Cromatografia por Bioafinidade - Prof Castelo

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Cromatografia por Bioafinidade
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Introdução
• A cromatografia por bioafinidade baseia-se nas propriedades
biológicas ou funcionais das espécies que interagem: a substância
a ser separada e a fase estacionária.
• Isolamento seletivo de macromoléculas biológicas, através da
utilização das propriedades dessas substâncias de unirem-se
reversivelmente ligantes específicos, geralmente fixos a uma
matriz.
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Introdução
• As moléculas que não possuem afinidade com o ligante passam
pela coluna sem serem retidas, enquanto as macromoléculas
capazes de se unirem a ele, são retidas de forma diferencial,
consoante sua afinidade coma fase estacionária
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Histórico
• 1910: Starkenstein ligou α-aminalase em amido insolúvel para a
separação de enzimas e anticorpos.
• 1936: Landsteiner e Von der Scheer inroduziram o método de
acoplamento covalente.
• 1951: Campbell e colaboradores, empregando anticorpos anti-
haptenos, conseguiram purificar a tirosinase. Eles utilizaram uma
forma ativada de celulose para imobilizar covalentemente a
albumina sérica e isolar anticorpos anti-albumina.
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Histórico
• 1960-1970: Cuatrecasas e colaboradores purificaram enzimas
(nuclease de origem bacteriana, carboxipertidades A e α-
quimotripsina). Eles desenvolveram colunas usando um inibidor
de nuclease para purificação de proteínas.
• 1960-1970: Porath e colaboradores conseguiram purificar
proteínas com base em sua seletividade diferencial por íons
metálicos imobilizados na matriz.
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Fundamentos
• Princípio de bioafinidade: a cromatografia por Bioafinidade
difere-se da cromatografia clássica, pelo fato de a proteína
conseguir ser separada com base em uma propriedade
bioquímica.
Fig. 1 Princípio de separação por bioafinidade
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Fundamentos
Fig. 2 Mecanismo de separação por bioafinidade
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Fundamentos
• Princípios da separação por bioafinidade: a eluição pode ser feita
através da alteração do pH, força iónica do meio, modificação da
temperatura, uso do solvente específico.
Essas modificações tornam o complexo molécula-ligante menos
estável, o que leva consequentemente à sua dissociação.
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Fundamentos
Fig. 3 Princípios da separação por bioafindade
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Fundamentos
• Principais componentes em cromatografia por Bioafinidade
• Ligante: molécula que se liga reversivelmente à outra molécula 
ou grupo de moléculas.
• Braço espaçador: cadeia de hidrocarboneto que liga a matriz ao 
ligante.
• Matriz: suporte insolúvel e quimicamente inerte, que funciona 
como imobilizante do ligante.
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MATRIZ: Deve ser química 
e fisicamente inerte
BRAÇO ESPAÇADOR: usado 
para melhorar a ligação 
entre o ligante
e molécula-alvo, quando 
esta for muito grande
LIGANTE: molécula que se 
liga reversivelmente a uma 
determinada
molécula alvo ou um grupo 
de moléculas alvo. 12
Fundamentos
Fig. 4 Componentes principais da cromatografía por bioafinidade. 
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Fundamentos
• Seleção do suporte insolúvel ou matriz
Características
• Mecânica e químicamente estáveis.
• Resistentes a variação de pH, força iônica, temperatura,
agentes desnaturantes.
• Partículas esféricas, rígidas e porosas.
• Interagir fracamente com as macomoléculas.
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Fundamentos
• Tipos de matrizes
• Matriz de agarose
• Matriz de celulose
• Matriz de destrana
• Matriz de poliacrilamida
• Matriz de trisacril
• Outras matrizes orgânicas (Géis Hidroxialquilmetacrilato, géis 
de poliacrillamida-agarose)
• Matrizes inorgânicas (suporte de vidro)
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Fundamentos
• Preparação de fases estacionárias seletivas
A preparação da fase estacionária consiste na ativação da matriz e o 
subsequente acoplamento do ligante.
M-OH + A-R-B → M-OR-B + HA
M-OR-B + H-ligante → M-OR-ligante + HB
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Fundamentos
O braço espaçador é uma extenção do hidrocarboneto que se liga ao
suporte sólido e em seguida liga-se covalentemente o ligante
específico.
Fig. 5 Braço espaçador.
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Fundamentos
Substâncias com possibilidade de separação por cromatografia por
Bioafinidade.
Substância a ser isolada Substância imobilizada na matriz
Anticorpos Células, antígenos
Lectinas Polissacarídeos, Glicoproteínas
Ácidos nucléicos Histonas, enzimas específicas, sequência de bases
complementares
Células Proteínas específicas da superfície da célula, lectinas
Enzimas Inibidores competitivos, substratos, co-fatores
Proteínas (em geral) Corantes (com afinidade por sítios protéicos
específicos), íons metálicos (grupos eléctro-doadores
na superfície de proteínas)
Hormônios Proteína transportadora, vitamina do receptor
Tabela 1. Interações biológias
frequentemente usadas em
cromatografia por
bioafinidade.
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Fundamentos
• Fase móvel
A fase móvel em cromatografia por afinidade desempenha dois
papéis distintos.
• Permitir uma forte ligação das moléculas do analito com o
ligante.
• Uma vez que as espécies indesejáveis tenham sido removidas,
a fase móvel deve enfraquecer ou eliminar a interação entre o
analito e o ligante de forma que o analito possa ser eluído.
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Fundamentos
• Método operacional
• Preparação da coluna
• Dimensões da coluna
• Determinação da capacidade
• Preparação da amostra
• Efeito da vazão e temperatura
• pH
• Força iónica
• Eluição competitiva
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Aplicações
Esta técnica aplica-se em grande escala na Purificação é
quantificação de:
• Enzimas
• Antibióticos
• Antígenos
• Ácidos nucléicos
• Proteínas transportadoras
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Aplicações
• Proteínas repressoras
• Fármacos ou receptores hormonais
• Proteínas contendos grupos sulfídricos
• Complexos polirribossômicos específicos e multienzimáticos.
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Aplicações
• Vantagens
• Permite a purificação de uma biomolécula com base na sua 
função biológica. 
• Simples de executar e é uma ferramenta poderosa para a 
separação de macromoléculas biológicas 
• A elevada seletividade permite a purificação em uma etapa 
única.
• Papel importante na análise e estudo de sistemas biológicos
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