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Curso: Diagnóstico de Tuberculose – Método de Ogawa-Kudoh
Módulo 4: Recepção e Processamento das Amostras em Meio de Ogawa-Kudoh
Curso
Diagnóstico de Tuberculose -
Método de Ogawa-Kudoh
Módulo 4
Recepção e Processamento das 
Amostras em Meio de Ogawa-Kudoh
Expediente
Produzido por
Núcleo de Doenças Infecciosas da 
Universidade Federal do Espírito Santo 
(NDI/UFES) - Vitória / ES
Equipe responsável
Moisés Palaci
Solange Alves Vinhas
Eunice Atsuko Totumi Cunha
Luiz Guilherme Schmidt Castellani
Rosalia Maia
Adaptação pedagógica
Lucy Maria Bez Birolo Parucker
Helena Cristina Franz
Darcita Buerger Rovaris
Breno Biagotti
Artemir Coelho de Brito 
Nicole Menezes de Souza
Diagramação
Bruna Goddini de O. Ferreira
Apoio
OPAS/OMS - Organização Pan-Americana 
da Saúde
Sumário
1.Introdução 4
2.Processamento das amostras 4
3.Descontaminação por NaOH a 4% e inoculação 6
4. Leitura das culturas 8
5. Coloração Ziehl-Neelsen dos crescimentos 10
6. Resultados observados 11
7. Prosseguimento do diagnóstico laboratorial 13
8. Redescontaminação ácida 15
9. Identificação do crescimento das culturas 17
10. Avaliação de crescimento em PNB e TCH 19
11. Monitoramento das culturas 22
12. Outros métodos de identificação 26
13. Referências 27
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Módulo 4: Recepção e Processamento das Amostras em Meio de Ogawa-Kudoh
1.Introdução
A padronização de condutas técnicas é condição para que ações 
implementadas produzam resultados que possam ser submetidos a 
ferramentas de análise e avaliação e permite averiguar se as expectativas 
foram alcançadas de acordo com as metas estabelecidas, podendo indicar 
mudanças mais assertivas na condução do processo, quando necessário. 
Para que se possa avaliar o impacto do exame de cultura no diagnóstico e no 
controle da tuberculose, é necessário que todas as etapas relacionadas a esse 
procedimento sigam rigorosamente os protocolos estabelecidos.
Assim, buscando a padronização e a qualidade necessária ao exame de 
cultura de materiais clínicos em meio de Ogawa-Kudoh para o diagnóstico 
de tuberculose, neste módulo, serão apresentados os procedimentos para o 
recebimento, cadastro e processamento das amostras, redescontaminação 
ácida da cultura e identificação de micobactérias.
2.Processamento das amostras
O exame de cultura é um método sensível e específico para o diagnóstico 
das doenças causadas por micobactérias, principalmente a tuberculose (TB).
A maioria das amostras clínicas submetidas aos laboratórios de 
micobacteriologia são contaminadas por microrganismos da microbiota 
normal que crescem mais rapidamente que as micobactérias. Em virtude 
desse problema, as amostras devem ser submetidas a um processo de 
descontaminação que liquefaz os resíduos orgânicos e elimina os organismos 
indesejáveis na cultura, facilitando o crescimento das micobactérias.
Os agentes de descontaminação são tóxicos para os contaminantes, mas 
agridem também as micobactérias, embora com menor intensidade. Por esse 
motivo, para assegurar a recuperação do número máximo de micobactérias, o 
processo de descontaminação deve ser seguido rigorosamente e depende do 
tempo de exposição das micobactérias ao agente descontaminante e do meio 
de cultura a ser utilizado. Para o método de Ogawa-Kudoh, o descontaminante 
utilizado é o NaOH a 4%.
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Procedimentos para o recebimento de amostras:
• Ao chegar ao laboratório, as amostras e as requisições devem 
ser conferidas por dois técnicos para evitar possíveis erros de 
numeração ou troca de amostras;
• Obter, no programa de computador do laboratório, o último 
número cadastrado. A partir desta observação, iniciar a 
numeração das requisições dos exames;
• Recomenda-se que as amostras sejam cadastradas no sistema 
GAL pelo município de origem.
• Numerar cada exame com o respectivo número obtido no sistema 
de registro de amostras;
• Colocar as amostras em ordem de numeração crescente, e em 
seguida, identificar as lâminas com o número de registro da 
amostra.
Todas as amostras devem ser mantidas entre 2°C e 8°C, em refrigerador 
destinado exclusivamente para material não estéril, até o seu processamento. 
Recomenda-se que o resultado da baciloscopia seja liberado em 48 horas 
após a entrada no laboratório. Quando não for possível processar a cultura 
imediatamente, estas amostras podem ser armazenadas, em refrigerador de 
2°C a 8°C e mantendo sua viabilidade por no máximo 7 dias após a coleta
Para evitar enganos, trocas e contaminações cruzadas, recomenda-se 
processar no máximo 3 amostras de cada vez, respeitando um espaço entre 
os tubos de ensaio, evitando que os mesmos entrem em contato. Deve-se 
utilizar um tubo de ensaio com tampa de rosca e um swab estéril para cada 
amostra.
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Módulo 4: Recepção e Processamento das Amostras em Meio de Ogawa-Kudoh
3.Descontaminação por NaOH a 4% e inoculação
Materiais e equipamentos necessários:
• Jaleco de manga longa;
• Máscara N95 ou PFF2;
• Luvas descartáveis;
• Cabine de Segurança Biológica Classe II A2 ou B2 ou Bico de 
Bunsen;
• Estufa a 37ºC
• Solução de hipoclorito de sódio a 1%;
• Gaze;
• Solução de álcool a 70%;
• Solução de NaOH 4%;
• Tubos de ensaio, com tampa de rosca, e estante;
• Pipeta sorológica estéril;
• Swab estéril;
• Cronômetro;
• Caneta de retroprojetor;
• Tubos com meio Ogawa-Kudoh.
O processamento da amostra deve ocorrer dentro da Cabine de Segurança 
Biológica ou no bico de Bunsen. No caso de utilização de Cabines, as seguintes 
etapas devem ser seguidas:
1. Identifique os três tubos de ensaio e adicione, com o auxílio de 
uma pipeta sorológica estéril, 3 mL de NaOH a 4% em cada tubo. 
Durante este procedimento, abra somente um frasco por vez;
2. Coloque o swab na porção mais purulenta da amostra, girando 
para que o swab absorva uma parte da amostra. Mergulhe o swab 
no NaOH a 4% contido no tubo de ensaio;
3. Aguarde 2 minutos para descontaminação da amostra. Utilizar o 
relógio para marcar este tempo; Não ultrapassar os 2 minutos;
4. Após os 2 minutos, retire o excesso de solução descontaminante 
do swab apertando-o contra a parede do tubo de ensaio e semeie 
no meio de Ogawa-Kudoh, fazendo movimentos de zigue-zague, 
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cobrindo toda a superfície do meio. Feche os tubos e retire da 
Cabine de Segurança Biológica;
5. Incube todos os tubos inoculados a 37°C em estufa bacteriológica 
por um período de 48 horas. Após este período de incubação, 
confira se houve contaminação em todos os frascos. Conserve os 
meios incubados a 37°C em estufa bacteriológica com as tampas 
¼ de volta abertas. Sempre que retirar os frascos da estufa feche 
bem as tampas;
6. Utilizando dois palitos de madeira estéril, retirar da parte mais 
purulenta da amostra uma porção suficiente para ser espalhada 
por 2/3 da lâmina;
7. Ao término da preparação do esfregaço, despreze os palitos 
de madeira utilizados no procedimento em recipiente para 
descontaminação em autoclave;
8. Coloque as lâminas em placa aquecedora a 80°C por pelo menos 
1 hora. Se não tiver placa aquecedora, passe a lâmina com 
esfregaço já seco rapidamente, por três vezes, sobre a chama do 
bico de Bunsen, para fixação do material;
9. Não se deve aquecer a lâmina enquanto o esfregaço estiver sendo 
preparado, ou seja esfregaço úmido;
10. Feche bem o frasco das amostras já utilizadas, e, coloque-as em 
um espaço próprio reservado na bancada para as amostras já 
trabalhadas;
11. Guardar os frascos das amostras processadas em geladeira. As 
amostras devem ficar guardadas até a liberação do resultado 
da baciloscopia, caso seja necessário repetir o exame. Após a 
liberação desse resultado, descarteas amostras em recipiente 
para resíduo infectante de amostra biológica; e leve para 
descontaminação em autoclave;
12. Ligue a lâmpada ultravioleta (UV) da Cabine de Segurança 
Biológica, mantendo-a por 15 minutos. Passado esse tempo, 
desligue a lâmpada UV, acondicione corretamente o recipiente 
de resíduo biológico e leve para descontaminação em autoclave 
em ciclo de 30 minutos;
Alguns municípios não têm em seus laboratórios a Cabine de Segurança 
Biológica (CSB), entretanto, a metodologia de Ogawa-Kudoh gera poucos 
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aerossóis, podendo ser realizada fora da cabine e na presença de um bico 
de Bunsen. Se for este o caso, mantenha atenção redobrada quanto à 
biossegurança na manipulação das amostras biológicas e no uso de fogo.
4. Leitura das culturas
A próxima etapa de averiguação das amostras é a realização da leitura dos 
resultados da cultura. A velocidade de crescimento de colônias nos meios 
utilizados no laboratório é um dado importante, uma vez que junto com outros 
resultados laboratoriais ajudará na identificação correta do microrganismo 
em crescimento. 
Além disso, pode-se observar se as colônias em crescimento nos meios 
estão livres de outros microrganismos. Durante a leitura das culturas, 
observa-se a morfologia e a coloração das colônias crescendo no meio sólido.
 
PRECAUÇÕES!
De forma geral, a leitura das culturas em meios sólidos não oferece 
risco de contaminação ao operador, devendo-se apenas observar 
se os frascos de cultura estão bem fechados e que a leitura dos 
mesmos seja sempre feita sobre uma bancada, com o devido 
cuidado para que os frascos não se quebrem.
Materiais utilizados durante a leitura das culturas:
• Frascos de meio Ogawa-Kudoh utilizados para a semeadura das 
amostras tratadas;
• Livro branco do Ministério da Saúde para registro das amostras;
• Sistema de Informação Gerenciador de Ambiente Laboratorial – 
GAL;
• Lupa com lâmpada fluorescente;
• Lâminas de microscópio;
• Caneta de retroprojetor;
• Recipiente próprio para descarte das culturas finalizadas.
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Observação dos frascos inoculados
1. Todas as culturas em meios sólidos devem ser lidas pelo menos 
uma vez por semana, por 8 semanas, e de preferência às segundas-
feiras, para se ter tempo durante a semana para dar andamento 
aos procedimentos cabíveis no caso de uma cultura positiva;
2. Cada frasco de meio de Ogawa-Kudoh deve ser observado 
cuidadosamente utilizando-se lupa, para se observar crescimento 
de qualquer tipo de microrganismo. Se não houver a lupa, observe 
cada tubo em ambiente bem iluminado;
3. Não sendo observado qualquer crescimento no meio de cultura, 
verificar a data de término desta cultura (8 semanas ou mais) 
e finalizá-la como negativa. Após este procedimento, emitir o 
resultado negativo no Livro Branco, na seção “RESULTADO POR 
TIPO DE EXAMES” - “CULTURA” e no Sistema de Informação 
Gerenciador de Ambiente Laboratorial – GAL;
4. Os frascos de cultura finalizados deverão ser então colocados 
no recipiente de descarte e encaminhados para a autoclavação 
antes de ser descartado;
5. Caso seja detectado o crescimento de qualquer colônia, registra-
se no Livro Branco, na seção “RESULTADO POR TIPO DE 
EXAMES” - “CULTURA” e também no GAL, todas as informações 
referentes a cada tubo de cultura, de cada amostra, como: data da 
leitura, número de colônias visualizadas de acordo com a escala 
semi-quantitativa, características morfológicas das colônias 
em relação à presença de pigmento, aspecto (lisa ou rugosa), e 
crescimento parcial ou total de cada tubo;
6. Os critérios para leitura das culturas em meio sólido são 
apresentados em escala semi-quantitativa.
Escala Semi-Quantitativa
Menos de 20 colônias = “cultura positiva” (registrar o 
número de colônias observadas)
De 20 a 100 colônias = “cultura positiva” (+)
Mais de 100 colônias separadas = “cultura positiva” (++)
Colônias confluentes (tapete) = “cultura positiva” (+++)
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 Para os laboratórios que realizam o método de Ogawa-Kudoh e não 
possuem a Cabine de Segurança Biológica, não realizar baciloscopia dos 
crescimentos observados. Os tubos de cultura onde são visualizadas as 
colônias devem ser encaminhados para um laboratório de referência, uma 
vez que a baciloscopia realizada a partir de colônias aumenta muito o Risco 
Biológico dentro do laboratório, e, portanto, o risco maior de contaminação 
aos profissionais.
5. Coloração Ziehl-Neelsen dos crescimentos
A cultura é então encaminhada para que seja feito um esfregaço do 
crescimento observado:
1. Com um palito estéril e de ponta fina, colete uma pequena 
porção da colônia em crescimento, transferindo-a para o círculo 
delimitado na lâmina, tentando fazer uma fina camada desta 
cultura;
2. Caso sejam detectadas colônias diferentes, prepare esfregaços 
separados de cada uma delas;
3. Fixe o esfregaço por 2 horas em chapa a 80°C;
4. Core os esfregaços utilizando a coloração de Ziehl-Neelsen;
5. Cada esfregaço é observado cuidadosamente ao microscópio 
para verificar se o crescimento observado nos meios sólidos é de 
Bacilo Álcool-Ácido Resistente (BAAR) ou não;
6. Se o esfregaço for BAAR +, observe se há algum tipo de 
contaminação, isto é, se há algum outro organismo corado 
(observar se há estruturas diferentes da estrutura das 
micobactérias);
7. O resultado da leitura dos esfregaços é registrado na planilha 
Ziehl-Neelsen registrando as seguintes observações:
• BAAR POSITIVO ou NEGATIVO;
• Presença de Bactérias/Fungos POSITIVO ou NEGATIVO.
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6. Resultados observados
Após a leitura, registrar os resultados dos crescimentos e das baciloscopias 
no programa de registro do laboratório. Os diferentes encaminhamentos 
serão tomados a partir dos resultados observados.
Cultura BAAR positiva sem contaminação:
• Observar o histórico da pessoa para a verificação da presença de 
outras amostras positivas;
• Se houver crescimento de 1 a 20 colônias, fazer o subcultivo 
dessas colônias;
• Se houver aparecimento de muitas colônias, porém com 
crescimento pobre, ou seja, colônias pequenas, esta cultura deve 
voltar para incubação a 37°C na estante nomeada de “CULTURAS 
POSITIVAS”, até que haja um crescimento suficiente para dar 
sequência ao diagnóstico laboratorial;
• Caso haja desenvolvimento de grande número de colônias, com 
crescimento exuberante, e sendo esta a primeira cultura positiva 
dessa pessoa, encaminhar a amostra para identificação de 
espécie e armazenamento;
• Caso haja, no histórico da pessoa, relato de outras culturas e 
BAAR em processo de identificação ou já identificadas como 
Mycobacterium tuberculosis num período menor do que 2 meses, 
esta última cultura positiva é registrada como positiva secundária 
e apenas armazenada;
• Caso o resultado do teste de identificação não seja compatível 
com o Complexo Mycobacterium tuberculosis, isto é, PNB 
POSITIVO e TCH POSITIVO, faça um esfregaço de cada um dos 
frascos, incluindo o frasco controle, para confirmar a presença 
de BAAR sem contaminação. Também, verificar o histórico da 
pessoa e encaminhar a amostra para posterior identificação da 
espécie.
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Cultura BAAR positiva com contaminação:
• Esta cultura deve ser encaminhada para redescontaminação 
ácida e deverá ser observada semanalmente, como as demais 
culturas de rotina;
• Quando for detectado crescimento e verificado ser uma cultura 
pura, deve-seencaminhar como cultura BAAR POSITIVA sem 
contaminação.
Cultura BAAR negativa com contaminação:
• Se a contaminação for total, isto é, tomar toda superfície do meio 
sólido, descarte esta cultura no recipiente próprio e registre no 
laboratório como uma cultura contaminada;
• Se a contaminação for parcial, isto é, se ainda restar a maior 
parte da superfície do meio sólido para crescimento de 
microrganismos, e, se ainda não alcançou a data prevista para a 
finalização desta cultura, registre a contaminação no programa 
como contaminação parcial, e, retorne o frasco da cultura 
para a estufa. Também, esta amostra continuará sendo lida 
semanalmente até completar 8 semanas, quando será finalizada 
como cultura negativa.
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7. Prosseguimento do diagnóstico laboratorial
Subcultivo (Repique) das culturas
Trata-se de uma etapa que consiste na preparação de uma suspensão 
bacteriana, a partir de uma cultura com raras colônias que serão inoculadas 
no meio de Ogawa-Kudoh ou outros meios, com o objetivo de aumentar a 
carga bacteriana para a realização das provas de identificação das espécies 
de micobactérias, e dos testes de sensibilidade aos antimicrobianos. Este 
procedimento necessita de um crescimento bacteriano abundante de 
micobactérias. Para realização dessa etapa, utiliza-se os seguintes materiais:
Materiais e equipamentos necessários:
• Jaleco de manga longa;
• Máscara N95 ou PFF2;
• Luvas descartáveis;
• Cabine de Segurança Biológica Classe II A2 ou B2;
• Solução desinfetante (ex.: solução de hipoclorito de sódio a 1%);
• Micropipetas e ponteiras estéreis de 1 ml e 0,2 ml;
• Água destilada estéril;
• Estante para tubos 20 x 150mm;
• Etiqueta para identificação dos tubos;
• Agitador mecânico (vórtex);
• Gaze estéril em pedaços;
• Alças descartáveis estéreis;
• Tubos de ensaio 10 x 100 mm, com tampa de rosca, contendo 10 
pérolas de vidro estéreis;
• Tubos de meio Ogawa-Kudoh;
• Água Destilada Estéril;
• Solução de álcool a 70%;
• Estufa 37°C.
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Procedimentos:
1. Inicialmente, identifique os tubos com pérolas de vidro e os tubos 
contendo meio de Ogawa-Kudoh com o respectivo número da 
cultura a ser subcultivada. A seguir, coloque os tubos de ensaio 
com pérolas e os de meio de cultura em uma mesma estante;
2. Transfira para um tubo de ensaio com tampa de rosca, 10 x 100 
mm (de paredes reforçadas), contendo 10 pérolas de vidro e 0,2 
(até 0,5 mL) de água destilada, estéreis;
3. Homogeneíze em agitador mecânico (vórtex) por 20 a 30 
segundos;
4. Mantenha em repouso por 10 minutos;
5. Inocule com micropipeta e ponteira estéril 0,1 mL da suspensão 
em 2 tubos com meio de Ogawa-Kudoh, tentando banhar toda a 
superfície do meio;
6. No caso de existir água de condensação nos tubos de meio de 
Ogawa-Kudoh, despreze a mesma sobre gaze ou papel de filtro 
estéreis antes de inocular;
7. Feche os tubos sem rosquear a tampa até o fim, deixando 
levemente frouxa, ¼ de rosca, e coloque-os na estante;
8. Acondicione os tubos de meios de cultura, inclinados em uma 
bandeja de polipropileno, de maneira que o lado da tampa fique 
ligeiramente mais elevado e com a superfície do meio voltada 
para cima. Cuidado especial para não sobrepor os tubos, evitando 
acidentes ao transportar a bandeja. Identificar na bandeja a data 
de inoculação;
9. Incube os tubos inoculados em estufa de 37°C;
10. Estes tubos devem ser lidos semanalmente por 3 semanas, 
quando as culturas estarão prontas para serem utilizadas.
OBS.: Apenas um tudo de cultura deverá ser aberta por vez.
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8. Redescontaminação ácida
Trata-se de um método utilizado para descontaminar culturas de 
micobactérias contaminadas por outros microrganismos. Como a rotina 
utiliza no procedimento uma descontaminação alcalina, pode ser que o 
microrganismo contaminante tenha uma resistência relativa ao pH alcalino, 
e, ao utilizar uma redescontaminação ácida, as chances de eliminar os outros 
microrganismos serão maiores, por isso a indicação dessa redescontaminação 
ácida. Neste sentido, se recomenda a utilização dos seguintes materiais para 
essa etapa:
Materiais e equipamentos necessários:
• Jaleco de manga longa;
• Máscara N95 ou PFF2;
• Luvas descartáveis;
• Cabine de Segurança Biológica Classe II A2 ou B2;
• Solução desinfetante (ex: Solução de hipoclorito de sódio a 1%);
• Tubos de centrífuga de polipropileno, de 50 mL, de fundo cônico 
com tampa de rosca;
• Alça bacteriológica descartável estéril (meio sólido) ou pipeta 
pasteur descartável estéril (meio líquido);
• Solução de Ácido Sulfúrico 4%;
• Solução de NaOH a 4%;
• Tampão Fosfato 0,067M, pH 6,8;
• Solução de Vermelho de Fenol 0,4%;
• Agitador mecânico (vórtex);
• Estantes para tubo de centrífuga de 50 ml;
• Centrífuga com rotor selado, com adaptadores para tubos de 50 
mL;
• Cronômetro;
• Pipetas Sorológicas de 5 mL;
• Caneta de retroprojetor;
• Gaze;
• Solução de álcool a 70%.
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Procedimentos:
1. Dando prosseguimento à realização da cultura, com o auxílio de 
uma alça bacteriológica, retire parte da cultura contaminada, e 
transfira para um tubo de centrífuga de 50ml contendo 5mL de 
tampão fosfato (0,067M, pH 6,8);
2. Acrescente igual volume de solução de ácido sulfúrico 4%;
3. Feche o tubo fortemente, agite em vórtex por 20 segundos;
4. Deixe por 15 minutos para descontaminação;
5. Adicione a cada tubo de tampão fosfato até completar o volume 
até 50mL, para diluir a ação descontaminante;
6. Centrifugue os tubos a 3000xg, por 15 minutos a 4°C;
7. Descarte o sobrenadante, em recipiente a prova de respingo, 
adicione 1 gota de vermelho de fenol e neutralize com NaOH 
4% até que a solução mude para uma coloração rosa pálido. Ao 
adicionar o vermelho de fenol à amostra, tome cuidado para não 
ultrapassar a quantidade indicada, porque dessa forma ter-se-á 
que adicionar uma maior quantidade de NaOH 4%, o que diluiria 
a quantidade de bacilos existentes;
8. Inocule em meio Ogawa-Kudoh com 200μl dessa suspensão e 
incube a 37°C;
9. Deixe as tampas dos frascos semi-abertas;
10. Faça leitura das culturas semanalmente até aparecer o 
crescimento;
11. Caso haja crescimento, fazer um esfregaço e corar pelo método 
de Ziehl-Neelsen para verificar se a cultura está livre de 
contaminantes, e seguir com a identificação dos microrganismos 
em crescimento.
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9. Identificação do crescimento das culturas
O Mycobacterium tuberculosis é a espécie cultivável de maior importância 
médica por ser o principal agente etiológico da TB que, juntamente com 
Mycobacterium bovis e outras oito espécies que formam o Complexo 
Mycobacterium tuberculosis (CMTB). Embora outras espécies patogênicas 
e potencialmente patogênicas sejam isoladas em uma frequência baixa em 
nosso meio, é importante que os laboratórios de referência possam identificá-
las completamente para otimizar o diagnóstico e o tratamento da TB.
Neste sentido, para diferenciar o CMTB das demais espécies de 
micobactérias, deve-se determinar as seguintes características fenotípicas:
• Velocidade de crescimento da micobactéria no meio de cultura;
• Aspecto macroscópico das colônias;
• Aspecto microscópico das colônias, e;
• Avaliação de crescimento em PNB e TCH.
Velocidade de crescimento no meio de cultura
>7 dias = micobactérias de crescimento lento (MCL), e;
<7 dias = micobactérias de crescimento rápido (MCR).
Aspecto macroscópicodas colônias
Essa avaliação está indicada na cultura original em meio sólido. Nesses 
meios, as colônias de micobactérias cultivadas apresentam diferentes 
morfologias e pigmentação. A morfologia das colônias pode ser lisa ou rugosa, 
seca ou cremosa, opaca ou transparente. A pigmentação é também, uma 
característica importante utilizada na classificação macroscópica das colônias 
e pode variar de laranja a amarelo intenso.
Aspectos fenotípicos
Alguns aspectos fenotípicos devem serem observados e anotados, 
de preferência com uma lupa manual em um ambiente iluminado, 
tais como:
• Aspecto da colônia: lisa ou rugosa, seca ou cremosa, opaca ou 
transparente;
• Pigmentação da colônia: sem pigmentação ou acromógena (cor 
bege), pigmentada (laranja, amarela, salmão).
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Leitura e interpretação
• Colônia de Mycobacterium tuberculosis: acromógena, geralmente 
de cor creme, colônia rugosa com aspecto de couve-flor, seca e 
opaca.
• Colônia de micobactéria não causadora de tuberculose: 
pigmentada ou acromógena, lisa ou rugosa, seca ou cremosa, 
opaca ou transparente.
Aspecto microscópico das colônias
Análise microscópica das colônias
Uma vez realizada a análise macroscópica, faz-se uma leitura do 
esfregaço corado por Ziehl-Neelsen com vistas a observar as 
características das bactérias.
Leitura e interpretação
• Bacilo Álcool-Ácido Resistente positivo: bacilos corados em 
cor rosa fúcsia.
• Formação de corda positiva: bacilos em paliçada com um 
aspecto de corda ou grumos compactos assemelhando-se a um 
borrão de corantes.
• Formação de corda negativa: bacilos dispersos no esfregaço, 
geralmente, com tamanho diferente do observado para membros 
do Complexo Mycobacterium tuberculosis.
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10. Avaliação de crescimento em PNB e TCH 
O objetivo do uso deste método é diferenciar as espécies do complexo 
Mycobacterium tuberculosis das demais espécies do gênero, avaliando seu 
crescimento em presença de ácido p-nitrobenzóico e hidrazida do ácido 
tiofeno-2-carboxílico. A seguir, será mostrado o material a ser empregado no 
procedimento:
Materiais e equipamentos necessários:
• Cabine de Segurança Biológica Classe II A2 ou B2;
• Solução desinfetante (ex.: Solução de hipoclorito de sódio a 1%);
• Tubo com tampa de rosca (5mL) contendo 3mL do meio Ogawa-
Kudoh;
• Tubo com tampa de rosca (5mL) contendo 3mL do meio Ogawa-
Kudoh contendo 500 μg/mL de PNB;
• Tubo com tampa de rosca (5mL) contendo 3mL do meio Ogawa-
Kudoh contendo 5 μg/mL de TCH;
• Estante para tubos de 5mL;
• Etiqueta para identificação dos tubos;
• Swabs;
• Tubos de Hemólises e estante para tubos de Hemólise;
• Água Destilada Estéril;
• Estufa 37°C.
Procedimentos:
• Antes de realizar o teste de identificação, deve-se fazer um 
esfregaço da cultura e, corar por Ziehl-Neelsen para se certificar 
que as mesmas são realmente micobactérias e que nesta cultura 
não haja contaminantes;
• Cada teste é realizado utilizando-se 1 tubo controle (Ogawa-
Kudoh sem droga); 1 tubo PNB (Ogawa-Kudoh com 500 μg/
mL de PNB) e 1 tubo TCH (Ogawa-Kudoh com 5 μ/mL de TCH). 
Numere cada um destes tubos com o número da amostra a ser 
testada (Figura 1);
• Adicione 3 mL de água destilada estéril em um tubo de hemólise;
• Introduza o swab neste tubo, evitando encharcá-lo muito (Figura 
1);
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• Toque a cultura a ser testada com esse swab, e em seguida, passar 
no tubo Controle fazendo uma linha reta (Figura 1);
• Toque novamente a cultura a ser testada com o mesmo 
SWAB úmido, e passe-o no tubo de PNB. A seguir, descarte 
apropriadamente este SWAB (Figura 1);
• Introduza outro swab em um tubo de hemólise contendo água, 
sem encharcá-lo; toque a cultura com este segundo swab e 
passe-o no tubo de TCH, fazendo uma linha reta (Figura 1);
• Feche os frascos deixando a tampa semi-aberta;
• Incube em estufa a 37ºC por duas semanas até a leitura;
• Após duas semanas, compare o crescimento das micobactérias 
apresentada nos tubos com as drogas, com o crescimento no 
tubo de controle;
• Interprete os resultados de acordo com o quadro abaixo:
Figura 1. Procedimentos com culturas positivas e 
crescimento de 21 a 28 dias.
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ATENÇÃO! 
Este teste deve ser realizado com culturas positivas com 
crescimento de 21 a 28 dias. Deve-se realizar, paralelamente, um 
teste com uma cultura de M. tuberculosis (cepa de referência) como 
controle de qualidade do teste. Outra maneira de se controlar este 
teste, é conferindo o resultado do controle de qualidade daquele 
lote de meio de cultura produzido contendo as drogas.
Quadro 1. Interpretação dos resultados das culturas
Conclusão do Teste PNB TCH CTRL
MOTTa + (+) +
Complexo Mycobacterium tuberculosis - V +
Mycobacterium tuberculosis - + +
Mycobacterium bovis e M. africanumb - - +
Repetir o teste + V -
Repetir o teste - + -
Legenda:
+ = presença de crescimento abundante. - = ausência de 
crescimento.
v = variáveis algumas espécies apresentam resultado positivo e 
outras negativo.
a = MOTT: micobactérias outras que não a do Complexo M. 
tuberculosis.
b = quando se observar resultado compatível com estas espécies, 
proceder a testes complementares (niacina, nitrato e sensibilidade a 
pirazinamida).
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11. Monitoramento das culturas
Observe os resultados da baciloscopia e da cultura para avaliar o 
procedimento de descontaminação.
Princípio
• Resultados de baciloscopia positiva e cultura positiva e resultados 
de baciloscopia negativa e cultura negativa ou positiva: o lote do 
reagente está adequado e próprio para o uso.
• Resultado de baciloscopia negativa e cultura positiva confirmam a 
efetividade do reagente e do procedimento de descontaminação, 
porque a cultura é um método mais sensível que a baciloscopia.
• Resultados de baciloscopia positiva e cultura negativa indicam 
que o reagente utilizado está com nível de concentração mais 
alto do que o especificado e, portanto, impróprio para uso. Nesse 
caso, o lote do reagente está inadequado e não pode ser utilizado.
• Amostras com baciloscopia positiva e com cultura negativa
Interpretação dos resultados:
• Se a amostra foi coletada com o objetivo de controle de 
tratamento, o resultado pode refletir simplesmente que o 
paciente está eliminando bacilos inviáveis e que o tratamento 
está efetivo;
• Se a amostra foi coletada com o objetivo de diagnóstico, 
verificar se esse tipo de resultado se repete e investigar o 
controle microbiológico do lote de meios de cultura em uso, a 
concentração e o tempo de contato do reagente descontaminante 
ou a temperatura da Estufa bacteriológica a 37°C. Observar se a 
temperatura não excedeu o limite aceitável.
Culturas contaminadas:
• Se houve muito tempo entre a coleta e o processamento da 
amostra, corrigir o fluxo de rotina de trabalho do laboratório ou 
reorganizar o sistema de transporte de amostras.
• Se as contaminações se repetem em culturas do mesmo paciente, 
utilizar técnicas mais robustas de descontaminação.
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Contaminações sistemáticas:
Se várias contaminações ocorreram num mesmo dia, com 
todas as amostras descontaminadas ou com todas as amostras 
provenientes de um mesmo lugar:
• Descartar os reagentes;
• Verificar os procedimentos técnicos de descontaminação;
• Observar se houve desvios dasnormas técnicas e se as correções 
técnicas foram feitas na ocasião em que essas foram detectadas;
• Organizar o transporte e a rotina de trabalho do laboratório no 
caso em que a demora no processamento, seja a consequência da 
demora desde a coleta;
• Treinar o profissional que tenha sido identificado como 
o responsável pelo processamento das amostras que 
contaminaram.
Contaminação cruzada
A ocorrência de uma concentração de culturas positivas em 
sequência num curto período de tempo é um sinal de alerta para a 
investigação de uma possível situação de contaminação cruzada 
entre as culturas realizadas. 
Um resultado falso-positivo pode ocorrer e ser registrado como 
tal, quando uma amostra foi contaminada antes ou durante o 
processamento do exame por outros organismos álcool-ácido 
resistentes, não originários do paciente ou quando os registros 
do paciente ou os resultados de seus exames foram registrados 
de forma incorreta. 
Uma cultura falso-positiva significa que o resultado de uma 
amostra proveniente de um paciente é declarado positivo para 
uma espécie de micobactéria, quando, na realidade, o paciente 
não tem doença por essa determinada micobactéria.
É preciso examinar com atenção alguns sinais típicos de que falso-
positivos estão ocorrendo, por exemplo:
• Um aumento repentino no número de isolamentos de um 
determinado microrganismo;
• Não correlação entre os isolamentos e sinais clínicos da doença;
• Uma discrepância entre os resultados da baciloscopia e os 
resultados da cultura;
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• O surgimento de um grupo de culturas positivas: quando uma 
cultura se torna positiva e alguns dias depois uma sequência de 
culturas, também se tornam positivas;
• Quando uma ou várias amostras envolvidas no episódio 
resultaram em culturas com crescimento de raras colônias 
(menos de 10 colônias), e, se essas amostras foram processadas 
imediatamente depois de uma amostra com baciloscopia positiva.
Quando estes sinais forem identificados, verificar a seguir:
• Se os pacientes envolvidos nesse grupo de culturas positivas têm 
dados clínicos compatíveis com tuberculose;
• Se outras amostras do mesmo paciente também tiveram 
resultado positivo;
• Não havendo confirmação desses dados é preciso procurar 
estratégias para eliminar ou modificar esses casos de falso-
positivos. A contaminação cruzada pode ter acontecido, a partir 
de uma amostra com alta carga bacilar ou através dos reagentes 
contaminados com bacilos. Para tanto, verificar se:
• Os reagentes utilizados no processamento das amostras 
estão sendo aliquotados para uso diário;
• Está sendo obedecida a ordem sistemática de processar em 
primeiro lugar amostras de sítios estéreis e, por último as 
amostras com alta carga bacilar;
• O tempo de repouso que os tubos devem ser deixados ao sair 
da centrífuga está sendo respeitado;
• O descarte do líquido sobrenadante está sendo feito com 
cuidado e suavidade em recipiente apropriado.
Enfim, diante da suspeita de contaminação cruzada, se possível, encaminhar 
as culturas envolvidas nesse episódio a um laboratório de referência para 
genotipagem.
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O propósito dos vídeos foi auxiliar profissionais da saúde na preparação 
do meio de cultura de Ogawa-Kudoh. Lembre-se de sempre revisar os 
procedimentos e ficar atento às normas de biossegurança, dada as limitações 
de acesso dos países em desenvolvimento aos exames diagnósticos 
tradicionais e às novas tecnologias podem ocasionar muitos problemas como:
• Diagnóstico sem confirmação bacteriológica levando ao 
tratamento desnecessário da doença;
• Sub-diagnóstico da tuberculose levando a morbidade e 
mortalidade individual, bem como sua transmissão na 
comunidade;
• Diagnóstico tardio de resistência aos fármacos, levando à 
aquisição de resistência primária, bem como, a elevada morbidade 
e a continuidade da transmissão, e os; 
• Gastos públicos substanciais que poderiam ser evitados.
O exame de cultura de Ogawa-Kudoh como mostrado nos vídeos pode 
contribuir para evitar que estas situações não ocorram, uma vez que se trata 
de uma técnica robusta para o diagnóstico da tuberculose, que permite:
• Detectar o M. tuberculosis com elevada acurácia e baixo custo;
• Isolar e identificar não apenas M. tuberculosis, mas, também 
outras espécies do género causadoras da infecção não 
tuberculosa;
• Detectar e avaliar o nível de resistência bacteriana a todos 
os fármacos disponíveis, e;
• Monitorar o tratamento pela detecção de bactérias viáveis.
Também, espera-se que esses vídeos tutoriais ajudem a difundir o exame 
de cultura pelo método de Ogawa-Kudoh no país, a fim de torná-lo “Universal” 
nos serviços de saúde, com acesso a todas as pessoas com TB e MNT das 
unidades de saúde. 
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12. Outros métodos de identificação 
As micobactérias podem ser identificadas por outras técnicas metodológicas 
além das já descritas anteriormente, tais como o MPT64 e o PRA-hsp65
MPT64
As micobactérias podem ser identificadas por outras técnicas 
metodológicas como o teste de detecção do antígeno MPT64, que é um 
imunoensaio cromatográfico rápido para identificação qualitativa do CMTB, 
com uso do anticorpo monoclonal anti-MPT64, em combinação com sistemas 
de cultura sólida (colônia e fluido de condensação) e líquida, de fácil execução. 
O teste somente é utilizado para o diagnóstico in vitro.
PRA (análise de restrição enzimática do gene hsp65) (PRA-hsp65) 
O PRA é um teste utilizado para identificação de cepas de MNT isoladas 
em cultura de espécimes clínicas. O diagnóstico definitivo de infecções por 
micobactérias depende do isolamento e identificação dos agentes causadores 
e requer uma série de testes fisiológicos e bioquímicos específicos, em função 
de as espécies de micobactérias apresentarem diferentes sensibilidades 
a drogas, e, portanto, é importante a sua identificação para a adoção do 
tratamento medicamentoso adequado. Diante da impossibilidade de 
identificação a nível de espécie, encaminhar para sequenciamento genético.
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13. Referências
SENNA, Simone Gonçalves et al . Identificação de micobactérias não 
tuberculosas isoladas de sítios estéreis em pacientes em um hospital 
universitário na cidade do Rio de Janeiro. J. bras. pneumol., São Paulo , v. 
37, n. 4, p. 521-526, Aug. 2011 . Available from <http://www.scielo.br/
scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1806-37132011000400015&lng=e
n&nrm=iso>. access on 23 Sept. 2020. https://doi.org/10.1590/S1806-
37132011000400015.
MADHUKAR PAI e JENNIFER FURIN. Tuberculosis innovations mean little 
if they cannot save lives.eLife 2017;6:e25956. DOI: 10.7554/eLife.25956. 
WHO, World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis 
control. Part III. Culture. Genebra: WHO, 1998.
KUDOH, S.; KUDOH, T. A simple technique for culturing tubercle bacilli. 
Bulletin of the Genebra: WHO, 51:71-82., 1974.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Centro de 
Referência Professor Hélio Fraga. Manual de Bacteriologia da Tuberculose. 3ª 
edição comemorativa, Rio de Janeiro, Brasil, 2005.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. 
Departamento de Vigilância Epidemiológica. Manual nacional de vigilância 
laboratorial da tuberculose e outras micobactérias. Brasília: Ministério da 
Saúde, 2008.
	1.Introdução
	2.Processamento das amostras
	3.Descontaminação por NaOH a 4% e inoculação
	4. Leitura das culturas
	5. Coloração Ziehl-Neelsen dos crescimentos
	6. Resultados observados
	7. Prosseguimento do diagnósticolaboratorial
	8. Redescontaminação ácida
	9. Identificação do crescimento das culturas
	10. Avaliação de crescimento em PNB e TCH 
	11. Monitoramento das culturas
	12. Outros métodos de identificação 
	13. Referências