Aula 5-Diagnóstico parasitológico

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Diagnóstico Parasitológico
1
Introdução
Protozoários intestinais
Giardia duodenalis
Prevalência: 8 a 30% em países em desenvolvimento; 0,4 a 7,5% em países desenvolvidos
Cryptosporidium spp.
30 a 50% das mortes por diarreia em
crianças abaixo de 5 anos
Entamoeba histolytica
- 50 milhões de casos e 100 mil mortes por
ano
2
CDC, 2016
Introdução
Helmintos transmitidos pelo solo
Ascaris lumbricoides
807 milhões – 1,1 bilhão
Trichuris trichiura
609 – 795 milhões
Ancilostomatídeos	(Necator	americanus	e
Ancylostoma duodenale)
576 – 740 milhões
3
CDC, 2016
Introdução
Parasitos do sangue e tecidos
Leishmania spp.
Cutânea: 700 mil a 1,2 milhões novos casos por ano
Visceral: 200 mil a 400 mil novos casos por ano
Plasmodium spp.
2015: 214 milhões de novos casos de malária e 438.00 mortes
4
CDC, 2016
Introdução
Brasil: decréscimo da prevalência (?) -	muitas doenças não são de notificação obrigatória
Aumento da consciência sobre a importância das doenças parasitárias
Médicos:	não	vão	realizar	os	exames	mas	precisam	entender	as capacidades e limitações de cada método
Garcia, 2007; CDC, 2016
5
Abordagem ao paciente:
Necessidade do histórico completo: particularmente viagens
Sintomas podem ser sutis e mudar ao longo do tempo
Histórico geral também é importante: ocupação, hobbies, atividades de lazer, dieta, medicamentos
Dificuldade no diagnóstico clínico
Não permite diferenciação específica do agente infeccioso
Introdução
6
Introdução
Necessidade do diagnóstico laboratorial
do	agente
Diagnóstico incorreto: procedimento e interpretação
Tratamento	do	paciente:	demonstração	definitiva etiológico
Garcia, 2007.
7
PARASITOS INTESTINAIS
8
Exame parasitológico de fezes
EPF ou exame coproparasitológico:
Análise laboratorial a partir de amostra(s) de fezes
Não	faz	parte	dos	exames	complementares solicitados
não	consideradas	na
Parasitoses	intestinais hipótese diagnóstica
- Médico desconhece o EPF
Exames baratos, não invasivos, de fácil execução
- Evita a realização de exames mais invasivos, onerosos e complexos
9
Exame parasitológico de fezes
Reforçar as instruções de seguir as recomendações da coleta do material
Médico
Participação ativa: quem vai realizar a coleta
Paciente
10
Coleta e preservação das amostras
Maioria parasitos intestinais: detecção por exame de fezes
Outras	amostras:	urina,	escarro,	secreções	urogenitais,	aspirados,	tecidos,
conteúdo duodenal, amostras obtidas por biópsia
Fezes eliminadas no vaso sanitário ou no solo: inadequadas
Urina: destruição de
trofozoítos
Presença de organismos
de vida livre
11
Coleta e preservação das amostras
Estágios usuais de diagnóstico:
Ovos e larvas de helmintos
Cistos, oocistos e trofozoítos de protozoários
12
Coleta e preservação das amostras
Identificação segura e correta:
Critérios morfológicos
Coleta adequada
Boa preservação da amostra
Fragmentos de alimentos, células vegetais, grãos de pólen,
outros artefatos.
13
Fase Analítica
Exame macroscópico
Exame microscópico
14
Formadas
Semi-formadas
Pastosas
15
Líquidas
Cistos
Trofozoítos
Ovos e larvas de helmintos: em todos os tipos de amostras fecais, mas dificilmente encontrados em amostras líquidas
Exame Macroscópico
Tamisação
Vermes	adultos:
16
Ascaris
lumbricoides,
Enterobius
vermicularis,
proglotes das tênias
Vantagens:	demonstração de proglotes e escólices e pequenos helmintos
Exame Macroscópico
Tamisação
Exame Macroscópico
PROGLOTE MADURA
- Órgãos reprodutores ♂
e ♀ bem desenvolvidos
PROGLOTE GRÁVIDA
-Sem distinção dos órgãos
- Útero ramificado
Vermes Adultos (Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis)
42
Exames Microscópicos
18
Visualização:
Ovos ou larvas de helmintos
Cistos, oocistos ou trofozoítos de protozoários
Processos de enriquecimento e coloração
Métodos gerais: sedimentação espontânea e centrifugação
Exames Microscópicos
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Qualitativos: mais utilizados (presença de formas parasitárias)
Quantitativos:	contagem	de	ovos	nas	fezes	–	intensidade	do parasitismo
Pouco	utilizados:	medicamentos	antiparasitários	levam	em	conta	o	peso corporal e não a carga parasitária (Stoll-Hausheer e Kato-Katz*)
Exames Qualitativos
Exame Direto a Fresco
Simples e eficiente: trofozoítos vivos dos protozoários
Solução salina a 0,85% (cloreto de sódio) e iodo
Se uso da formalina: não precisa a solução salina
Amostras não refrigeradas
Princípio: avaliar carga parasitária; diagnóstico rápido
Movimentação de trofozoítos – com uso de solução salina
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Exames Qualitativos
Exame Direto a Fresco
Revisão de lâminas previamente negativas
Quantidade grande de amostra fecal
21
Exame Direto a Fresco
Uso de colorações temporárias:
Núcleos dos trofozoítos de amebas, cistos
Soluções indicadas: Iodo
Lugol (iodeto de potássio): diferentes concentrações
Quensel: diferencia os núcleos de três gêneros de amebas
Entamoeba, Iodameba e Endolimax
Sudan III, álcool etílico, azul de metileno e cloreto de cádmio
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Exames Qualitativos
Exames Qualitativos
Técnicas de concentração
Objetivos:
Aumentar	o	número	de	cistos,	oocistos	e	ovos	ou
larvas na preparação
Eliminar a maioria dos detritos fecais
Apresentar os organismos em um estado inalterado:
facilitar a identificação
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Técnicas de flutuação
Diferença	de	densidade	específica:	ovos	de	helmintos	e	cistos	e oocistos de protozoários e o material fecal
Reagentes de alta densidade
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Ovos considerados pesados: Ascaris, Taenia, Schistosoma e Fasciola
Formas
Densidade
Ovosecistos
1,05a1,15g/mL
Exames Qualitativos
Técnicas de flutuação
Formação na superfície do tubo de uma membrana clara com poucos detritos fecais
Remoção seletiva de cistos
e	ovos
mesmo	quando
em	pequenos
presentes números
-	Alta
reagentes:
densidade	dos
colapso da parede dos ovos e cistos – observação deve ser feita entre 10 e 20 minutos
Vantagens:
Desvantagens:
25
Exames Qualitativos
Técnicas de flutuação
Flutuação em solução saturada de cloreto de sódio (d=1,20g/mL) = Técnica de Willis
Ovos com densidade específica baixa: ancilostomatídeos
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de	trematódeos,	E.	vermicularis	e	A.
Não	recomendado	para	ovos
lumbricoides
Cistos de protozoários: retração
Exames Qualitativos
Técnicas de flutuação
Exames Qualitativos
Coar / filtrar as fezes (fezes frescas)
Homogeneização (Frasco de boca larga)
Adição de Solução NaCl
Homogeneização
Adição de NaCl (Menisco positivo)
Lamínula / 10 a 15 min
27
Técnicas de flutuação
Outras soluções com o mesmo princípio da Técnica de Willis:
Flutuação em solução saturada de sulfato de zinco (1,18 g/mL)
Flutuação em sulfato de magnésio e Cloreto de sódio
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Exames Qualitativos
Centrífugo – flutuação em solução saturada de sulfato de zinco (d=1,18 g/mL) = Técnica de Faust
Cistos de protozoários, ovos e larvas de helmintos
Não	é	adequada	para	ovos	de	trematódeos,	cestódeos	e	A. lumbricoides (inférteis)
Pode ser usada para fezes preservadas em formaldeído (5% ou 10%), SAF e APV (densidade deve ser ajustada para 1,20 g/mL)
29
Exames Qualitativos
Exames Qualitativos
Remover o
sobrenadante
Solução de
sulfato de zinco
30
Recolher a película
superficial com alça
650 x g
2 a 3 min
650 x g
Técnicas de sedimentação
Objetivos:
Aumento do número de ovos, larvas, cistos
Separação das gorduras e óleos
Gravidade (espontânea) ou centrifugação (MIFC)
Formas retidas no fundo do tubo
Detritos suspensos na superfície
Desvantagem: grande quantidade de detritos fecais
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Exames Qualitativos
Técnicas de sedimentação
Sedimentação espontânea = Método de Hoffman, Pons e Janer (HPJ)
Fundamento: sedimentação espontânea em água
Ovos, larvas e cistos
Vantagens:	necessidade	mínima	de	vidraria,	dispensável	o	uso	de reagentes e da centrifugação
Desvantagem: grande quantidade de detritos, dificulta a leitura das lâminas
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Exames Qualitativos
Técnicas de sedimentação
Sedimentação espontânea = Métodode Hoffman, Pons e Janer (HPJ)
Exames Qualitativos
33
Técnicas de sedimentação
Centrífugo-sedimentação pela formalina-éter ou Centrífugo-Sedimentação pela formalina-acetato de etila
Cistos de protozoários*
ovos e larvas de helmintos
pH da formalina pode afetar a recuperação:
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pH neutro é mais eficaz
Exames Qualitativos
pH
Parasito
10
OvosdeAscarislumbricoideseS.japonicum
Entre 4,0e7,0
Ancislostomatídeos
Exames Qualitativos
1 a 2g de fezes em água / filtrar
Completar o tubo com água
Centrifugar 650 x g / 1 min
Centrifugar
500 x g / 1 min
Ressuspender com formalina (10%/pH neutro)
Repouso por 5 min
Adicionar 3 mL de éter (ou acetato de
etila)
Fechar o tubo
Agitar vigorosamente (30s)
Analisar o sedimento
60
Centrífugo-sedimentação	pela	formalina-éter	ou	Centrífugo- Sedimentação pela formalina-acetato de etila
Exames Qualitativos
Restos fecais e
gordura
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Éter
Formalina
Sedimento
Métodos específicos para coccídios
Centrífugo-flutuação em solução saturada de sacarose = técnica de Sheather
Oocistos de Cryptosporidium spp.
Centrífugo-sedimentação pelo Formaldeído-Éter modificado
Oocistos de Cryptosporidium spp. e Cyclospora cayetanensis
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Exames Qualitativos
Métodos específicos para coccídios
Coloração de Ziehl-Neelsen
Coloração rosa ou vermelho / Fundo da preparação: azul
Exames Qualitativos
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Exames Quantitativos
Produção de ovos X carga parasitária
Ascaris lumbricoides
Trichuris trichiura
Ancilostomatídeos
Necator americanus
Ancylostoma duodenale
Schistosoma mansoni
65
Exames Quantitativos
66
Estimativa da contagem dos ovos varia em relação direta com a acuidade do procedimento
Intensidade da infecção: número de ovos encontrados
OPG = ovos por grama: índice de densidade dos ovos nas fezes
OPD = ovos por dia: multiplicação do OPG pelo peso total (g) do material fecal de 24 horas
OPD = OPG x g
OPDPF = ovos por dia por fêmea
OPDPF = OPD ÷ número de vermes
Exames Quantitativos
Método de Kato-Katz
Ovos de helmintos
Não é indicado para protozoários e larvas de helmintos
Vantagem: quantidade significativa de fezes – 50 a 60 mg
Lamínulas de celofane: glicerina e solução de verde malaquita
Melhora a visualização da lâmina
Torna os ovos mais visíveis
Necessidade de amostras frescas ou refrigeradas
67
Exames Quantitativos
Método de Kato-Katz
68
Exames Quantitativos
Método de Kato-Katz
Ovo de Schistosoma mansoni visto em exame de fezes pelo Kato-Katz
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Não existe método capaz de diagnosticar ao mesmo tempo todas as formas parasitárias
Mais gerais: sedimentação espontânea e centrifugação
Rotina do EPF:
Diagnóstico de vários parasitos intestinais
Fácil execução e baixo custo
Importante	interação	entre	médico	e	laboratório:	execução	do método mais adequado a cada situação
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Escolha do Método
PARASITOS DO SANGUE E TECIDOS
72
Garantia de qualidade no EPF:
Algumas espécies são evidenciadas apenas por técnicas especiais
Apenas	um	exame	isolado	com	resultado	negativo	não	deve	ser conclusivo
Produção de cistos, ovos e larvas não é uniforme ao longo do dia
71
Escolha do Método
Principais parasitos
Trypanosoma cruzi
Fora das
hemácias
Plasmodium
sp.
P. vivax
P. falciparum
P. Malariae
Hemácias
Leishmania sp.
Fora das
hemácias
Filárias
Wuchereria
bancrofti
Mansonella
ozzardi
Fora das
hemácias
73
Estirados e Gota espessa
74
Trypanosoma
sp.	e
Sangue total colhido com anticoagulante
Sedimento	de	métodos	de	concentração: microfilárias
Apenas uma amostra de sangue não é suficiente para o diagnóstico:
Colher entre 6 e 12 horas (3 a 5 dias) para que não haja suspeita de infecção
Esfregaços sanguíneos
Estudo das hemácias, contagem de leucócitos
Diagnóstico e estudo diferencial de Plasmodium sp. (alta densidade)
Esfregaço Estirado
75
Esfregaço Estirado
Lâmina corada de boa qualidade
76
Esfregaço Estirado
77
Quantidades relativamente grandes de sangue em pequena área
Coleta:
Esfregaço Espesso (Gota Espessa)
78
Permite detectar a infecção mesmo com parasitemias leves
Esfregaço Espesso (Gota Espessa)
79
Indicada para inquéritos epidemiológicos
Combinação de esfregaços
80
Coloração de esfregaços sanguíneos
Giemsa
Diferenciação	nuclear	e/ou	citoplasmática	(plaquetas, eritrócitos, leucócitos e parasitos)
Esfregaços estirados (fixados com álcool metílico)
Gota espessa
Coloração de Leishman
Esfregaços estirados
Eosina-azul-de-metileno
81
Concentração do sangue
Centrifugaçãodosangue(CremeLeucocitário)
Leishmaniadonovani,Trypanosomasp.emicrofilárias
SanguecolhidocomEDTA,heparinae/oucitratodesódio(anticoagulantes)
Esfregaçoestirado–podesercorado
82
Centrifugação do Micro-Hematócrito
Utilização de tubos capilares
Diagnóstico rápido da malária e Doença de Chagas (baixa parasitemia)
Concentração do sangue
83
IMUNODIAGNÓSTICO
84
Toxoplasmose
Doença de Chagas (fase crônica)
Abscesso amebiano
Leishmaniose visceral
Esquistossomose (fase crônica)
Cisticercose
Hidatidose
Larva migrans visceral (toxocaríase)
Considerações Gerais
Grande importância da detecção de anticorpos
85
Coleta da amostra - depende do sítio de infecção do parasito:
Soro, líquor, urina, fezes, tecidos
Importância de verificação dos antígenos:
Imunodiagnóstico
Interpretação da imunopatologia
Quantificação de diferentes respostas imunológicas do hospedeiro
Avaliação do potencial de vacinas
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Considerações Gerais
Técnicas que não usam marcadores:
Detectam / quantificam as consequências da ligação Ag - Ac
Reações de Precipitação
Reações de Aglutinação
Reação de Fixação do Complemento
Técnicas que usam marcadores:
Detectam / quantificam diretamente a ligação Ag - Ac
ELISA (Enzyme-liked Immunosorbent Assay)
Imunofluorescência (Direta e Indireta)
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Considerações Gerais
Quantificação de precipitados formados pela reação Ag-Ac
Proporções adequadas de Ag-Ac
Proporção ideal: zona de Equivalência
Atualmente:
Emprego de espectrofotômetros
Reações de Precipitação
Antígenos
(solúveis)
88
Anticorpos
Zona de
equivalência
: ppt visível
Exemplos:
Imunodifusão radial dupla
Imunodifusão radial simples
Imunoeletroforese
Imunofixação
Reações de Precipitação
89
Componente	conhecido	(Ag	ou	Ac):	ligado	à	superfície	de células/partículas – facilita a visualização
Exemplos:
Reação de Aglutinação Direta
Reação de Aglutinação Indireta ou Passiva
Reação de Hemaglutinação
90
Reações de Aglutinação
na	superfície
91
dos	eritrócitos	–
Detecção de anticorpos específicos
Reconhecimento	de	anticorpos
aglutinação
Direta: determinantes antigênicos fazem parte da própria hemácia
Indireta: hemácias são suporte para antígenos que são adsorvidos à superfície
Reações de Hemaglutinação
Reações de Hemaglutinação
Hemaglutinação Direta
9
Hemaglutinação Indireta
2
Doença de Chagas: Hemaglutinação Indireta
Reações de Hemaglutinação
93
Detectar Ac fixadores do complemento
Ac só fixam complemento após a interação com Ag específico
Etapas:
1ª: Soro + extrato antigênico solúvel e complemento
2ª: Sistema hemolítico para detectar se complemento está livre ou não
94
Reação de Fixação do Complemento
Reação de Fixação do Complemento
95
Enzyme-liked Immunosorbent Assay
Elevada sensibilidade, especificidade, rapidez e baixo custo
Marcador é uma enzima que na presença de um substrato altera sua cor: diferenciação entre positivo e negativo
96
ELISA
Marcação do antígeno ou do anticorpo com fluorocromos
Direta:	usa	anticorpo	antígeno-específico	marcado	com	substância fluorescente
Indireta:	detecção	de	anticorpos	dirigidos	contra	alvo	antigênico específico fixado em uma lâmina
Referência	na	sorologia	de	muitas	parasitoses:	toxoplasmose,	Doença	de Chagas e malária
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Imunofluorescência
Direta
Imunofluorescência
Formas amastigotas de Leishmania em esfregaço de aspirado de linfonodo poplíteo de cão naturalmente acometido por leishmaniose visceral, marcadas pelo anticorpo policlonal anti-Leishmania conjugado comfluoresceína (Laurenti, 2009)
99
Imunofluorescência
Indireta
Oocistos de Cryptosporidium sp. oocistos (setas amarelas)
Cistos de Giardia spp. (setas vermelhas)
Kit para
imunofluorescência
100
BIOLOGIA MOLECULAR
101
Adoção de tecnologias de análise de ácidos nucléicos
Vantagens: alta sensibilidade e especificidade
PCR = Polymerase Chain Reaction
Amplificação exponencial in vitro de pequenas quantidades de DNA
Qualquer sequência alvo de DNA pode ser amplificada
A localização é feita pelos primers
Considerações Gerais
102
Extração de DNA e RNA
Sangue, pele, músculos
Kits comerciais ou fenol / clorofórmio (tóxico)
Reação em Cadeia da Polimerase
103
Preparo da PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
104
PCR consiste de três etapas principais:
Reação em Cadeia da Polimerase
105
Visualização dos resultados:
Reação em Cadeia da Polimerase
Resultado da PCR após ser realizada uma eletroforese
em gel de agarose ou de poliacrilamida.
106
IDENTIFICAÇÃO HISTOLÓGICA
107
Protocolo Geral
Fixação
Processamento
Corte
Coloração (Histoquímica e Imuno- histoquímica)
Montagem
108
Lâminas histologia
Granuloma hepático devido a Schistosoma mansoni
Amastigotas de T. cruzi em tecido cardíaco
109