Biomedicina

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31Biomedicina na prática: 
da teoria à bancada SUMÁRIO
4. Adicional 0,2 mL de Clorofórmio PA;
5. Agitar por 15 segundos no vórtex;
6. Deixar 3 minutos em temperatura ambiente;
7. Centrifugar 12.000xg por 15 min – 4ºC;
8. Pipetar a fase aquosa para um tubo limpo e identificado;
9. Adicionar 0,5 mL de Propanol (álcool isopropílico); 
Dica: para um melhor rendimento do RNA isolado, sugere-se interromper o procedimento, 
deixando a amostra a -20°C overnight (12 a 24h). Caso não seja necessário, pode-se proceder 
para a etapa 10.
10. Centrifugar 12.000 g por15 min – 4ºC;
11. Desprezar sobrenadante (o RNA precipita formando um pellet como um gel);
12. Adicionar 1 mL de etanol 75% gelado; 
13. Centrifugar 8.000 xg por 10 min – 4ºC;
14. Desprezar sobrenadante;
15. Secar o tubo e o pellet . Deixar o tubo escorrendo e após usar o cotonete para secar 
o tubo, sem tocar no pellet; 
16. Adicionar H2O DEPC (~ 20- 40 µL depende do tamanho do pellet);
17. Deixar em banho-maria por 10 min – 60ºC;
18. Deixar 1 minuto no gelo;
19. Fazer spin 4.000 rpm (deixar sempre no gelo a partir de agora);
20. Estocar a -80°C ou realizar a quantificação antes de estocar. 
Responda as perguntas a seguir:
a) Pra que extrair RNA de uma célula?
b) Quais as vantagens/desvantagens de trabalhar com RNA, se comparado ao DNA?
c) Quais as principais diferenças entre os princípios da técnica de extração de DNA e a 
do RNA?
d) Qual a função do reagente fenol? Em qual fase durante o processo de extração fica o 
RNA e em qual se encontra o DNA e proteínas?
e) O RNA depois de isolado deve ser acondicionado no freezer a -70 graus Celsius. Por 
quê? 
3. PRÁTICA: Quantificação de ácidos nucleicos
Antes de utilizar o ácido nucleico recomenda-se quantificar para verificação de Pureza e 
Quantidade. O Protocolo de quantificação: depende do aparelho utilizado, pode ser feito por 
análise do comprimento de onda ou detecção de fluorescência. 
32Biomedicina na prática: 
da teoria à bancada SUMÁRIO
Quantificação por comprimento de onda 
As amostras de DNA ou RNA obtidas no laboratório devem ser avaliadas quanto à sua 
concentração e à sua pureza por meio da densidade óptica (DO) em espectrofotômetro. O 
DNA e o RNA absorvem luz no comprimento de onda de 260 nm e as proteínas, de 280 nm. 
Materiais:
- Pipetadores de todos os volumes;
- Caixas de ponteiras azuis, amarelas e cristal;
- Microtubos eppendorf de 2,0 mL;
- Estante para microtubos;
- Água ultrapura tratada com DEPC (dietilpirocarbonato);
- Frasco para descarte;
- Isopor com gelo; 
- Agitador de tubos do tipo vórtex
- EPIs (Luvas de látex, máscara, avental)
- Cubeta de quartzo
Procedimentos: 
1. As amostras de DNA ou RNA devem ser preparadas (diluídas) com água ultrapura, 
onde, por exemplo: 10 µL de DNA em 490 µL de água (diluição 1:50) ou 5 µL de DNA 
em 495 µL de água (diluição 1:100) ou de acordo com o volume necessário para leitura 
no equipamento.
2. Neste caso, utilizando como exemplo a diluição 1: 500, deve-se pipetar em um tubo 
eppendorf 499 µL de água e, posteriormente, 1 µL de DNA ou RNA. 
3. Agitar no vórtex por 15 segundos e proceder a quantificação. Recomenda-se fazer 
sempre em duplicata ou triplicata. 
4. Zerar o aparelho com o branco (somente água ultrapura tratada com DEPC).
5. Quantificar as amostras no comprimento de onda de 260 nm e fazer o cálculo da 
concentração, conforme a fórmula abaixo:
[ ] RNA em µg/µL = média 260 X 40 X 500 = média 260 X 20
            1000
Onde:
260= Absorbância
40= Densidade óptica do RNA, se for DNA usar 50
500= fator da diluição (neste caso 1: 500)
1000= conversão de mg para µg
Dica: Para a concentração de DNA, basta multiplicar o valor da absorbância por 25 (se 
for a diluição 1:500). Para a concentração de RNA basta multiplicar o valor da absorbância por 
20 (se for diluição 1:500).