Papel das Cininas na Proliferação de Fibroblastos

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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ANA JULIA VON BORELL DU VERNAY FRANÇA 
 
 
 
 
 
O PAPEL DAS CININAS E A INFLUÊNCIA DO FATOR DE NECROSE 
TUMORAL (TNF) NA PROLIFERAÇÃO IN VITRO DE FIBROBLASTOS 
L929 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Itajaí 
2015 
 
 
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS 
FARMACÊUTICAS 
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E 
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS 
 
 
 
 
ANA JULIA VON BORELL DU VERNAY FRANÇA 
 
 
 
 
O PAPEL DAS CININAS E A INFLUÊNCIA DO FATOR DE NECROSE 
TUMORAL (TNF) NA PROLIFERAÇÃO IN VITRO DE FIBROBLASTOS 
L929 
 
 
 
 
 
 
Dissertação submetida à Universidade do Vale do 
Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do 
grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. 
 
 
Orientadora: Profa. Dra. Nara Lins Meira Quintão 
Co-orientador: Prof. Dr. José Roberto Santin 
 
 
 
 
Itajaí, Maio de 2015 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedico ao meu ao pai Helcio von Borel du Vernay 
o qual me ensinou logo cedo que a vida dependia 
de mim e de tudo que eu pudesse carregar comigo 
mesma. Ajudou-me a entender a importância de 
se criar raízes fortes para fortalecer os frutos. 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Agradeço profundamente às minhas filhas; Laura e Clara as quais mudaram de 
escola, mudaram suas rotinas, me acompanharam e me apoiaram em todos os 
momentos deste trabalho. Doaram espontaneamente o tempo e os momentos 
que seriam delas para que eu pudesse chegar até o fim. 
Agradeço ao meu marido, Orlando, pelo incansável apoio emocional me 
mantendo no centro para que o objetivo fosse concluído. Foi pai, mãe, 
conselheiro e revisor de todos os cálculos de diluição deste trabalho. 
À minha mãe, irmãos e a querida Laís pelas constantes palavras de apoio. 
À minha colega Gislaine “Gi” pelo companheirismo de as horas, por treinar-me 
e passar todo o seu conhecimento para que eu pudesse trabalhar com o 
cultivo celular. 
Á técnica Viviane pela amizade, força e por cuidar para que tudo estivesse 
sempre impecável no laboratório de cultivo. 
Aos colegas de laboratório pelo apoio, amizade conquistada e pela constante 
troca de conhecimento. 
Às professoras Caroline Valente e Kathryn pelo conhecimento e ajuda 
prestada. 
À minha orientadora Nara por transmitir mesmo de longe a confiança e o 
conhecimento necessário para que eu chegasse até aqui. 
Ao meu co-orientador José Roberto, por aceitar o desafio no meio do caminho, 
por ter estado sempre disponível, transmitindo o seu conhecimento e me 
apoiando nos momentos mais difíceis. 
 
 
O PAPEL DAS CININAS E A INFLUÊNCIA DO FATOR DE NECROSE 
TUMORAL (TNF) NA PROLIFERAÇÃO IN VITRO DE FIBROBLASTOS 
L929 
 
Ana Júlia von Borell du Vernay França 
Maio/2015 
 
Orientadora: Nara Lins Meira Quintão, Doutora. 
Co-orientador: José Roberto Santin, Doutor. 
 
Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas 
Número de Páginas: 83 
 
A barreira da pele desempenha um papel importante na manutenção da homeostase do ser humano e 
o processo de reparo do tecido cutâneo é considerado um fator crítico. Embora o papel de cininas como 
um importante mediador da inflamação seja bem descrito, o seu envolvimento no reparo tecidual ainda 
não foi totalmente explorado. A proliferação de fibroblastos é um evento chave na cicatrização do 
tecido, uma vez que participa diretamente na formação de tecido de granulação. Modelos in vitro para 
a avaliação da cicatrização por proliferação de fibroblastos são amplamente utilizados, no entanto eles 
não foram avaliados na presença de fatores inflamatórios importantes, tais como as citocinas e as 
cininas. Na tentativa de aproximar o modelo in vitro das condições reais de lesão cutânea com a 
evidência de um processo inflamatório, este estudo avalia a co-participação do TNF e das cininas sobre 
a proliferação de fibroblastos através do modelo in vitro de estresse mecânico em monocamada de 
fibroblastos L929 com o objetivo de propor uma nova metodologia para estudo in vitro de cicatrização 
cutânea. Para este estudo realizou-se um rasgo em cultura de monocamada de fibroblastos murino 
(L929), na presença ou ausência de TNF (droga utilizada para gerar o estresse celular semelhante ao 
processo inflamatório inicial) e / ou agonistas do receptor de cinina B1 e B2. Os resultados obtidos 
inicialmente com TNF demonstram que esta citocina foi capaz de aumentar a proliferação celular, a 
qual foi bloqueada com o co-tratamento com o respectivo anticorpo, sugerindo a importância dos 
estímulos inflamatórios para o processo de regeneração tecidual. As cininas parecem potencializar este 
efeito proliferativo exercido pelo TNF, principalmente através da ativação do receptor B2. No entanto, 
para confirmar esta hipótese novos experimentos são necessários para analisar a expressão dos 
respectivos receptores em células tratadas ou não com TNF, BK e DABK. Os resultados obtidos no 
presente trabalho em conjunto com dados da literatura, mostraram que esta estratégia é uma 
ferramenta disponível para a investigação do processo de cicatrização in vitro. 
 
Palavras-chave: Cininas. Fibroblastos. Receptor B1 e B2 para cininas. Reparo 
tecidual. 
 
THE ROLE OF A KININS AND THE INFLUENCE OF TUMOR 
NECROSIS FACTOR ALFA (TNF-α) ON IN VITRO PROLIFERATION 
OF L929 FIBROBLASTS 
 
Ana Júlia von Borell du Vernay França 
May /2015 
 
Supervisor: Nara Lins Meira Quintão, PhD. 
 
Co-Supervisor: José Roberto Santin, PhD. 
 
Area of Concentration: Natural products and bioactive synthetic substances 
Number of pages: 83 
 
 
The skin barrier plays an important role in maintaining homeostasis of the human 
being, and the cutaneous tissue repair process is considered a critical factor. Although 
the role of kinins as important mediators of inflammation is well described, their 
involvement in tissue repair has not been fully explored. Fibroblast proliferation is a 
key event in healing, as it participates directly in the formation of granulation tissue. In 
vitro models for the evaluation of healing by fibroblast proliferation are widely used, 
however, they have not been evaluated in the presence of important inflammatory 
factors, such as cytokines and kinins. Seeking to bring the in vitro model closer to the 
real conditions of skin injury with the evidence of inflammatory process, this study 
evaluates the effect of kinins on the proliferation of murine fibroblasts, stimulated or 
not by tumor necrosis factor (TNF), with the aim of proposing a new methodology for 
in vitro wound healing study. The Scratch Assay was used, in a monolayer culture of 
murine fibroblasts (L929), in the presence or absence of TNF (drug used to generate 
cellular stress similar to the initial inflammatory process) and/or the kinin receptor 
agonists B1 and B2. Based on the results obtained with the cytokine TNF, which was 
capable of increasing the cell proliferation that was successfully blocked by co-
treatment with the respective antibody, the importance of inflammatory stimuli for 
tissue regeneration is suggested. Kinins appear to potentiate this proliferative effect 
exerted by TNF, mainly through the activation of the B2 kinin receptor. However, to 
confirm this hypothesis, new experiments are necessary, to analyze the respective 
receptor expression in cells treated or not with TNF, BK and DABK. These results, 
together with the literature data, show this strategy as an available tool for the in vitro 
healing investigation. 
 
Keywords: kinins, fibroblasts, B1 and B2 receptors, wound healing 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1 Camadas da pele 
 
19 
Figura 2 Anatomia da pele humana e efetores celulares 
 
21 
Figura 3 Linha do tempo de migração de populações de células 
imunitárias correlacionadas com as fases de cicatrização de 
feridas 
 
 
 
23 
Figura 4 Cascata de formação das Cininas 
 
31Figura 5 Modelo de placa com 24 poços para cultivo celular 
 
38 
Figura 6 Modelo de Scratch wound “in vitro” 
 
39 
Figura 7 Esquema do procedimento In vitro de “Scratch model” 
 
39 
Figura 8 Esquema de tratamento das células com TNF em diferentes 
tempos de contato 
 
 
40 
Figura 9 Esquema de tratamento das células com agonista receptor 
B2 (BK) em diferentes concentrações 
 
 
41 
Figura 10 Esquema de tratamento das células com agonista receptor 
B1 (DABK) em diferentes concentrações. 
 
 
41 
Figura 11 Esquema de tratamento com o agonista do receptor B2, BK, 
em células pré tratadas com TNF 
 
 
42 
Figura 12 Esquema do tratamento com o agonista do receptor B1, 
DABK, em células pré tratadas com TNF. 
 
 
43 
Figura 13 Esquema do tratamento com os antagonistas do receptor B1 
e B2, anticorpo anti TNF e PDTC, administrados após o pré 
tratamento com TNF 
 
 
44 
Figura 14 Esquema do tratamento com os agonistas do receptor B1 e 
B2 pré tratadas ou não com o TNF e coadministradas ou 
não com o anticorpo anti TNF 
 
 
45 
Figura 15 Imagens da monocamada de fibroblastos L929 antes e após 
o ensaio de Scratch 
 
 
47 
 
Figura 16 Efeito do tratamento com TNF sobre a proliferação de 
fibroblastos quando incubados por diferentes tempos com 
TNF 
 
 
 
48 
Figura 17 Efeitos do tratamento com BK em diferentes concentrações 
na proliferação de fibroblastos, sem o estímulo do pré-
tratamento com o TNF 
 
 
50 
Figura 18 Efeitos do tratamento com DABK em diferentes 
concentrações na proliferação de fibroblastos, sem o 
estímulo do pré tratamento com o TNF 
 
 
 
51 
Figura 19 Efeitos do tratamento com BK em diferentes concentrações 
na proliferação de fibroblastos, com o estímulo do pré-
tratamento com o TNF 
 
 
52 
Figura 20 Efeitos do tratamento com DABK em diferentes 
concentrações na proliferação de fibroblastos, com pré 
estímulo do TNF 
 
 
 
53 
Figura 21 Imagem da proliferação celular com tratamento de TNF e 
dos agonistas dos receptores cininérgicos , BK e DABK, 
sem e com o pré estímulo do TNF 
 
 
 
54 
Figura 22 Efeito dos antagonistas cininérgicos sobre a proliferação de 
fibroblastos L929 induzida pelo TNF e pelas cininas com pré 
estímulo do TNF 
 
 
56 
Figura 23 Influência dos receptores cininérgicos e a participação do 
TNF na proliferação de fibroblastos L929 
 
58 
 
Figura 24 Imagem do efeito do tratamento as células com o anticorpo 
anti TNF em coadministração com TNF e desafiadas com 
os agonistas BK e DABK com sem a presença dos 
antagonistas cininérgicos HOE-140 e DALBK 
 
 
 
59 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
 
α-SMA - α-actina de músculo liso 
AMPc - Monofosfato cíclico de adenosina 
ANOVA - Análise de variância 
APP - Aminopeptidase P 
BK - Bradicinina 
COM - carboxipeptidases M cinenase I de membrana 
CPN - carboxipeptidases N cinenase I do plasma 
DABK - des-Arg9-Bradicinina 
DALBK - Leu8-des-Arg9-Bradicinina 
DC - Células dendrítica 
DMEM - Meio Eagle Modificado por Dulbecco 
DMSO - Dimetilsulfóxido 
EGF - Fator de crescimento epidérmico 
ECA - Cininase II, enzima conversora de angiotensina I 
FGF - Fator de crescimento fibroblástico 
ERK 1/2 - Kinase regulada por sinais intracelulares 
GMPC - Monofosfato cíclico de guanosina 
HMWK - Cininogênio de alto peso molecular 
IL-1α, IL-1β, IL- 10 Interleucinas 
LMWK - Cininogênio de baixo peso molecular 
LPS - Lipopolissacarídeo de membrana 
Lys-BK - Calidina 
MAPK - Proteínas quinases ativadas por mitógenos 
MMP-1-13; MT1 Metalaproteinases 
NF- kB - Fator de transcrição nuclear Kappa B 
NEP - Endopeptidase neural 
NO - Óxido nítrico 
RNAm - RNA mensageiro 
PAF - Fator de agregação plaquetária 
PDTC - Pirrolidina ditiocarbamato 
PBS - Solução de tampão fosfato 
 
PDGF - Fator de crescimento derivado das plaquetas 
PGE2 Prostaglandina E2 
PKC - Proteína quinase C 
SFB – Soro fetal bovino 
TGF-β - Fator de crescimento transformador β 
TGF-α - Fator de crescimento transformador α 
TNF - Fator de necrose tumoral 
TNFRI - Receptor I de fator de necrose tumoral 
TNFRII - Receptor II de fator de necrose tumoral 
VEGF - Fator de crescimento de células endoteliais 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
 DADOS DE IDENTIFICAÇÃO 
1 INTRODUÇÂO.............................................................................. 14 
2 OBJETIVOS................................................................................... 17 
2.1 Objetivo Geral................................................................................ 17 
2.2 Objetivos Específicos..................................................................... 17 
3 REVISÃO DA LITERATURA......................................................... 18 
3.1 Anatomia e fisiologia da pele......................................................... 18 
3.2 Fisiologia e farmacologia do reparo tecidual ................................ 22 
3.3 Cininas .......................................................................................... 29 
4 MATERIAL E MÉTODOS............................................................. 37 
4.1 Materiais........................................................................................ 37 
4.1.1 Linhagem celular ...................................................................... 37 
4.1.2 Condições de cultivo...................................................................... 37 
4.2 Métodos.......................................................................................... 37 
4.2.1 Avaliação da proliferação celular .................................................. 37 
4.2.1.1 Preparo da placa de cultivo........................................................... 37 
4.2.2 Ensaio de Scratch in vitro.............................................................. 38 
4.2.3 Avaliação da proliferação celular em fibroblastos tratados com 
TNF............................................................................................. 
 
40 
4.2.4 Avaliação do papel das cininas na proliferação celular em 
fibroblastos .................................................................................... 
 
41 
4.2.5 Avaliação do papel das cininas na proliferação celular em 
fibroblastos pré tratados com TNF............................................. 
 
42 
4.2.6 Efeito dos antagonistas cininérgicos sobre a proliferação de 
fibroblastos L929 induzida pelo TNF e pelas cininas com pré 
estímulo do TNF.................................................................... 
 
 
43 
4.2.7 Avaliação do efeito das cininas na proliferação celular em 
fibroblastos pré tratados ou não com TNF em coadministração 
ou não do anticorpo anti TNF....................... 
 
 
45 
4.3 Análise de dados e apresentação dos resultados......................... 46 
4.4 Análise estatística.......................................................................... 47 
 
5.0 RESULTADOS.............................................................................. 48 
5.1 Efeito do TNF na proliferação de fibroblastos ............................ 48 
5.2 Efeitos do tratamento com BK em diferentes concentrações na 
proliferação de fibroblastos, com e sem estímulo do TNF ......... 
 
49 
5.2.1. Influência da administração de agonistas do receptor de cininas 
na proliferação de fibroblastos L929 quando administrados 
sozinhos...................................................................................... 
 
49 
 
5.2.2 Influência da administração de agonistas do receptor de cininas 
na proliferação de fibroblastos L929 quando administrados após 
células pré tratadas com TNF................................................ 
 
51 
 
5.2.3 Efeito dos antagonistas cininérgicos sobre a proliferação de 
fibroblastos L929 induzida pelo TNF e pelas cininas com pré 
estímulo do TNF 
 
55 
 
5.2.4 Influência dos receptores cininérgicos e a participaçãodo TNF 
na proliferação de fibroblastos L929........................................... 
57 
 
6 DISCUSSÃO................................................................................ 60 
 
7 CONCLUSÕES 72 
 REFERÊNCIAS............................................................................ 74 
 
14 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
A pele é um órgão que apresenta múltiplas funções, atuando principalmente 
como barreira contra agentes patogênicos, prevenindo a desidratação e mantendo-se 
como fronteira entre o meio interno e externo do organismo. A barreira cutânea 
desempenha importante papel na manutenção da homeostase do organismo, desta 
forma o processo de reparo tecidual cutâneo é um fator crítico relacionado à sua 
sobrevivência (LAU, 2009). 
Danos ao tecido epitelial desencadeiam uma série de eventos que envolvem a 
quimiotaxia de células inflamatórias, divisão celular, neovascularização e síntese de 
matriz extracelular. A ação coordenada destes eventos culmina com a formação e 
remodelação do tecido lesado (ENOCH; LEAPER, 2008). 
Muitos tipos celulares, incluindo macrófagos, neutrófilos, plaquetas, células 
endoteliais, queratinócitos e fibroblastos contribuem para a cicatrização de feridas. 
Tendo início imediatamente após a lesão, a resposta inflamatória leva à secreção de 
uma variedade de fatores de crescimento e citocinas, que comandam os movimentos 
celulares e teciduais necessários para o reparo (MONACO; LAWRENCE, 2003). 
O processo de reparo tecidual é classicamente organizado em uma progressão 
de etapas sobrepostas e ao avalia-lo desta forma, como uma sequência de eventos 
distintos, pode-se propor que a inflamação se caracterize como uma fase circunscrita, 
o que sugere o fim de seus efeitos com o início da próxima etapa. Compreensões mais 
atuais, no entanto, sugerem que a inflamação persista por todas as fases da 
cicatrização, estimulando e coordenando as funções essenciais do processo, através 
da produção e controle de seus mediadores. Embora a inflamação seja reconhecida 
como um dos primeiros eventos, a compreensão de sua importância e seu papel 
regulador neste processo ainda é gradual (HENRY; GARNER, 2003, YUSSOF et al., 
2012) 
Estudos experimentais relacionam a inflamação como um processo essencial 
para o restabelecimento da homeostase cutânea após uma lesão. Ao longo dos 
últimos anos vários trabalhos têm demonstrado a ação de diferentes células e 
mediadores químicos no mecanismo de reparo tecidual. No entanto, vários estudos 
também vêm discutindo o papel da inflamação no aumento do tempo de cicatrização 
e na formação de cicatrizes. Desta forma, a compreensão mais detalhada dos 
15 
 
mecanismos que controlam a resposta inflamatória e o processo de resolução da 
inflamação pode ser útil para avanços na terapia de reparação de tecidos (EMING; 
KRIEG; DAVIDSON, 2007, KYRITSIS et al.,2012, SATISH; KATHJU, 2010) 
O início da cascata inflamatória se dá geralmente logo após a lesão tecidual 
pela liberação do fator de necrose tumoral (TNF), uma citocina pró-inflamatória 
produzida por macrófagos e neutrófilos ativados em resposta a patógenos e a outros 
estímulos nocivos. Esta citocina exerce funções pleiotrópicas em condições 
fisiológicas e patológicas ao ligar-se aos seus receptores tipo I (TNFRI) ou tipo II 
(TNFRII) (PARK; BARBUL, 2004). 
O TNF tem demonstrado participar diretamente da angiogênese e induzir a 
síntese do fator de crescimento transformador beta (TGF-β), podendo interferir na 
proliferação de fibroblastos, um componente essencial no processo de cicatrização 
normal (FAHEY et al., 1990). Além disso, induz a biossíntese de vários outros 
mediadores inflamatórios, incluindo a interleucina 1 (IL-1) e as cininas, que em sinergia 
podem aumentar os seus efeitos (FAHEY et al., 1990; SOUZA et al., 2013). 
Schremmer-Danninger e colaboradores (2004) descreveram a ação das cininas 
nos processos pró-inflamatórios e de resolução. As cininas são peptídeos que 
exercem atividade mitogênica, ou seja, proliferativa em diferentes sistemas tissulares 
(REGOLI; BARABÉ, 1980). Em condições normais, formas imunoreativas de 
cininogênio já foram localizadas no espaço intersticial entre os queratinócitos, sendo 
provável o conceito de que as cininas são produzidas por estas células (YAMAMOTO 
et al., 1987). A expressão de ambos os receptores cininérgicos B1 e B2 já foi 
evidenciada no tecido cutâneo em condições normais, bem como em biopsia de pele 
humana (SCHREMMER- DANNINGER et al., 1999). 
Apesar do papel das cininas como importantes mediadores da inflamação ser 
amplamente descrito, seu papel no reparo tecidual cutâneo ainda não foi 
completamente explorado. Tendo em vista que a migração e proliferação de 
fibroblastos e remodelação tecidual são evento centrais no processo de cicatrização 
e que o TNF e mediadores inflamatórios como as cininas já demonstraram atuar direta 
ou indiretamentente nesta proliferação celular, este estudo teve como objetivo avaliar 
a co-participação do TNF e das cininas sobre a proliferação de fibroblastos através do 
modelo in vitro de estresse mecânico em monocamada de fibroblastos L929, afim de 
aproximar o modelo “in vitro “das condições reais de lesão cutânea com presença de 
um processo inflamatório. 
http://www.sciencemag.org/search?author1=Nikos+Kyritsis&sortspec=date&submit=Submit
16 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
2 OBJETIVOS 
 
2.1 Objetivo Geral: 
 
Avaliar a co-participação do TNF e das cininas sobre a proliferação de 
fibroblastos através do modelo in vitro de estresse mecânico em monocamada de 
fibroblastos L929, afim de obter um modelo “in vitro” com características próximas das 
alterações inflamatórias reais de lesões cutâneas. 
 
2.2 Objetivos Específicos: 
 
1. Padronizar o modelo de reparo tecidual in vitro descrito como “scratch assay” em 
monocamada de fibroblastos murino L929 estimulados com TNF. 
 
2. Avaliar o envolvimento dos receptores cininérgicos na proliferação de fibroblastos 
L929 induzida pelo TNF através do emprego de anatagonistas seletivos para estes 
receptores. 
 
3. Avaliar o papel dos receptores B1 e B2 das cininas na proliferação de fibroblastos 
pré-tratados ou não com TNF por meio da utilização de agonistas e antagonistas 
seletivos. 
 
4. Avaliar a co-participação do TNF nos efeitos promovidos pelas cninas sobre a 
proliferação de fibroblastos L929 através do emprego do anticorpo anti TNF. 
18 
 
3 REVISÃO DA LITERATURA 
 
 
3.1 Anatomia e fisiologia da pele 
 
A pele corresponde a 15% do peso corporal, sendo assim considerada o maior 
órgão do ser humano. Por recobrir toda a área corporal, envolvendo-o por inteiro e 
delimitando o organismo, a mesma confere proteção e interação com o meio externo. 
Este órgão forma uma barreira física contra agressões do meio externo para com os 
demais órgãos e constituintes do corpo humano assumindo assim a função maior e 
vital, a conservação da homeostasia. Para desempenhar tal papel, apresenta 
características dinâmicas, sofrendo alterações constantes, sendo dotada de 
capacidade renovadora e de reparação (HARRIS, 2009). 
A pele é composta por duas camadas principais; a epiderme e a derme. A 
epiderme é o compartimento exterior, sendo composta por quatro diferentes camadas: 
estrato basal, estrato espinhoso, estrato granuloso e estrato córneo (Figura 1). O 
estrato basal é o mais profundo, responsável pela constante renovação das células 
da epiderme. Contém uma linha de células indiferenciadas conhecidas como 
queratinócitos basais, os quais se dividem com frequência. Estes se diferenciam e 
passam para o estrato seguinte, o espinhoso, para iniciar um processo de maturação, 
mas também se dividem para repor a camada basal. As células que se movem no 
estrato espinhoso modificam sua morfologia e passam de colunar para a forma 
poligonal e começama sintetizar queratina. Na sequência, em direção a superfície, é 
formada a camada granulosa composta de queratinócitos do estrato granuloso, 
caracterizados por manchas escuras do material citoplasmático e pela intensa 
produção de queratina e lipídios. O estrato córneo, como o último produto dos 
queratinócitos, é o mais externo da epiderme, e reconhecidamente, o principal 
responsável pela função de barreira protetora da pele. As células que compõe esta 
camada são conhecidas como corneócitos, células derivadas de queratinócitos mortos 
desprovidos de organelas. Os corneócitos são os responsáveis por barrar diversos 
agentes tóxicos, como por exemplo substâncias químicas e microrganismos, atuando 
desta forma como a primeira barreira do sistema imune inato. Ainda, os mesmos 
atuam impedindo a desidratação da pele (NESTLE; MEGLIO; QIN; NICKOLOFF, 
2009, PROKSCH; BRANDNER; JENSEN, 2008, GNIADECKI, 1998). 
19 
 
 
Figura 1 – Camadas da pele 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A pele humana apresenta uma epiderme espessa com várias camadas de células que se diferenciam 
formando seus estrato. Abaixo da epiderme está localizada a derme uma camada de tecido conjuntivo 
caracterizada pelas projeções das cristas epidérmicas, observa-se a presença de glândula sebácea, 
vasos linfáticos e sanguíneos assim como células do sistema imune como os macrófagos. Fonte: 
Adaptado de Pasparakis; Haase; Nestle, (2014). 
 
Adicionalmente, a epiderme possui células especializadas, como melanócitos, 
responsáveis pela produção de melanina, e células de Langerhans, responsáveis pela 
imunovigilância do tecido cutâneo, sendo assim as principais células residentes do 
sistema imunológico da pele (Figura 2) (PROKSCH; BRANDNER; JENSEN, 2008; 
NESTLE; MEGLIO; QIN; NICKOLOFF, 2009). 
A pele saudável, além de se renovar normalmente como a maior parte dos 
tecidos corporais, tem extraordinária capacidade de auto regeneração quando sofre 
lesões. A constante renovação da epiderme ocorre por meio de um processo de ciclo 
celular controlado, no qual se formam continuamente novos queratinócitos. A 
proliferação dos queratinócitos é regulada por diferentes substâncias como fatores de 
crescimento, vitaminas lipossolúveis e seus derivados, ceramidas, neuropeptídeos, 
esteróides, hormônios peptídicos e mediadores inflamatórios (GNIADECKI, 1998). 
Epiderme 
Estrato córneo 
Estrato granuloso 
Estrato espinhoso 
Estrato Basal 
Derme 
Glândula 
sebácea 
Vaso 
linfático 
Vaso sanguíneo 
Macrófago 
Tecido adiposo 
20 
 
Quando ocorre uma lesão na camada epidérmica, as células superficiais 
sinalizam às células mais profundas a sua perda de contato com células vizinhas 
destruídas. A sinalização gerada estimula as células da camada basal a proliferarem 
e se diferenciarem, culminando com o reparo da área lesionada (HERSON, 2004). 
 Outra importante estrutura da pele é a derme, a qual está localizada abaixo da 
epiderme, repousando sobre o tecido subcutâneo. A derme, é formada por uma 
camada de tecido conjuntivo associada a um sistema integrado de estruturas fibrosas, 
filamentosas e amorfas onde estão acomodados os vasos sanguíneos, linfáticos, 
terminações nervosas e anexos cutâneos (glândulas sebáceas, sudoríparas, folículos 
pilosos) originados do aprofundamento da epiderme na derme (FREINKEL; 
WOODLEY, 2001). Ainda, a derme é importante para a nutrição da epiderme e para 
remoção de resíduos, uma vez que a epiderme é uma camada avascular (HILINSK; 
MEYERS, 2013). 
Uma extensa rede de comunicação entre células epiteliais da epiderme, tecido 
conjuntivo da derme e células do sistema imune regula as respostas imunológicas da 
pele, a qual é responsável por garantir a defesa do hospedeiro, mantendo ou 
restaurando a homeostase do tecido (PASPARAKIS; HAASE; NESTLE, 2014) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
21 
 
Figura 2 – Anatomia da pele humana e efetores celulares 
 
 
A estrutura da pele reflete a complexidade das suas funções como uma barreira protetora para manter 
a temperatura do corpo, na coleta de informações sensoriais do ambiente e no papel ativo no sistema 
imunológico. A epiderme é composta de 4 estratos sendo a camada mais externa, o estrato córneo, 
responsável pela função de barreira da pele. As células especializadas na epiderme incluem os 
melanócitos, que produzem o pigmento (melanina) e células de Langerhans. Raras células T podem 
ser encontrada no estrato basal e camada espinhosa. A derme é composta de colágeno, tecido elástico 
e fibras reticulares. A derme contém muitas células especializadas, como células dendríticas (DC) 
subconjuntos, incluindo DCs dérmicos. Além disso, macrófagos, mastócitos e fibroblastos estão 
presentes. Vasos sanguíneos e linfáticos e os nervos (não mostrados na figura) também estão 
presentes em toda a derme. 
Fonte: Adaptado de Nestle; Meglio; Qin; Nickoloff (2009). 
 
A derme é rica em matriz extracelular e contém células do estroma, como 
fibroblastos, fibrócitos e células estruturais dos vasos sanguíneos e linfáticos. As 
células imunes residem e trafegam na derme, são dinâmicas e sofrem alterações 
acentuadas durante a resposta imune, como pode ser visualizado na Figura 1 
(PASPARAKIS; HAASE; NESTLE, 2014). 
Devido seu posicionamento estratégico na interface entre o meio externo e 
interno, os queratinócitos recebem sinais a partir do ambiente e são capazes de 
transmiti-los para células do sistema imunológico presentes na pele. Esta 
comunicação é realizada a partir da expressão de receptores gerados por meio da 
produção de citocinas e quimiocinas, como por exemplo, as interleucinas IL-1, IL-10, 
IL-20 e o TNF (PASPARAKIS; HAASE; NESTLE, 2014). 
22 
 
Os apêndices epidérmicos, incluindo glândulas sebáceas, glândulas 
sudoríparas, glândulas apócrinas e folículos pilosos, desenvolvem-se a partir da 
epiderme e se aprofundam na derme. Eles estão alinhados com células epiteliais que 
possuem potencial para a divisão e diferenciação, desta forma são uma importante 
fonte de células para a reepitelização quando a epiderme é destruída. A destruição 
epidermémica pode ocorrer por queimaduras de espessura parcial e traumática, em 
peeling químico, dermo abrasão ou por outros processos esfoliativos (HILINSK; 
MEYERS, 2013). 
 
3.2 Fisiologia e farmacologia do reparo tecidual 
 
Uma lesão ou ferimento é gerado através da ruptura na integridade do tecido 
epitelial da pele e pode estar acompanhado de uma perturbação na estrutura e função 
do tecido normal. Esta perturbação pode ser gerada por um trauma, queimadura ou 
ainda por uma contusão, laceração ou abrasão. Esta alteração deve ser restaurada 
rapidamente uma vez que a integridade da pele é crucial para a manutenção da 
homeostasia do organismo (PEREIRA; CURI, 2005; ENOCH; LEAPER, 2008; 
BALBINO; MENDONÇA; COUTINHO-NETTO, 2009). 
O reparo tecidual é um processo dinâmico que ocorre em uma sequência 
preestabelecida de fases que não se excluem, pelo contrário, se somam. Este 
processo é resultante da interação complexa entre células da epiderme e da derme, 
proteínas da matriz e do plasma e angiogênese controlada (LAU et al.,2009). 
Logo após uma lesão, várias vias intra e intercelulares devem ser ativadas e 
coordenadas para que a integridade do tecido e a homeostase seja restaurada. Os 
componentes celulares do sistema imune, a cascata de coagulação do sangue e as 
vias inflamatórias são ativadas, este processo é um dos mais complexos que ocorrem 
durante a vida humana (MARTIN, 1997; SINGER e CLARK, 1999, GURTNER et 
al.,2008). 
Com o objetivo de facilitar a compreensão deste evento dinâmico e complexo 
diferentes etapas classificatórias do processo de reparo são utilizadas. Estas fases 
são interdependentes em um determinado período de tempo as fases coincidem e 
acontecem simultaneamente, permitindo assim o sucesso da cicatrização 
(MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003). 
23 
 
Estas atividadesocorrem em cascata e estão correlacionadas com o 
aparecimento de diferentes tipos celulares e a liberação de mediadores químicos 
definindo os estágios ou fases do processo de reparo. Disparados pela lesão no tecido 
cutâneo, o reparo tecidual envolve quatro fases; hemostasia, inflamação, proliferação 
e remodelagem como pode-se acompanhar através da figura 3 (ENOCH; LEAPER, 
2008). 
 
Figura 3 - Linha do tempo de migração de populações de células imunitárias correlacionadas com as 
fases de cicatrização de feridas. 
 
 
Fonte: Adaptado de PARK; BARBUL, (2004) 
 
O processo inflamatório, etapa essencial para a manutenção da homeostasia, 
tem papel primordial no reparo tecidual. Ocorre imediatamente após o surgimento do 
trauma, caracterizado pela ruptura de vasos sanguíneos e extravasamento de seus 
constituintes onde inicia a cascata de coagulação (MANDELBAUM; DI SANTIS; 
MANDELBAUM, 2003). As plaquetas induzidas pela trombina sofrem degranulação 
plaquetária liberando diversos fatores de crescimento, como o fator de crescimento 
derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento transformador-β e α (TGF-β; 
24 
 
TGF-α), fator de crescimento epidérmico (EGF), e o fator de crescimento de células 
endoteliais (VEGF), além de glicoproteínas adesivas como a fibronectina e 
trombospondina, que são importantes constituintes da matriz extracelular provisória. 
O cruzamento de fibronectina fornece uma matriz preliminar, que alicerçará a 
migração das seguintes células, fibroblastos, células endoteliais e queratinócitos 
responsáveis pelo desencadeamento do processo de reparo. 
Além disto, a ativação da cascata de coagulação e do complemento, 
juntamente com a liberação dos fatores de crescimento e ativação de células 
parenquimatosas por células lesionadas, produzem numerosos mediadores 
vasoativos e fatores quimiotáticos que auxiliam o recrutamento das células 
inflamatórias para o sitio de lesão. Após a saída das plaquetas dos vasos, neutrófilos 
e monócitos em resposta a fatores quimiotáticos migram para a região do trauma 
(MENDONÇA; COUTINHO-NETTO, 2009). 
A primeira contribuição de mediadores circulantes para a formação do 
gradiente quimiotáxico vem de proteínas plasmáticas como o Fator de Hageman e o 
cininogênio de alto peso molecular. Da interação entre estas duas moléculas é gerada 
a bradicinina que, além de propriedades vasoativas e nociceptivas é também indutora 
da metabolização do ácido araquidônico para formação de eicosanóides. As 
moléculas desta família possuem importância comprovada em vários fenômenos 
inflamatórios e dentre eles a atividade quimiotáxica (HUYBRECHTS-GODIN et al., 
1979 apud BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005). 
Nesta etapa, leucócitos se infiltram na área da lesão e serão os principais 
componentes celulares da resposta inflamatória. Estas células são efetoras no 
combate de patógenos invasores e também estão envolvidas na degradação do tecido 
lesionado. A compreensão do papel essencial da resposta inflamatória no reparo de 
feridas irá fornecer estratégias para modular a remodelação do tecido (EMING; 
KRIEG; DAVIDSON, 2008). 
A força de arraste da corrente sanguínea sobre as células circulatórias está 
diminuída devido à vasodilatação local e ainda estão expressas na superfície das 
células endoteliais dos vasos não lesionados, moléculas de adesão que ancoram os 
leucócitos circulantes e permitem a sua transmigração para o foco inflamatório 
(BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005). 
Na fase final do processo inflamatório, os macrófagos se apresentam como 
peças chave no processo regulatório do reparo, pois apresentam ação fagocitária, 
25 
 
degradando e removendo componentes de tecido conjuntivo danificado debridando a 
ferida (BRAIMAN-WIKSMAN; SOLOMONIK; SPIRA; TENNENBAUM, 2007, 
COUTINHO-NETTO, 2009; ENOCH; LEAPER, 2008; MANDELBAUM; DI SANTIS; 
MANDELBAUM, 2003) 
O papel dos macrófagos é complexo, esta célula polivalente está envolvida em 
muitos aspectos do reparo tecidual através das citocinas e fatores imunomoduladores 
que produz. As citocinas produzidas por macrófagos estão envolvidas na 
angiogênese, migração e proliferação de fibroblastos, na produção de colágeno e 
possivelmente, na contração da ferida (BRAIMAN-WIKSMAN; SOLOMONIK; SPIRA; 
TENNENBAUM, 2007, COUTINHO-NETTO, 2009; ENOCH; LEAPER, 2008; 
MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003; MENDONÇA; MONACO, 
LAWRENCE, 2003) 
O processo de reparo tecidual é, em grande parte, regulado pela produção de 
citocinas, que ordenam e controlam a ativação de genes responsáveis pelo controle 
da migração, proliferação e atividade celular. As plaquetas e macrófagos são as 
principais fontes celulares de citocinas, embora muitas outras células também as 
produzam. O controle da liberação de citocinas é, em parte, regulado por outras 
citocinas e pelas características do meio tecidual (MONACO; LAWRENCE, 2003) 
Logo após a formação da lesão, as citocinas, interleucina 1 beta (IL-1β) e o 
fator de necrose tumoral (TNF), são liberados a partir de células endoteliais rompidas, 
queratinócitos e fibroblastos. A liberação destas citocinas, inicia a fase inflamatória, 
promovendo o recrutamento de leucócitos para o local da ferida. O pico de 
concentração destas, se da no primeiro dia do ferimento e serão sobrereguladas 
durante a resposta inflamatória, o que é essencial no estímulo inflamatório e na 
modulação do processo de regeneração tecidual e (FAHEY et al., 1990; MEDZHITOV, 
2008; KANNO et al., 2013). 
Estudos tem demostrado que o TNF participa diretamente da angiogênese e 
induz a síntese do fator de crescimento transformador (TGF), assim como a 
proliferação de fibroblastos, componentes essenciais no processo de cicatrização. 
Ademais, induzem a biossíntese de vários outros mediadores inflamatórios, incluindo 
IL-1β e as cininas, que em sinergia podem amplificar a resposta inflamatória (FAHEY 
et al.,1990; HENRY; GARNER, 2003) 
26 
 
O TNF exerce uma variedade de efeitos biológicos incluindo a produção de 
citocinas inflamatórias, regulação positiva de moléculas de adesão, proliferação, 
diferenciação e morte celular (KAMATA et al., 2005) 
Enquanto tais efeitos são mediados pelos dois receptores do TNF (TNF-RI e 
TNF-RII), a morte celular induzida por esta citocina é mediada principalmente por TNF-
RI, ao ligar-se a este receptor o TNF é capaz de estimular a sinalização apoptótica, 
resultando no recrutamento e ativação da caspase-8. A caspase-8 ativada por sua 
vez, ativa caspases efetoras tais como a caspase-3 e-7, resultando em apoptose 
(ALIKHANI et al., 2004, WALLACH et al., 2002) 
Assim como, o TNF pode também induzir a apoptose celular, atuando como um 
agente citotóxico (pró-apoptótico) em determinadas situações pode estimular a 
proliferação de fibroblastos (SUGARMAN et al., 1985). . 
Esta dicotomia se deve em parte à capacidade do TNF de atuar como ativador 
do fator de transcrição nuclear -kB (NF-kB), responsável pela sobrevivência celular 
através da ativação de genes pró sobrevivência e supressão de genes pró-
apoptóticos. Um elemento crítico na sinalização da apoptose induzida por TNF, é a 
ativação robusta e prolongada de JNK, o que ocorre quando o NF-kB é inibido. No 
entanto, os sinais específicos que podem desencadear esta citotoxicidade não são 
completamente ilucidados (CHEN et al., 2007, KAMATA et al., 2005; SAKON et al, 
2003). 
Durante o processo de cicatrização a IL-1β é liberada por queratinócitos, tendo 
um efeito parácrino, assim como age de forma autócrina interferindo na migração e 
proliferação destas células epiteliais, e ainda, participam da proliferação de 
fibroblastos (BARRIENTOS et al, 2008; RAJA, 2007). 
Tal como a IL-1β, o TNF pode induzir a produção de fator de crescimento 
fibroblástico (FGF), sugerindo ação indireta na promoção da reepitelização. 
(BARRIENTOS et al, 2008). 
O TNF, de forma isolada, demonstrou inibir a reepitelização de feridas, tendo 
seus efeitosdependentes da concentração e duração da exposição, enfatizando a 
importância do equilíbrio entre os sinais pró e anti-inflamatórios no controle da 
cicatrização. Em baixas concentrações, o TNF pode promover a cicatrização de 
feridas por agir indiretamente estimulando a inflamação e induzindo o aumento no 
recrutamento de macrófagos, liberação de fatores de crescimento e proliferação de 
fibroblastos. No entanto, em concentrações elevadas de TNF, especialmente durante 
27 
 
longos períodos, pode-se observar um efeito prejudicial sobre o processo de reparo, 
já que tem a habilidade de suprimir a síntese de proteínas de matriz extracelular e 
seus inibidores teciduais, enquanto aumenta a síntese de enzimas proteolíticas como 
as metalaproteinases (MMPs), dentre as quais se pode destacar a MMP-1, MMP-2, 
MMP-3, MMP-9, MMP-13, e de MT1-MMP. Ainda, elevados níveis de IL-1β 
apresentam resposta similar à do TNF, em um processo de retroalimentação, 
amplificando este sinal (AGREN et al.,1992; BARRIENTOS et al, 2008). 
Quando o processo inflamatório se encerra, já existe uma matriz provisória com 
a presença de moléculas com propriedades quimiotáxicas gerando condições 
propícias e orientando o sentido da migração celular na região da lesão, servindo 
então como alicerce para novas células se proliferarem (BALBINO; PEREIRA; CURI, 
2005). A partir desta etapa, se inicia o processo de proliferação, fase responsável pelo 
fechamento da lesão. Nesta etapa ocorre a formação do tecido de granulação, um 
tecido conjuntivo ainda imaturo, que substituirá o tecido lesionado. Esta etapa 
apresenta três importantes eventos: (1) reepitelização, (2) fibroplasia e (3) 
angiogênese. (BRAIMAN-WIKSMAN; SOLOMONIK; SPIRA; TENNENBAUM, 2007) 
 (1) A reepitelização inicia horas após a lesão, com a movimentação das 
células epiteliais que provêm tanto da margem da ferida como dos 
apêndices epidérmicos localizados no centro da lesão (MENDONÇA; 
COUTINHO-NETTO, 2009; BRAIMAN-WIKSMAN; SOLOMONIK; 
SPIRA; TENNENBAUM, 2007). 
 (2) A fibroplasia se dá pela substituição da matriz extracelular provisória 
por um tecido conjuntivo mais forte e elástico. Os fibroblastos são as 
células responsáveis por este processo, produzindo proteínas da matriz 
como a fibronectina, ácido hialurônico, proteoglicanas e posteriormente 
o depósito de colágeno no tecido de granulação. Nesta fase sua 
migração e ativação são intensificadas para produção de uma nova 
matriz extracelular necessária ao crescimento celular. Após a influência 
dos fatores de crescimento e demais mediadores inflamatórios, 
derivados principalmente dos macrófagos, os fibroblastos são ativados 
e migram das margens da ferida para o seu centro (BRAIMAN-
WIKSMAN; SOLOMONIK; SPIRA; TENNENBAUM, 2007; 
MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003). Fatores de 
crescimento como PDGF, fator de crescimento fibroblástico básico, 
28 
 
TGF-α, IL-1 e TNF induzem a síntese de colágeno durante a fase 
proliferativa e também na fase subsequente, a remodelagem. Para que 
a fibroplasia ocorra de forma eficiente é necessário a formação de novos 
vasos sanguíneos, que irão carrear oxigênio e nutrientes essenciais ao 
metabolismo celular local (SINGER; CLARK, 1999; ENOCH; LEAPER, 
2008). 
 (3) Na angiogênese, as células endoteliais migram para a área de lesão 
e a produção de novos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes 
é acompanhada, na maioria das vezes, por aumento da permeabilidade 
vascular. As células endoteliais dos vasos neoformados se diferenciam 
em células de revestimento e vasos neoformados assumem 
características funcionais de capilares, a seguir ocorre proliferação das 
células endoteliais, acesso para as células responsáveis pelas próximas 
fases (MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003). 
Após a formação de um tecido de granulação prossegue-se para a última fase 
do processo de reparo, a fase de remodelagem ou remodelamento, marcada pela 
maturação dos elementos e alterações na matriz extracelular, o tecido de granulação 
é enriquecido com fibras de colágeno e começa a adquirir a aparência de massa 
fibrótica característica da cicatriz. Nesta fase ocorrem melhorias e reformulações nos 
componentes das fibras de colágeno e na matriz extracelular, aumentando assim a 
força de tensão e a diminuição do tamanho da cicatriz e do eritema. Cabe ressaltar 
que este processo pode perdurar durante meses (CLARK, 1985). 
O remodelamento da cicatriz envolve etapas sucessivas de produção, digestão 
e orientação das fibrilas de colágeno. Repetições sucessivas da lise, nova síntese, 
redirecionamento e religação formam fibras maiores de colágeno, resultando em uma 
configuração mais regular da cicatriz. Isso aumenta a sua resistência devido à 
organização das fibras acompanharem as forças mecânicas a que o tecido está sujeito 
durante a atividade normal. A neovasculatura diminui, e tardiamente a cicatriz é 
considerada avascular (CLARK, 1985). 
A partir deste momento a cicatriz adquire sua máxima resistência à tração, 
característica marcante desta fase do reparo é a grande e acelerada deposição de 
colágeno na região da ferida. Assim, os sinalizadores de importância, de alguma 
forma, devem exercer influência sobre os fibroblastos. Esta fase está sob influência 
29 
 
de grande número de citocinas incluindo; TNF, IL-1, TGF-β, PDGF e fator de 
crescimento fibroblástico básico (ENOCH; LEAPER, 2008). 
O TGF-β, um sinalizador com participação crucial nessa fase, é um mitógeno 
importante de fibroblastos. Embora exercendo efeitos inibitórios sobre a proliferação 
dos queratinócitos, é um potente estimulador da expressão de proteínas da matriz 
extracelular e de integrinas (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005). 
Com a evolução do processo de cicatrização acentua-se a deposição de 
colágeno e a maioria das células desaparecem (observa-se a apoptose de fibroblastos 
e células endoteliais) formando finalmente a cicatriz avascular com baixo número de 
células. Se o teor celular permanecer alto, poderá ocorrer a formação de cicatrizes 
hipertróficas ou queloides (MENDONÇA; COUTINHO-NETTO, 2009). 
 
3.3 Cininas 
 
As cininas fazem parte de uma importante família de peptídeos biologicamente 
ativos, envolvidos em uma série de processos biológicos e fisiopatológicos. As ações 
das cininas já foram confirmadas em diversas reações inflamatórias, além de 
processos dolorosos e inflamação (KAPLAN; KUSUMAM; SILVERBERG, 2002). 
Pesquisas têm demonstrado que estes peptídeos estão envolvidos em uma 
variedade de fenômenos biológicos, como a regulação da pressão arterial sistêmica, 
através das suas propriedades vasodilatadoras, contração da musculatura lisa 
regulando o tônus vascular, além de modular o metabolismo da glicose (BHOOLA et 
al., 1992; MARCEAU; REGOLI, 2004). 
Os componentes do sistema cinina-calicreína vêm sendo estudados desde 
1909, quando um componente hipotensivo foi encontrado no sistema urinário, sendo 
posteriormente identificado como a calicreína tecidual. Em 1949, Rocha-e-Silva e 
colaboradores isolaram o peptídeo bradicinina (BK) das globulinas plasmáticas 
tratadas com tripsina ou protease provenientes do veneno da cobra Bothrops jararaca 
(BHOOLA et al., 1992; MARCEAU e REGOLI, 2004). 
As cininas pertencem a um grupo de peptídeos com 9 a 11 aminoácidos, 
incluindo a BK, calidina (Lys- BK), T-cinina e seus metabólitos ativos e as des-Arg-
cininas. A cascata de formação das cininas compreende a ação de enzimas 
proteolíticas denominadas calicreínas sobre um precursor, o cininogênio, encontrado 
no plasma e nos tecidos. A calicreína plasmática cliva o cininogênio de alto peso 
30 
 
molecular (HMWK) liberando a BK, este processo encontra-se exacerbado em 
respostas inflamatórias. Já a calicreína tecidual utiliza como substrato o cininogênio 
de baixo peso molecular (LMWK), sintetizando a Calidina (Lys-BK) (MCLEAN et al, 
2000). 
Após o processo de síntese, as cininassão rapidamente metabolizadas por 
diferentes grupos de peptidases. Há evidências de 4 metalopeptidases que são 
responsáveis pelo metabolismo da BK: 1) enzima conversora de angiotensina I (ECA, 
cininase II), 2) aminopeptidase P (APP), 3) endopeptidase neutral 24.11 (NEP, 
neprilisina) e as 4) carboxipeptidases M (membrana) e N (plasma) (CPM, CPN; 
cininases I). Em humanos, os níveis circulantes são regulados pela CPN. Entretanto, 
nas superfícies endoteliais, principalmente no leito vascular pulmonar, a regulação é 
realizada pela ECA, sendo este o principal mecanismo através do qual a BK e Lys-BK 
são inativadas (BHOOLA et al., 1992; MARCEAU; REGOLI, 2004; REGOLI; BARABÉ, 
1980). 
As principais enzimas que degradam a bradicinina são as cininases I e II. A 
cininase II, exerce sua ação através da remoção do dipeptídeo da porção C-terminal 
da bradicinina ou calidina ocasionando sua total inativação. Já a atividade da cininase 
I apresenta uma importância particular, uma vez que é a responsável pela geração de 
metabólitos ativos das cininas, a des-Arg9 bradicinina (DABK) eu des-arg10 calidina, 
através da remoção do aminoácido arginina da porção C- terminal da BK e Lys-BK, 
respectivamente. (Figura 4) (BHOOLA et al., 1992; KAPLAN; KUSUMAM, 2002; 
SHEIKH; KAPLAN, 1989) 
31 
 
Figura 4 – Cascata de formação das Cininas 
 
IIustra a via do sistema calicreína-cininas e sua cascata de formação.A partir da ação da Calicreína, 
tecidual ou plasmática sobre o cininogênio de alto peso molecula (HK) ou ciniogênio de baixo peso 
molecular, será formada a Bradicinina, que por ação da cininase I pode ser convertida em seu 
metabólito ativo a DABK ou em um metabólito inativo também por ação de uma cininase (ECA). A 
bradicinina então agirá preferencialmente nos recptores B2, enquanto seu metabólito ativo, DABK agirá 
através da ligação nos receptores B1. 
Fonte: RAMALHO (2000) 
 
Após serem liberadas, BK, Lys-BK e seus derivados ativos exercem uma série 
de efeitos biológicos, como vasodilatação, aumento do fluxo sanguíneo e da 
permeabilidade vascular, redução da pressão do sague, contração ou relaxamento da 
musculatura lisa e sensibilização de fibras aferentes sensoriais. As cininas ainda estão 
relacionadas com a liberação de diferentes mediadores pelo endotélio, indução da 
proliferação celular, regulação do transporte de glicose e estimular a reabsorção 
óssea (BHOOLA et al., 1992; REGOLI; BARABÉ, 1980). 
A utilização da biologia molecular como ferramenta no estudo dos receptores 
cininérgicos permitiu a definição molecular dos receptores das cininas e foi iniciada 
pela clonagem do receptor B2 em ratos (MCEACHERN et al., 1991), seguida pela do 
receptor B1 em humanos (MENKE et al., 1994). Os dois receptores parecem estar 
envolvidos com alterações observadas durante desordens inflamatórias agudas e 
crônicas. Grande parte dessas conclusões está baseada nos estudos dos efeitos dos 
antagonistas dos receptores utilizados em diversos modelos de inflamação 
(MARCEAU; HESS; BACHVAROV, 1998). 
32 
 
Diversas investigações demonstram o envolvimento dos receptores B1 e B2 na 
resposta edematogênica mediada pelas cininas no modelo de edema de pata em 
ratos. Neste modelo os receptores B2 parecem ser constitutivos, enquanto os 
receptores B1 apresentam caráter induzido (CAMPOS; CALIXTO,1995; CAMPOS et 
al.,1995). Estudos demonstraram que a expressão dos receptores B1 é controlada 
principalmente pela produção de citocinas específicas após trauma tecidual, 
principalmente pela IL-1β (MARCEAU et al.,1998). Diversos estímulos inflamatórios 
são capazes de estimular a produção de IL-1β como citocinas pró-inflamatórias e 
produtos bacterianos como lipopolissacarídeo de membrana (LPS) (DINARELLO, 
1998). 
Assim, os efeitos biológicos das cininas ocorrem pela ativação específica de 
receptores denominados de B1 e B2, receptores estes pertencentes à superfamília de 
receptores acoplados à proteína G. No entanto, os receptores B1 e B2 se diferenciam 
em suas estruturas primárias, regulação, expressão e distribuição no tecido 
(MARCEAU et al., 1998). 
Receptores B1 são preferencialmente e seletivamente estimulados pelos 
metabólitos ativos des-Arg9-BK e Lys-des-Arg9-BK (figura 4). Enquanto que os 
receptores B2 apresentam alta afinidade pela BK e Lys-BK (figura 4) (KAPLAN et 
al.,2002, MARCEAU et al., 1998). Evidências apontam que receptores B2 encontram-
se expressos de forma constitutiva em diferentes órgãos, tecidos e tipos celulares 
(SCHREMMER-DANNINGER et al., 1995) e são os principais responsáveis pelas 
ações fisiológicas das cininas. Com relação ao receptor B1, não são expressos em 
níveis significativos nos tecidos em condições normais, mas são sintetizados e 
modulados rapidamente em diversos tipos celulares após traumas teciduais ou 
durante condições patológicas, indicando um mecanismo adicional na lesão tecidual 
e na recuperação. Além disso, a indução do receptor B1 é resultante de uma cascata 
de eventos que envolvem a interação entre fatores de transcrição, proteínas quinases, 
células inflamatórias e citocinas, como por exemplo IL-1 e TNF (CALIXTO et al., 2000; 
CALIXTO et al., 2004; KAPLAN; KUSUMAM, 2002). Desta forma, grande parte dos 
efeitos fisiológicos das cininas são mediados pela ativação dos receptores B2 
enquanto os receptores B1 parecem estar envolvidos na amplificação da sinalização 
iniciada pelos receptores B2 (CALIXTO et al., 2000; CALIXTO et al., 2004). 
33 
 
O receptor B1 é geralmente expresso no mesmo tipo celular que está presente 
o receptor B2, recrutando a mesma via de sinalização, entretanto, o receptor B1 não 
sofre dessensibilização após estimulação pelo agonista (MARCEAU; REGOLI, 2004). 
Os dois receptores parecem estar envolvidos com as alterações observadas 
durante desordens inflamatórias agudas e crônicas. Grande parte dessas conclusões 
está baseada nos estudos dos efeitos dos antagonistas dos receptores utilizados em 
diversos modelos de inflamação (MARCEAU; HESS; BACHVAROV, 1998). 
Grandes avanços do envolvimento das cininas em processos fisiológicos assim 
como fisiopatológicos se deram com o desenvolvimento de antagonistas seletivos 
para os receptores cininérgicos. Os antagonistas seletivos para o receptor B1 se deu 
uma década antes do desenvolvimento de antagonistas para receptores B2. O 
desenvolvimento do protótipo [Leu8]-des-Arg9-Bk (DALBK) como antagonista seletivo 
foi decisivo para definir a existência dos receptores B1 (REGOLI; BARABÉ, 1980). 
Mesmo com as limitações da primeira geração de antagonistas de B2, a partir 
de seu desenvolvimento, o papel das cininas em condições normais e patológicas 
agudas começou a ser delineado (BHOOLA et al., 1992). A segunda geração de 
antagonistas da BK começou com os antagonistas exemplificados por Hoechst HOE-
140 (Icatibante), obtido através da introdução de dois aminoácidos sintéticos (Tic e 
Oic) nas posições 7 e 8 do antagonista anterior (HOCK et al.,1991; WIRTH et al., 
1991). 
Esta alteração estrutural gerou uma molécula com a capacidade de bloquear 
sua degradação, aumentando dramaticamente o tempo de meia vida in vivo deste 
antagonista em comparação aos antagonistas da primeira geração. A busca por 
antagonistas não peptídicos que fossem ativos por via oral, levou ainda ao 
desenvolvimento de uma terceira geração de antagonistas (STEWART et al., 1999; 
STEWART, 2004). 
Apesar de existirem diferenças entre os dois receptors cininérgicos B1 e B2, as 
vias de sinalização celular ativadas por eles parecem ser semelhantes. Ambos são 
recepetores acoplados a proteína G e sua ativação pode estar envolvida direta ou 
indiretamente, com diferentes vias de transdução de sinal (YANAGA et al., 1991; XIE 
et al., 2000). 
Complementando os efeitos pró-inflamatórios do receptor B2, que se encontram 
acoplados a múltiplos mecanismos transducionais. A BK ativa os receptores B2 e 
estimula a liberação do ácido araquidônicocom formação subseqüente de 
34 
 
prostaglandina E2 ou I2, resultando na formação do monofosfato cíclico de adenosina 
(AMPc). Outro componente envolvido no processo inflamatório é o óxido nítrico (NO), 
também formado pela ativação dos receptores B2, através do aumento de monofosfato 
cíclico de guanosina (GMPc) (MARCEAU, HESS, BACHVAROV, 1998). 
Outro ponto a se destacar é a ativação de vias alternativas, envolvendo a 
fosforilação de algumas classes de quinases, como tirosina quinase, quinases 
ativadas por mitógeno, proteína ribosomal S6 quinase e fosfatidilinositol-3-quinase 
(MARCEAU; BACHVAROV, 1998; PYNE et al., 1997; PAN et al, 1999). 
Os mecanismos descritos acima, podem levar à liberação ou mesmo 
potencialização da ação de outros importantes mediadores inflamatórios como as 
citocinas, assim como a ativação do fator de transcrição NF-B (PAN et al., 1998). 
A ativação de receptores B2 acoplados aos mecanismos de transdução pode 
ser responsável pelo aumento da população de receptores B1, sugerindo a existência 
de um processo de balanço entre as duas populações de receptores cininérgicos, 
durante desordens inflamatórias (CALIXTO et al., 2000). 
Outro fato importante a se acrescentar em relação à participação dos 
receptores B1 é que durante o desenvolvimento da inflamação, uma grande 
quantidade de BK sofre a ação de carboxipeptidases, produzindo grandes 
quantidades do metabólito ativo des-Arg9-bradicinina. Esta alta concentração 
endógena dos agonistas seletivos para o receptor B1 demonstra que estes possuem 
papel fundamental também na regulação de expressão dos receptores B1 
(SCHANSTRA et al., 1998). 
Processos inflamatórios cutâneos induzidos através de diferentes estímulos, 
incluindo substâncias alergênicas ou através da radiação ultravioleta, disparam 
respostas inflamatórias no tecido cutâneo induzindo diretamente queratinócitos e 
estimulando a liberação de citocinas pró-inflamatórias e BK. Nos queratinócitos, a 
bradicinina induz o crescimento celular e este efeito pode ser induzido via receptores 
específicos de cininas (SCHREMMER-DANNINGER et al., 1995). 
Schremmer-Danninger e colaboradores (1995), utilizando técnicas 
radiográficas, identificaram receptores específicos para bradicinina na camada basal 
de epiderme humana sugerindo que as cininas podem estar envolvidas em 
mecanismos de proliferação celular epidérmica. 
O RNA mensageiro (RNAm) para o receptor B1, B2 e para a calicreína tecidual 
na pele de indivíduos sadios foi identificado e desta forma, a existência do sistema 
35 
 
das cininas na pele humana é um fato comprovado (SCHREMMER-DANNINGER et 
al., 1999). Poblete e colaboradores (1991) encontraram calicreína tecidual no fundo 
secretório de glândulas sudoríparas. Além disso, foi demonstrada a presença de 
cininogênio de alto peso molecular no espaço intersticial tecidual na epiderme de 
cobaias e também na pele humana (YAMAMOTO et al.,1987; VIDAL et al., 2005). 
Dados indicam que as calicreínas e as cininas contêm substratos que normalmente 
estão presentes na pele humana contribuindo para o conceito de que as cininas são 
formadas localmente (VIDAL et al, 2005). 
É importante destacar que outras ações das cininas também sugerem o 
envolvimento desse sistema em outras etapas dos processos inflamatórios cutâneos, 
como na proliferação celular. Cheng e colaboradores (2004) demonstraram que a BK, 
via ativação dos receptores B2, apresenta efeito mitogênico através da ativação de 
proteína G, causando fosforilação da via da PKC e consequente estimulação da via 
da MEK/ proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) e da expressão de c-fos e c-
jun em cultura de queratinócitos obtidos da córnea de coelhos. Também através de 
receptores B2, a BK promove ativação da cascata da p42/p44 MAPK em vários tipos 
de células humanas, incluindo as células da musculatura lisa vascular, endoteliais, 
PC-12 e linhagem de células tumorais (CHENG et al., 2004). 
Em 2008, Matus e colaboradores utilizando cultura de queratinócitos 
comprovaram que o estímulo de receptores B1 pode contribuir para a diferenciação e 
migração de queratinócitos através da sinalização da tirosina quinase C ou através da 
interação com receptores da família ErbB. Indícios de que o sistema cinina-calicreína 
pode estar envolvido com a migração e diferenciação de queratinócitos foram 
confirmados em lesões realizadas em cultura celular e tratadas com calicreína. Neste 
trabalho, Gao e colaboradores, (2010) constataram que há influência na migração e 
diferenciação destas células através da ativação de receptores PAR, sugerindo assim 
um importante papel no processo de reparo tecidual. 
Como já mencionado anteriormente, os fibroblastos são células importantes na 
reparação de tecidos, estando envolvidos na migração, proliferação, contração da 
ferida e na produção de colágeno (ENOCH; LEAPER, 2008). Em uma busca na 
literatura não foram encontrados estudos relacionando o papel das cininas e seus 
receptores envolvendo fibroblastos cutâneos, porém já existem estudos in vitro 
usando fibroblastos de outros tecidos indicando que a bradicinina também é capaz de 
36 
 
induzir a ativação destas células (CHENG; TSENG; MAO,2012; SABATINI et al.,2013; 
VANCHERI et al., 2005). 
Estudos in vitro demonstram que a BK através da ativação dos receptores B2 é 
capaz de ativar a via do NF-kB e a liberação de citocinas em cultura de fibroblastos 
de pulmão humano influenciando na sua contratilidade (VANCHERI et al., 2005). A 
BK causa um significativo aumento na α-actina de músculo liso (α-SMA), proteína 
expressa por fibroblastos em fase de transformação em miofibroblastos pulmonares. 
O receptor B2 foi considerado o responsável por este efeito, pois o tratamento com o 
antagonista bloqueou a expressão. A BK também é capaz de induzir a proliferação de 
fibroblastos e a produção de colágeno através da ativação da via da MAPK por 
fosforilação regulada por sinal extracelular (ERK 1/2) (VANCHERI et al., 2005). 
Considerando o importante papel dos fibroblastos na fase proliferativa com o 
fechamento da lesão através da formação do tecido de granulação e influenciando o 
depósito de colágeno e a contração da ferida. Avaliando o cenário onde, os 
mediadores inflamatórios assumem um importante papel na progressão da resposta 
de reparo tecidual somando-se às evidências de que o sistema cinina-calicreína pode 
regular a proliferação celular, assim como sua possível relevância na a angiogênese. 
Considera-se relevante explorar o papel das cininas na proliferação de fibroblastos in 
vitro e a influência do TNF neste processo, procurando através do “Scratch model” 
mimetizar as condições envolvidas no processo de reparo tecidual. 
37 
 
4. MATERIAL E MÉTODOS 
 
4.1 Materiais 
 
4.1.1 Linhagem celular 
 
As células utilizadas foram adquiridas do banco de células do Rio de Janeiro. 
Fibroblastos Murino linhagem NCTC clone 929 [L CELL, L-929], de origem de tecido 
conectivo adiposo. 
 
4.1.2 Condições de cultivo 
 
No cultivo celular in vitro, células de fibroblasto murino L929 desenvolveram-se 
como culturas aderentes cultivadas em garrafas plásticas (poliestireno) estéreis da 
Techno Plastic Products (TPP). O meio de cultura DMEM (Vitrocell®) suplementado 
com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) (Gibco®) foram adicionados às garrafas. As 
células foram mantidas em estufa sob atmosfera contendo 5% de CO2 à temperatura 
de 37°C. A subcultura foi realizada de acordo com a confluência das células na 
garrafa, utilizando-se a solução de tripsina-EDTA para desprender as células 
aderidas. Para o armazenamento das linhagens, as células, foram suspensas em 
meio de cultura suplementado com 10% SFB e 10% de DMSO e armazenadas em 
nitrogênio líquido. 
 
4.2.Métodos 
 
4.2.1 Avaliação da proliferação celular 
 
 
4.2.1.1 Preparo da placa de cultivo 
 
Após crescimento celular em alta confluência em monocamada mantidana 
garrafa de cultivo, células foram tripsinizadas e semeadas em placas de 24 poços e 
mantidas em estufa até atingirem máxima confluência, como pode ser visualizado no 
modelo demonstrado na figura 5. 
38 
 
Figura 5 – Modelo de placa com 24 poços para cultivo celular 
 
 
4.2.2 Ensaio de Scratch in vitro 
 
Após confluência na placa de 24 poços, o meio de cultivo foi retirado dos poços 
e com o auxílio de uma ponteira (tip 200) foi realizado um risco contínuo na superfície 
medial de cada poço, de acordo com a figura 6. Este procedimento ocasiona uma 
ruptura do contato entre as células e a retirada destas de uma determinada região da 
placa, resultando na formação de uma lesão mecânica na monocamada 
Os poços foram lavados com Salina tamponada com fosfato (PBS) (Gibco®), 
composto por cloreto de sódio e fosfato de sódio, para remoção das células 
debridadas, o esquema de cultivo e experimento in vitro está demostrado na figura 7. 
Antes do plaqueamento das células, foi realizada uma marcação central 
utilizando um marcador permanente objetivando uma melhor padronização na 
confecção do rasgo e das medidas. Esta marcação estabelece um campo visual no 
poço, o qual será analisado posteriormente após o estabelecimento do rasgo na 
monocamada, em tempo zero, 24 e 48 horas. Posteriormente, foi feito o 
acompanhamento da proliferação das células adjacentes em direção ao espaço livre 
na placa conforme a figura 6. 
39 
 
Figura 6 – Esquema do procedimento In vitro de “ Scratch model” 
 
 
 
Após confluência na placa de 24 poços cada poço (A) foi submetido ao stress mecânico através da 
ruptura da monocamada com um “rasgo” contínuo utilizando uma ponteira de micropipeta (B), após a 
retirada das células desaderidas as céulas adjacentes tendem a se proliferar em direção ao espaço 
livre na placa (C). 
Fonte: Adaptado de VEDULA et al., (2013). 
 
Figura 7 – Modelo de Scratch wound “in vitro” 
 
 
 
 
Após confluência em 
monocamada, as células de 
fibroblastos L929 foram 
tripsinizadas
semeadas em placas de 
plástico (TPP) de 24 poços
1x 105 cels/poço
e mantidas em estufa até 
atingirem a máxima 
confluência
A placa foi marcada no seu 
verso, de modo que cada 
poço obtivesse uma 
marcação central. 
Esta marcação estabelece 
qual campo do poço será 
analisado em tempo zero, 
24 e 48horas
Retirou-se o meio de cultura 
e com o auxílio de uma 
ponteira (tip 200) foi feito um 
risco contínuo na superfície 
medial de cada poço,
. Os poços foram então 
lavados com Salina 
tamponada com fosfato 
(PBS) para remoção das 
células desaderidas
40 
 
4.2.3 Avaliações da proliferação celular em fibroblastos tratados com TNF 
 
Com o objetivo de ativar os receptores cininérgicos e avaliar um possível efeito 
das cininas na proliferação de fibroblastos, após o trauma mecânico (Scratch) as 
células foram tratadas com TNF. 
As células, após Scratch, foram incubadas com solução rm TNF em meio de 
cultivo suplementado com 5% de SFB na concentração de 2 ng/mL (GOLDBERG et 
al., 2007). 
Inicialmente, foi realizado experimento com o intuito de verificar o melhor tempo 
de exposição de contato com TNF para indução da proliferação celular, após o stress 
mecânico as células foram mantidas incubadas por 30, 60, 90, 180 ou 240 minutos. 
Após o tempo de contato com o TNF, o meio foi retirado, as células foram lavadas 
com PBS e então foi adicionado meio DMEM suplementado com 5% de SFB (figura 
8). Foi mantido um grupo controle onde as células receberam apenas meio de cultivo 
suplementado e PBS. A análise fotográfica foi feita no tempo zero (imediatamente 
após o rasgo), após 24 e 48 horas após o rasgo. 
 
Figura 8 – Esquema de tratamento das células com TNF em diferentes tempos de contato. 
 
Tempo zero 
 
Tempo de contato 
com TNF 
30,60,90,180 e 240 
min. 
Tempo 
Após rasgo 
24 horas 
 
Tempo 
Após rasgo 
48 horas 
 
 
Após confluência na 
placa de 24 poços 
“Scratch “ rasgo” 
Incubação com TNF 
Registro fotográfico 
imediatamente após o 
rasgo e incubação 
Lava com PBS e 
adiciona meio 
suplementado com 5% 
SFB 
Registro fotográfico 
Retira o meio 
Lava com PBS 
Adiciona meio de 
cultivo com 5% de SFB 
Avaliação da 
proliferação 
Registro fotográfico 
Avaliação da 
proliferação 
 
 
41 
 
4.2.4 Avaliações do papel das cininas na proliferação celular em fibroblastos 
 
Com o objetivo de avaliar a interferência das cininas no processo de 
proliferação de fibroblastos L929, as células foram incubadas com agonistas dos 
receptores cininérgicos B1 [des-Arg9]BK (DABK, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, 
U.S.A.) e B2, Bradicinina (BK, Bachem California, Torrance, CA) ® 
Para avaliar qual concentração do agonista do receptor B2 (BK) pode interferir 
na proliferação celular, o ensaio seguiu o esquema descrito na figura 9. O mesmo 
procedimento foi executado para avaliar a interferência do agonista do receptor B1 
empregando para tal o seu agonista DABK, figura 10. 
 
Figura 9 - Esquema de tratamento das células com agonista receptor B2 (BK) em diferentes 
concentrações. 
 
Tempo zero 
 
 
 
1 
Tempo de contato 
60 minutos 
diferentes [ ] de BK 
(0,1, 1,0 e 100µM) 
2 
Tempo 
24 horas 
 
 
3 
Tempo 
48 horas 
 
 
4 
 
Após confluência na placa 
de 24 poços 
Scratch “rasgo” 
Incubação com diferentes 
 [ ] de BK + meio sem SFB 
Registro fotográfico 
Após 60 minutos 
Retira o meio 
 Lava com PBS 
Adiciona meio 5% SFB 
Registro fotográfico 
Retira o meio 
lava com PBS 
Adiciona meio com 5% 
SFB 
Avaliação da proliferação 
 
 
Registro fotográfico 
Avaliação da proliferação 
 
Figura 10 - Esquema de tratamento das células com agonista receptor B1 (DABK) em diferentes 
concentrações. 
 
Tempo zero 
 
1 
Tempo de contato 
60 minutos 
2 
Tempo 
24 horas 
3 
Tempo 
48 horas 
4 
 
Após confluência na placa 
de 24 poços 
Scratch “rasgo” 
Incubação com diferentes 
 [ ] deDABK (0,1, 1,0, 10 
e 100nM) 
Meio sem SFB 
Registro fotográfico 
Após 60 minutos 
Retira o meio 
 Lava com PBS 
Adiciona meio 5% SFB 
Registro fotográfico 
Retira o meio 
Lava com PBS 
Adiciona meio com 5% 
SFB 
Avaliação da proliferação 
 
Registro fotográfico 
Avaliação da proliferação 
 
 
42 
 
4.2.5 Avaliações do papel das cininas na proliferação celular em fibroblastos 
pré tratados com TNF 
 
Com o objetivo de avaliar a co-participação do TNF na proliferação celular de 
fibroblastos L929 induzida pelos agonistas cininérgicos, as células foram pré-tratadas 
com TNF imediatamente após o stress mecânico e mantidas em contato por 240 
minutos. Após este estímulo o meio é retirado, as células lavadas com PBS e então 
tratadas com agonistas cininérgicos por 60 minutos. Após este período o meio foi 
retirado, as células foram lavadas com PBS, incubadas com meio de cultivo 
suplementado com 5% de SFB e mantidas por 48 horas. Foi realizada avaliação da 
proliferação celular por meio de registro fotográfico em 24 e 48 horas após o rasgo 
(Figura 11 e 12). 
 
Figura 11 – Esquema de tratamento com o agonista do receptor B2, BK, em células pré tratadas com 
TNF. 
 
Tempo zero 
Incubação com 
TNF 
1 
Tempo 240 
minutos 
 
2 
Tempo 60 
minutos 
 
3 
Tempo 
24 horas 
 
4 
Tempo 
48 horas 
 
5 
 
Após confluência na 
placa de 24 poços 
“Scratch“ rasgo” 
Incubação com TNF 
2ng/ml + meio 5% 
de SFB 
Registro fotográfico 
imediatamente após 
o rasgo e incubação 
Após 240min 
Retira o meio 
 Lava com PBS 
Adiciona meio sem 
suplementação 
acrescido das 
diferentes [ ] de BK 
(0,1, 1,0 ,10 e 
100µM) 
 
Após 60 minutos 
Retira o meio 
 Lava com PBS 
adiciona meio com 
5% SFB 
Registro fotográfico 
Retira o meio 
Lava com PBS 
Adiciona meio com 
5% SFB 
Avaliação da 
proliferação 
 
 
Registro fotográfico 
Avaliação da 
proliferação 
 
 
43 
 
Figura 12- Esquema do tratamento com o agonista do receptorB1, DABK, em células pré tratadas com 
TNF. 
 
Tempo zero 
 
1 
Tempo 240 
minutos 
2 
Tempo 60 
Minutos 
3 
Tempo 
24 horas 
4 
Tempo 
48 horas 
5 
 
Após confluência na 
placa de 24 poços 
“Scratch“ rasgo” 
Incubação com TNF 
2ng/ml+meio 5% de 
SFB 
Registro fotográfico 
imediatamente após 
o rasgo e incubação 
Após 240min 
Retira o meio 
 Lava com PBS 
Adiciona meio sem 
suplementação 
acrescido das 
diferentes [ ] de 
DA BK (0,1, 1,0, 10 
e 100nM) 
 
Após 60 minutos 
Retira o meio 
 Lava com PBS 
adiciona meio com 
5% SFB 
Registro fotográfico 
Retira o meio 
Lava com PBS 
Adiciona meio com 
5% SFB 
Avaliação da 
proliferação 
 
Registro fotográfico 
Avaliação da 
proliferação 
 
 
4.2.6 Efeito dos antagonistas cininérgicos sobre a proliferação de fibroblastos 
L929 induzida pelo TNF e pelas cininas com pré estímulo do TNF. 
 
Para padronizar a resposta obtida e otimizar o modelo testado foram efetuadas 
algumas modificações no modelo anteriormente descrito. 
Como no ensaio de padronização com diferentes tempos de contato do TNF 
com as células os tempos de 90 até 240 minutos apresentaram aumento significativo 
na proliferação celular em comparação às células tratadas somente com PBS, sendo 
que o tempo de 240 minutos aumenta considerável este nível de proliferação, 
padronizou-se o tempo 180 miunutos para os demais ensaios. 
Foi utilizada 300µL de meios em cada poço da placa de 24 poços e a 
proliferação celular foi avaliada mediante registro fotográfico no tempo zero 
(imediatamente após o rasgo), 30 e 48 horas após o rasgo. 
A fim de confirmar o possível envolvimento dos receptores cininérgicos B1 e B2 
e a co participação do TNF no processo de proliferação dos fibroblastos, foi realizado 
um experimento adicionando os antagonistas cininérgicos; antagonista seletivo do 
receptor B1) Lys-(Des-Arg9, Leu8)-BK DALBK; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, 
U.S.A. e com o antagonista seletivo do receptor B2, HOE -140 (D-Arg0-Hyp3-Thi5-DTic7-
Oic8-BK, Hoechst AG, Frankfurt, Germany), após o pré estimulação do TNF por 180 
minutos, e mantidos em contato com as células, conforme o esquema da figura 13. 
44 
 
Para confirmar a participação do TNF o mesmo foi incubado na presença do 
anticorpo anti TNF em coadministração e mantidos por 180 minutos, após foi retirado 
o meio e as células foram lavadas com PBS. 
E ainda para avaliar o envolvimento do fator de transcrição NF-ƙB na 
proliferação dos fibroblastos foi efetuado um tratamento utilizando um inibidor da 
ativação deste fator de transcrição o PDTC (pirrolidinaditiocarbamato), administrado 
após o estímulo do TNF por 180 minutos, e os tratamentos foram mantidos até 48 
horas após o rasgo, conforme figura 13. 
 
Figura 13- Esquema do tratamento com os antagonistas do receptor B1 e B2, anticorpo anti TNF e 
PDTC, administrados após o pré tratamento com TNF. 
 
 
 
 
 
Tempo zero 
 
1 
Tempo 180 
minutos 
2 
Tempo 
30 horas 
4 
Tempo 
48 horas 
5 
 
Após confluência na 
placa de 24 poços 
“Scratch“ rasgo” 
Incubação com TNF 
2ng/ml + meio 5% 
de SFB 
AB anti TNF 
Nas cels que não 
receberam estímulo 
com TNF 
receberam apenas 
PBS + meio 5% 
SFB 
Registro fotográfico 
imediatamente após 
o rasgo e incubação 
Após 180min 
Retira o meio 
Lava com PBS 
Adiciona meio 5% 
SFB acrescido de: 
HOE-140 1µM 
DALBK 10µM 
Ou 
PDTC 
 
Registro fotográfico 
Avaliação da 
proliferação 
 
Registro fotográfico 
Avaliação da 
proliferação 
45 
 
4.2.7 Avaliação do efeito das cininas na proliferação celular em fibroblastos 
pré tratados ou não com TNF em coadministração ou não do anticorpo anti 
TNF. 
 
Para avaliar o efeito da coparticipação do TNF na proliferação celular de 
fibroblastos estimulada pelos agonistas cininérgicos as células foram cultivados em 
placas de 24 poços foram submetidos à técnica de scratch e em seguida incubados 
com TNF coadministradas ou não com o anticorpo recombinante para esta citocina. 
Após este tempo de contato as células foram estimuladas com agonistas das cininas 
(BK ou DABK) conforme exemplificado figura 14. 
Com o objetivo de comparar a proliferação sem o pré estímulo do TNF, também 
foram realizados tratamentos onde as células foram tratadas apenas com os agonistas 
BK ou DABK esquema da figura 14. 
Para confirmar a hipótese de estresse mecânico gerado pela ruptura da adesão 
celular causada pelo rasgo na monocamada também induz a liberação de cininas 
pelas células, as mesmas foram tratadas com os antagonistas, HOE-140 e DALBK 
logo após o rasgo. 
 
Figura 14 - Esquema do tratamento com os agonistas do receptor B1 e B2 pré tratadas ou não com o 
TNF e coadministradas ou não com o anticorpo anti TNF. 
 
Tempo zero 
 
1 
Tempo 180 minutos 
2 
Tempo 
30 horas 
4 
Tempo 
48 horas 
5 
 
Após confluência na 
placa de 24 poços 
“Scratch“ rasgo” 
Incubação com TNF 
2ng/ml + meio 5% 
de SFB 
AB anti TNF 
Nas cels que não 
receberam estímulo 
com TNF 
receberam apenas 
PBS + meio %% 
SFB 
Registro fotográfico 
imediatamente após 
o rasgo e incubação 
Após 180min 
Retira o meio 
Lava com PBS 
Adiciona meio 5% SFB 
acrescido de: 
BK 10 µM 
DABK 1nM 
HOE-140 1µM 
DALBK 10µM 
BK 10 µM+HOE1µM 
DABK 1nM+DALBK 10µM 
 
Registro 
fotográfico 
Avaliação 
da 
proliferação 
 
Registro fotográfico 
Avaliação da 
proliferação 
 
 
46 
 
4.3 Análises dos dados e apresentação dos resultados 
 
O cultivo com os tratamentos foi mantido e controlado após scratch, pelo 
período de 24 e 48 horas. A condição controle foi realizada com veículo de diluição 
dos componentes (PBS). 
Nos tempos zero (logo após o trauma mecânico), 24 e 48 horas o ensaio foi 
analisado utilizando microscópio de contraste de fase (Olympus CKX 41) e as imagens 
capturadas com uma câmera digital acoplada ao microscópio, com aumento final de 
100x. As análises foram realizadas medindo a área sem proliferação, obtida na região 
do “risco” em mm2 utilizando o software ImageJ1.46r como apresentado na figura 15. 
A análise dos resultados foi realizada a partir do cálculo da % área de cobertura 
de proliferação usando a fórmula abaixo: 
 
% da área de cobertura 24 h = Área em 24 h x 100 - 100 
 Área em T0 
 
% da área de cobertura 48 h = Área em 48 h x 100 - 100 
 Área em T24 
 
Os tratamentos dos itens 4.2.6 e 4,2,7, foram avaliados de forma diferente para 
melhor padronização da técnica, onde as células foram mantidas por 48horas após o 
estresse mecânico e as análises fotográficas foram feitas em 30 horas após o rasgo. 
As células foram mantidas por mantidas por 48 horas e os registros fotográficos foram 
feitos, porém pelaquantidade de meio por poço foi diminuída e mantida por 48 horas 
percebe-se uma diminuição da proliferação celular em 48 horas e uma mudança na 
morfologia celular, portanto foi mantida apenas a análise em 30 horas decultivo após 
o estresse mecânico (rasgo). 
Os resultados obtidos foram avaliados conforme a formulação abaixo: 
 
% da área de cobertura 30 h = Área em 30 h x 100 - 100 
 Área em T0 
 
47 
 
Figura 15- Imagens da monocamada de fibroblastos L929 antes e após o ensaio de Scratch 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ilustração das imagens do cultivo celular utilizando o software ImageJ1.46r para avaliação A). 
Representa o cultivo de fibroblastos L929 em monocamada após confluência de 48horas. B) Imagem 
da monocamada no tempo zero após execução do scratch e como análise da área formada na 
monocamada. C) Imagem do campo da placa de cultivo de um ensaio após 48 horas do scratch com a 
marcação da análise da área demarcada indicando a diminuição da área e um subsequente aumento 
na área de cobertura do rasgo através da proliferação celular. 
 
 
4.4 Analise estatística 
 
Os resultados obtidos nos experimentos foram expressos em média ± erro 
padrão da média (E.P.M.) e analisados estatisticamente por Teste