrevida.

3.9 Análise estatística
A análise estatística foi realizada com auxílio do programa GraphPad Prism
5.0 (Intituitive Software for Science, San Diego, CA). Os resultados foram expressos
como a média ± erro-padrão da média (E.P.M.) ou mediana (mínimo-máximo). Foi
realizada análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Student Newman-
Keuls, para dados paramétricos, e teste de Kruskall-Wallis, seguido do teste de
Dunnett ou Mann-Whitney, para dados não paramétricos. Para a curva de
sobrevivência, foi usado o teste de Kaplan-Meyer e os resultados foram expressos
como média de dias de sobrevivência. Para a comparação entre curvas de
sobrevida, utilizou-se o teste de Long-Rank (qui-quadrado). As diferenças foram
consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05.

RREESSUULLTTAADDOOSS
45

4 RESULTADOS

4.1 Efeito do tratamento com talidomida em alterações hematológicas
sanguíneas e no líquido peritoneal induzidas pela Indometacina
O tratamento com indometacina (5,0 mg/kg) causou leucopenia (3,56 ± 0,44)
x 103 /mm3, diminuição da contagem de eritrócitos (4,94 ± 0,49) x106 /mm3, dosagem
de hemoglobina (9,15 ± 0,69 g/dL), hematócrito (28,34 ± 2,70%) e contagem de
leucócitos no liquído peritoneal (50,07 ± 13,54) x103 /mm3 quando comparados ao
gupo-controle, que apresentaram leucócitos de (5,93 ± 0,33) x103 /mm3, eritrócitos
(6,73 ± 0,09) x106/mm3, hemoglobina (13,83 ± 0,23 g/dL), hematócrito (37,47 ±
0,58%) e contagem de leucócitos no liquído peritoneal (0,85 ± 0,05) x103 /mm3. Não
houve, no entanto, alteração na contagem de plaquetas. As reduções produzidas por
indometacina foram atenuadas significativamente pela talidomida (100 e 200 mg/kg)
sem mostrarem dose-dependência. No líquido peritoneal, Pôde-se observar
aumento significativo no número de leucócitos em ratos tratados com indometacina
e diminuição após tratamento com talidomida (Tabela 1).

Tabela 1 - Efeito do tratamento com talidomida nas alterações hematológicas
induzidas pela indometacina.

PARÂMETROS CONTROLE

INDOMETACINA

TALIDOMIDA
INDOMETACINA
+
TALIDOMIDA
(100 mg/kg)
INDOMETACINA
+
TALIDOMIDA
(200mg/kg)
Leucócitos
(x 10
3
/mm
3
)
5,93 ± 0,33

3,56 ± 0,44
a

5.12 ± 0,36 8,17 ± 0,46
b
8,48 ± 1,02
b

Neutrófilos
(%)
30,41 ± 1,48 34,16 ± 3,03

34.75 ± 5,08 20,83 ± 2,32
b
21,08 ± 2,32
b

Linfócitos (%) 66,85 ±1,69

53,28 ± 5,07
a
60.01 ± 4,59

75,10 ± 3,36
b

76,78 ± 2,37
b

Hemácias (x
10
6
/mm
3
)
6, 73 ± 0,09

4,94 ± 0,49
a
6,72 ± 0,07

6,83 ± 0,38
b
6,38 ± 0,84
b

Hemoglobina
(g/dl)
13,83 ± 0,23

9,25 ± 0,69
a

14,11 ± 0,25

13,73 ± 0,68
b
13,00 ± 1,87
b

Hematócrito
(%)
37,47 ± 0,58

28,34 ± 2,70
a
37,62 ± 0,57

38,55 ± 1,76
b
39,68 ±1,54
b

Plaquetas (x
10
3
/mm
3
)

726,7 ± 28,4

802,3 ± 19,7 838,8 ± 60,3

756,8 ± 64,4

840,3 ± 94,6

Leucócitos
no líquido
peritoneal
(x 10
3
/mm
3
)
0,85 ± 0,05 50,07 ± 13,54
a
2,15 ± 1,07 9,15 ± 0,75
b
2,80 ± 1,10
b

Os valores representam média ± EPM. Os animais foram tratados durante cinco dias com
indometacina (5,0 mg/kg) e talidomida (100 e 200mg/kg) via oral.
a
vs controle,
b
vs indometacina; p
<0,05, ANOVA e teste de Student-Newman-Keuls. n= 4-8 / grupo.

4.2 Efeito da talidomida nas alterações dos parâmetros de coagulação
induzidas pela Indometacina
Nos parâmetros relacionados ao tempo de protrombina e tempo parcial de
tromboplastina ativada não revelaram diferença significativa. Por outro lado,
observam-se um pequeno aumento nos níveis de antitrombina no grupo da
indometacina (135,1 ± 2,3%) em relação ao grupo-controle (125,7 ± 12,7%), porém
esse aumento não foi significativo. Nos animais tratados com indometacina e
talidomida ou talidomida sozinha também não houve alteração significativa (Tabela
2).
47

Os animais tratados com indometacina (5,0 mg/kg, v.o, 5d) apresentaram um
aumento significativo (p<0,05) nos níveis de fibrinogênio (637,50 ± 13,2 mg/dL) em
relação ao grupo-controle (238,20 ± 11,6 mg/dL). O tratamento com talidomida 100,0
e 200 mg/kg impediu parcialmente esse aumento (381,80 ± 50,8 mg/dL e 389,30 ±
65,1 mg/dl), respectivamente (Tabela 2, Figura 7).

Tabela 2 - Efeito do tratamento com talidomida, nas alterações
coagulométricos induzidas pela indometacina

PARÂMETROS

CONTROLE

INDOMETACINA

TALIDOMIDA
INDOMETACINA
+
TALIDOMIDA
(100 mg/kg)
INDOMETACINA
+
TALIDOMIDA
(200 mg/kg)
Tempo de
protrombina
(TAP) seg.

16,89 ± 0,48

15,50 ± 0,44

16,51 ± 0,40

15,68 ± 0.39

15,40 ± 0,62

Tempo de
tromboplastina
parcial ativada
(TTPa) seg.

22,16 ± 0,26

21,48 ± 0,31

22,63 ± 0,34

24,48 ± 0,41

23,18 ± 0,86

Antitrombina
(%)
125,0 ± 12,7 135,1 ± 12,3

120,6 ± 13,0 132,8 ± 9.8

126,8 ±10,5

Fibrinogênio
(mg/dl)
238,2 ± 11,6

637,5 ± 13,2
a

246,0 ± 9,6 381,8 ± 50,8
b

389,3 ± 65,1
b

Os valores representam média ± EPM. Os animais foram tratados durante cinco dias com
indometacina (5,0 mg/kg) e talidomida (100 e 200 mg/kg) via oral.
a
vs controle,
bvs indometacina; p
<0,05, ANOVA e teste de Student-Newman-Keuls. n= 4-8 / grupo.

Figura 7 - Efeito da indometacina sobre os níveis de fibrinogênio plasmático. Os valores
representam média ± EPM. Os animais foram tratados durante cinco dias com indometacina
(5,0 mg/kg) e talidomida (100 e 200 mg/kg) via oral.
a
vs controle, b vs indometacina; p <
0,05, ANOVA e teste de Student-Newman-Keuls. n= 4-8 / grupo.

Fonte: Elaborado pelo autor
0
100
200
300
400
500
600
700 a
b b
TAL 200mg/kg
Controle v.o
INDO 5,0 mg/kg
INDO+TAL100mg/kg
INDO+TAL200 mg/kg
Fi
br
in
og
ên
io
(
m
g/
dl
)
48

4.3 Efeito do tratamento com talidomida nas alterações bioquímicas induzidas
por Indometacina
A tabela 3 mostra que os animais tratados com indometacina (5,0 mg/kg, v.o.,
5 d) tiveram um aumento significante (p< 0,05) na AST (116,30 ± 7,4 U/L), fosfatase
alcalina (688,60 ± 81,9 U/L) e GGT (7,13 ± 0,7 g/dL), e diminuição nos níveis de
albumina (2,38 ± 0,21g/dL) e glicose (68,44 ± 5,3 mg/dL) em relação ao grupo
controle (AST- 93,33 ± 2,0 U/L, FAL- 257,70 ± 7,5 U/L, GGT- 4,24 ± 0,4 g/dL). O
tratamento com talidomida reverteu essas alterações a níveis muito próximos do
controle. Não foram observadas alterações nos níveis de ureia e creatinina nos
grupos estudados (Tabela 3)

Tabela 3. Efeito do tratamento com a talidomida nas alterações bioquímicas
induzidas por indometacina em ratos.

Parâmetro

controle

indometacina

talidomida
indometacina
+
talidomida
(100 mg/kg)
indometacina
+
talidomida
(200 mg/kg)

ALT
(U/L)

59,8 ± 3,2

32,9 ± 3,3

52,3 ± 2,9

36,0 ± 4,6

39,0 ± 2,7

AST
(U/L)

93,3 ± 2,0

116,3 ± 7,4
a

90,7 ± 1,9

93,5 ± 3,7
b

94,7 ± 2,5
b

FAL
(U/L)

257,7 ± 7,5

688,6 ± 81,9
a

283,5 ± 15,6
b

366,3 ± 40,4
b

395,4 ± 69,1
b

GGT
g/dL
4,2 ± 0,4

7,1 ± 0,7
a

4,5 ± 0,4

5,0 ± 0,3
b

4,8 ± 0,6
b

glicose
mg/dl
97,7 ± 3,2 68,4 ± 5,3
a
84,4 ±1,5 83,8 ± 3,1
b
98,4 ± 6,6
b

creatinina 0,46 ± 0,03 0,60 ± 0,06 0,51 ± 0,07 0,58 ± 0,01

0,41 ± 0,01
mg/dl

ureia 34,7 ± 1,9

32,7 ± 0,8

30,7 ± 0,6

31,5 ± 1,3

31,7 ± 2,0
mg/dl

albumina
g/dl

3,04 ± 0,21

2,38 ± 0,03
a

3,25 ± 0,10

3,33 ± 0,08
b

3,35 ± 0,25
b

Os valores representam média ± EPM. Os animais foram tratados durante cinco dias por
gavagem. ALT: alanina aminotransferase, AST: aspartato aminotransferase, FAL: fosfatase
alcalina. GGT-gama glutamil transpeptidase. a vs controle; b vs indometacina (p< 0,05,
ANOVA, teste de Student-Newman-Keuls). n= 4-8/grupo.

4.4 Estudo microbiológico do lavado peritoneal nos animais tratados com
indometacina, talidomida e ampicilina
Todas as amostras no grupo que recebeu indometacina (5,0 mg/kg, v.o.; 5 d)
foram positivas para pesquisa de enterobactérias (100%), enquanto no grupo que
recebeu indometacina mais talidomida 100,0 ou 200,0mg/kg apresentaram 33,3% e
16,7% respectivamente das culturas positivas, mostrando com isso a presença de
bactérias do trato gastrintestinal na cavidade peritoneal. A associação da talidomida
nas doses de 100 e 200mg/kg à indometacina mostrou diminuição e/ou ausência de
bactérias na cavidade peritoneal.
Nos animais do grupo que receberam indometacina e foram tratados com
ampicilina não houve crescimento bacteriano (Tabela 4).
Tabela 4 - Estudo microbiológico do lavado peritoneal nos animais tratados com
indometacina, talidomida e ampicilina
Grupos
(n=6)
Bactérias UFC/ml
E.coli K. pneumoniae Enterococcus sp P. aeruginosa

Controle (0/8)

__ __ __ __
Indo 5,0 mg/kg (4/8)

100.000

40.000

30.000
Indo+Tal
(5,0mg/kg+100
mg/kg)
(3/8)

80.000
_

5.000
__
Indo +Tal
(5,0mg/kg+200
mg/kg)
(2/8)
__

100.000
a

__ __

Indo +Amp
(5,0mg/kg+200
mg/kg)
(0/8)
__ __ __ __
Tal 200 mg/kg
(0/8)
__ __ __ __

Amp. 200mg/kg
(0/8)
__ __ __ __
No 5º dia de tratamento, os animais do grupo-controle e tratados foram submetidos à
lavagem peritoneal e retirada do líquido para a realização da cultura. Os resultados estão
expressos em cultura positiva/animais por grupo. Os números entre parenteses representam
o número de culturas positivas em relação ao nº total de animais. Ampicilina (Amp);
indometacina (Indo); talidomida (Tal). UFC= unidade formadora de colonia.
50

4.5 Efeito da talidomida sobre a atividade da mieloperoxidase (MPO) no líquido
peritoneal em animais tratados com indometacina
Investigou-se o efeito da talidomida sobre a infiltração de neutrófilos por meio
da avaliação da atividade da MPO. A atividade da MPO no líquido peritoneal dos
ratos que receberam indometacina (5,0 mg/kg, v.o, 5d) foi significativamente maior
(1217 ± 341,4 U/mL) quando comparada com o grupo-controle (3,33 ± 3,33 U/mL). O
tratamento com talidomida (100 e 200 mg / kg, v.o, 5d) reduziu significativamente (p
<0,05) este aumento (375,8 ± 149,1 U/mL) (Figura 9), sendo a inibição de 69,2%
(Figura 8).
Figura 8 - Efeito da talidomida sobre os níveis de mieloperoxidase no líquido peritoneal de
ratos tratados com indometacina. Os valores representam média ± EPM. Os animais foram
tratados durante cinco dias com indometacina (5,0 mg/kg) e talidomida (200 mg/kg) via oral.

a vs controle, b vs indometacina; p <0,05, ANOVA e teste de Student-Newman-Keuls. n= 4-8
/ grupo.

C
on
tr
ol
e
In
do
Ta
l 2
00
In
do
+
T
al
2
00
0
2.5 10 2
5.0 10 2
7.5 10 2
1.0 10 3
1.3 10 3
1.5 10 3
1.8 10 3
a
b
M
P
O
(
U
/m
L
)

Fonte: Elaborado pelo autor

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51

4.6 Efeito da talidomida sobre a lesão intestinal induzida pela indometacina –
avaliação macroscópica
Os animais tratados com indometacina apresentaram líquido na cavidade
peritoneal, aderências teciduais a múltiplos órgãos, hemorragia e presença de uma
malha de fibrina sobre as vísceras abdominais (Figuras 9C, 9D, 9E), o que não foi
observado nos animais do grupo-controle (Figuras 9A, 9B). Observou-se que a
talidomida foi capaz de inibir as principais alterações vistas na cavidade peritoneal
dos ratos tratados com indometacina (Figura 9F).

Figura 9 - Efeito da talidomida sobre a lesão intestinal induzida pela indometacina –
avaliação macroscópica (A) controle); (B) talidomida 200 mg/kg, v.o., 5 dias) (C, D, E)
Indometacina (5,0 mg/kg, v.o., 5 dias), (F) – indometacina + talidomida (200 mg/kg). Setas
vermelhas fibrina e perfuração intestinal, seta branca (líquido peritoneal).

Fonte: Elaborado pelo autor.
A B
C D
E F
52

4.7 Efeito da talidomida sobre o dano intestinal induzido pela Indometacina-
avaliação histológica
As figuras 10C e 10D mostram o efeito do tratamento com indometacina
sobre o epitélio intestinal. Observam-se um grande infiltrado inflamatório (neutrófilos,
e eosinófilos), ulceração, edema e destruição das criptas e vilos. Foram vistas
também células em processo de apoptose e necrose. A talidomida (200 mg/kg) foi
capaz de proteger os animais de forma significante (p<0,05) do dano tecidual
induzido pela indometacina (Figuras 10E, 10F, Tabela 5).
Não foram observadas lesões no fígado ou rim nos grupos estudados (dados
não mostrados).

Tabela 5 - Efeito do tratamento com a talidomida no dano intestinal induzido por
indometacina em ratos.

Grupo Scores
controle 0 (0-1)
indometacina 3 (2-3) a
indometacina 5mg/kg +talidomida 100mg/kg 1 (1-1) b
indometacina 5mg/kg +talidomida 200mg/kg 1 (0-1) b
As medianas dos escores com intervalos (mín-máx) dos resultados em cinco animais em
cada grupo. Os escores de lesão foram avaliados como descrito por Chiu e colaboradores
(1970). Ver materiais e métodos. a vs controle, b