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Biomedicina descomplicada @biomedicina_descomplicada biomedicinadescomplicada@gmail.com 1.0 PREFÁCIO Caro leitor, O desenvolvimento dessa obra reflete uma natureza explicativa de um conjunto de mecanismos e mistérios associados a Biologia Molecular. Esse universo bioquímico a nível molecular e supramolecular apresentado a você caracteriza um resumo e aprofundamento nos conteúdos mais amplos e, após recém descobertos nas últimas décadas, que nos faz vislumbra essa natureza celular. Construir essa obra, com o objetivo de transmitir os conceitos mais abrangentes da Biologia Molecular, apresenta uma composição clara, com linguagem simples e objetiva, fazendo com que o leitor, estudantes e profissionais, fazem uso desse exemplar como apoio as aulas e para capacitarem e atualizarem no assunto. Nesta apostila de Introdução à Biologia Molecular apresenta um material didático original, com referências e indicações que contém apresentações semelhantes a estes para complementar a construção de seu conhecimento. Nesse contexto, será abordado assuntos referidos na graduação e temas avançados da ciência que estuda compreender o fluxo da informação gênica e seus mecanismos e, do mesmo modo, será discorrido sobre temas paralelos da Biologia Molecular. Ao longo da leitura, o leitor, a quem se destina esta obra, contemplará uma visão panorâmica, simples e complementar do assunto, visitando autores indicados, referências, livros e sites confiáveis de leitura para melhor construção do conhecimento. Tudo isso servirá como base para seu entendimento e estudo a respeito da Biologia Molecular. 2.0 INTRODUÇÃO Na superfície terrestre há um número, com incontáveis zeros, de organismos vivos habitantes, que vivem de modo organizada. Esses organismos constituem de uma diversidade extraordinariamente notável, seres marinhos, seres voadores, seres terrestres, alguns que são considerados seres não-vivos, como vírus; seres que vivem em ambientes hostis com pouco oxigênio ou em ambientes de extrema temperatura, como bactérias termófilas e muitos outros que conceituam a palavra diversidade. Cada organismo contém de estruturas que lhe conferem características vantajosas ou desvantajosas, funcionalidade e, principalmente, sobrevivência. Imagine as características extrínseca de um morcego, o que poderia apresentar de diferente comparado a um protozoário, ou uma alga ou bactéria, até mesmo um vírus? No entanto, não bastava de tecnologia para compreender que todas as características que diferenciem esses organismos fundiam a um único propósito, a vida. Entender a vida e defini-la tornou-se difícil; até aonde ou que é vida? Entender a vida tornou-se uma ferramenta de estudo e pesquisa. Foi necessário a passagem de várias décadas para se chegar a um entendimento comum a respeito da vida. Hoje compreende-se que os seres vivos são compostos por células, a menos subunidade da vida. Todos os organismos são formados por células, sendo esta formando um ser complexo com numerosas células, formando um organismo pluricelular como homem, algas, mamíferos, répteis, insetos; ou formando um único organismo, denominado organismo unicelular, como bactérias, arqueobactérias e vírus. A célula é a unidade fundamental da vida e os estudos do comportamento celular, estrutura e suas subunidades, desenvolveu o surgimento da Biologia Celular. Esse estudo remete que, apesar a ampla diversidade, os organismos vivos carregam consigo uma característica universal, comum em todas as vidas na Terra. O ácido desoxirribunucleico (ADN ou DNA) constitui a característica comum e mais importante para a vida. O “cérebro” da célula, é encontrada em todos os organismos vivos e em vírus. O estudo da Biologia Molecular surgiu a partir do momento histórico em que os cientistas compreenderam que a informação genética é muito mais complexa, misteriosa e intrigante; quando questionou-se as características, a especificação dos organismos, a informação genética, o núcleo, as moléculas encontradas no interior do núcleo, os genes, as moléculas nucleares; entender como ocorre o fluxo da informação gênica levou o homem compreender melhor o sentido da vida, como melhor representado na tirinha Mafalda do desenhista argentino Quino, 5’ (linhas) 3’ (linhas), veremos nos capítulos posteriores. Com o surgimento da Biologia Molecular, várias dúvidas e questionamentos foram levantados na ciência. Alguma vez você se perguntou: Se todas as células do corpo humano foram provenientes de uma só célula, todas as células apresentam o mesmo genoma? Se todas as células do corpo humano compõem do mesmo genoma, como explica a especificidade e funcionalidade celular? Todas as células leem o genoma por completo ou apenas fragmentos? Por que o homem tem cromossomo X e não apresenta características femininas? Por que os filhos apresentam características semelhantes aos pais? O que acontece após a fusão do espermatozóide no oovócito, dentro do ovo feminino haverá dois núcleos? Existem vários questionamentos que são levantados quando se estuda o genoma de um organismo. A Biologia Molecular questiona várias vertentes dessa ciência, contudo, muita informação ainda em pesquisa, muitas questões sem respostas e a ideia que ainda há muito a que se descobrir. Eu costumo afirmar que a Biologia Molecular é a bioquímica da Genética, veremos como ocorre o fluxo da informação genética, do mesmo modo, enzimas, proteínas, RNAs e afins que atuam para manter a integridade do DNA e transmissão celular. Um dos objetivos centrais do estudo é entender a função dos genes, a natureza do material genético, replicação do RNA, transcrição e tradução do RNA, expressão gênica, mutações, etc. Os avanços da Biologia Molecular permitiram a criação de vários instrumentos que permitem melhor os estudos do DNA e de outros mecanismos moleculares. Testes a nível molecular permitiu uma investigação aprofundada a nível molecular. Permitindo que cientistas obtivessem maiores informações a respeito do fluxo gênico, o entendimento da atuação de proteínas e enzimas além de compreender como o genoma comanda as características básicas e especificas de cada tipo celular e como a evolução agiu sobre todo este mecanismo. Adianto que ao longo desta apostila abordaremos assuntos relacionados a estrutura dos ácidos nucleicos estrutura dos genes, código genético, dogma central da biologia molecular, noções de controle de expressão gênica e muito mais, a você, caro leitor, desejo muito entendimento e que seu estudo torne prazeroso com nossas explicação e demais. 2.0 ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS Os ácidos nucleicos são macromoléculas formadas por subunidades denominada nucleotídeo, as sequencias de nucleotídeos foram uma sequencia que constitui a macromolécula mais importante para a célula. Os ácidos nucleicos tem essa denominação por possuírem o pH ácido, Os ácidos nucleicos são fundamentais para a manutenção da vida, pois a partir dessas moléculas se armazena a informação genética do organismo e contém código genético para a síntese de proteínas que executarão funções no interior ou fora da célula. Existem dois tipos de ácido nucleico: ácido desoxirribonucleico, conhecido pela sigla DNA e em algumas literaturas brasileiras de ADN e ácido ribonucleico, conhecido pela sigla RNA ou ARN em português. Os monômeros (ou também chamados de unidades estruturais ou nucleotídeos) que constituem o DNA e o RNA são compostos por uma pentose (ou açúcar com cinco carbonos) denominado de desoxirribose para o DNA e ribose para o RNA (essa é uma das principais diferenças entre RNA e DNA), uma base nitrogenada e um grupamento fosfato, olhar a figura 1. Os nucleotídeos são ligados por ligações fosfodiésteres, na qual a hidroxila do carbono 5’ da pentose se ligue a hidroxila do carbono3’ do nucleotídeo seguinte, formando uma sequência de nucleotídeos ligados consistindo em um fragmento de ácido nucleico. Os nucleotídeos são formados por bases nitrogenadas, que são estruturas cíclicas e as bases nitrogenadas são divididas em dois grupos: purinas e pirimidinas. Existem 5 tipos de bases nitrogenadas, sendo elas: guanina, timina, adenina, citosina e uracila. O DNA é composto apenas pelas 4 primeiras bases citadas, sendo a última (uracila) especifica apenas para a molécula de RNA, na qual no processo de transcrição, a timina é substituída por uracila. Como mencionado acima, os ácidos nucleicos constituem o DNA e RNA. O DNA, em comparação ao RNA é uma estrutura mais complexa que Figura 1: a) observa-se os dois grupos que diferem as bases nitrogenadas: Pirimidinas (Citosina, Timina e Uracila) e as bases purinas: (Adenina e Guanina). b) Observe a estrutura de um nucleotídeo composto por uma base nitrogenada, pentose (açúcar) e um grupamento fosfato. Analise também que a pentose é composta por 5 carbonos em sua estrutura, o que lhe confere a nomenclatura. c) Observe que existem dois tipos de açúcar, conferindo uma das várias diferenças entre o RNA e DNA. Fonte: Site Klan Academy a) b) c) armazena o material genético e o maior responsável pela transcrição do RNA. O DNA é formado por duas fitas antiparalelas, ou seja, o sentido 5’ – 3’ para uma fita, se liga ao sentido 3’ – 5’ da fita paralela. Ambas as fitas de DNA são ligadas por pontes de hidrogênio, uma ligação mais simples em comparação a ligação fosfodiester, que é uma ligação mais forte. As pontes de hidrogênio são ligadas pelas bases nitrogenadas, isto é, digamos que as bases nitrogenadas se encontram no interior da dupla fita de DNA, enquanto o grupamento fosfato se encontra nas laterais das fitas. Como digo acima, as bases nitrogenadas são divididas em dois grupos: purinas e pirimidinas (Volte a figura 1). A adenina e guanina são bases púricas ou purinas, enquanto a citosina, timina e uracila são bases pirimidinas. Para formar o modelo de dupla hélice e ligação das bases nas fitas opostas, uma base purina sempre deve se ligar a uma base pirimidina, em um esquema molecular bem definido: Adenina sempre se ligará a uma base Timina (em caso do RNA, uma base Uracila) e uma Citosina sempre irá e parear com uma Guanina. A regra de Chargaff aponta exatamente a questão: para que ocorra a especificidade genética é necessário um arranjo preciso da sequência de nucleotídeos, pois, como foi dito, existem 4 tipos de nucleotídeos. A regra de Chargaff descreve que para 1 adenina, sempre haverá uma Timina (ou Uracila) e para cada Citosina, sempre haverá uma Guanina. Isso faz com que compreendamos que em um genoma de uma espécie, a mesma quantidade de Citosina, será sempre a mesma quantidade de Guanina. Observe na imagem abaixo (figura 2), note que as pontes de hidrogênio estão ligadas nas bases nitrogenadas, contudo existe duas ligações de hidrogênio entre Timina e Adenina e três ligações de hidrogênio entre as bases Citosina e Guanina. Logo, nota-se que a ligação entre C – G são mais fortes, conferindo maior estabilidade, enquanto a ligação A – T são mais fracas, conferindo-lhe menos estabilidade. No entanto, conclui-se que regiões com mais Citosinas e Guaninas são regiões genômicos mais estáveis, principalmente termodinamicamente. Figura 2: Observa-se os nucleotídeos ligados por pontes de hidrogênio. A ponte de hidrogênio se encontra ligada entre as bases nitrogenadas das duas fitas. Nas laterais da dupla fita de DNA encontram-se os grupamentos fosfatos (em outras literaturas, é chamada também de radical fosfato) que lhe conferem uma característica ácida. Fonte: Livro Fundamentos da Biologia Moderna", por Amabis e Martho A dupla fita de DNA é observada em hélice ou espiral assim descritas por Watson e Crick em 1953, e as fitas se combinam, na qual uma sequencia AATGCCGAT da fita 5’ – 3’ se combina com a outra fita 3’ – 5’ com a sequencia TTACGGCTA. Deste modo, entende-se que no genoma humano, por exemplo, a mesma quantidade de Timina apresentará a mesma quantidade de Adenina, enquanto encontra-se a mesma quantidade de Citosina e Guanina. Sob condições especificas, como aumento da temperatura, por mais estável que esteja as ligações de hidrogênio, podem sofrer desnaturação e separar as fitas de DNA. Caso a temperatura venha se estabilizar e baixar, as fitas de DNA tendem a se encontrar, rearranjar e formar a ligação, no processo chamado de renaturação. As bases nitrogenadas possuem uma natureza apolar, lhes conferindo uma característica hidrofóbica, ou seja, não apresenta interação com a água. Desse modo, ao entrar em contato com uma solução aquosa, as bases nitrogenadas voltam-se para o interior da molécula de DNA, na qual se encontra pobre em água. O grupamento fosfato confere ao DNA uma característica de carga negativa e ácida, nas quais em testes moleculares laboratoriais, quando aplicada uma corrente elétrica, as moléculas de DNA e RNA tendem a movimentar-se contra o polo negativo em direção ao polo positivo em um processo denominado eletroforese que também é usado par separar outra macromoléculas, como proteínas. As moléculas de RNA são moléculas mais simples em comparação a molécula de DNA. De acordo com estudiosos, a molécula de RNA tem características primitivas que conferem aos estudiosos a ideia de que o DNA é uma molécula resultado da evolução da molécula de RNA. O RNA é uma molécula de fita única, que pode ser encontrada enrolada entre si através do emparelhamento de suas bases que complementam, observe a figura 3: Figura 3: Observa-se (do lado esquerdo) uma das principais diferenças entre as moléculas de DNA e RNA. A molécula de RNA é vista como fita única ao lado do DNA. A direita observa-se a molécula de RNA sofrendo emparelhamento entre duas bases, isso faz com que a molécula de RNA se encurve formando enrolamentos, como visto na imagem. Fonte: Site https://www.significados.com.br/rna/ https://www.significados.com.br/rna/ Na célula humana existem vários tipos de RNAs, o RNA mensageiro, RNA transportador, RNA ribossômico e micro RNAs. Todos os tipos de RNAs encontrados nas células humano são fitas simples, portanto, alguns vírus apresentam em sua estrutura a molécula RNA de fita dupla ou fita simples, assim como DNA de fita dupla como fonte de informação genética. Cada tipo de RNA disposto no interior da célula humana apresenta sua funcionalidade, isto é, veremos que o RNA sem sempre é traduzido e formado em proteína, alguns apresentam outras funções e isso será discutido mais a frente. Tipos de RNAs e suas funções: RNA mensageiro (RNAm): Essa molécula é criada a partir da transcrição do DNA. A enzima RNA Polimerase reconhece a região promotora, região esta encontra no início do gene a ser transcrito. Ao reconhecer essa região, a RNA Polimerase inicia sua leitura e transcrição na região codificante, região do gene que contém as informações genéticas para formar um RNAm e por conseguinte, uma proteína após o processo de tradução. A molécula de RNA contém a informação necessária para ser traduzida pelos ribossomos e criar uma proteína. RNA transportador (RNAt): A molécula de RNAt é transcrita pela enzima RNA Polimerase III e tem a função de transportar os aminoácidos para síntese de proteínas, ou seja, o RNAt é uma molécula que participa no processo de tradução. No tópico Dogma Central da Biologia Molecular, ressaltaremos mais sobre essa molécula. RNA ribossômico (RNAr): O RNA ribossômico tem uma função peculiar, e de seus genes de transcrição, 3 estão localizados no nucléolo e apenas 1 está localizado no genoma que após a transcriçãoé direcionado ao nucléolo. O RNA ribossômico somando as proteínas ribossômicas, formam os ribossomos, organelas responsáveis pela transcrição. Micro RNAs (miRNAs): Essa molécula de RNA apresenta uma função peculiar: atua no processo de silenciamento após a transcrição do RNAm, inibindo a ocorrência da tradução do RNAm e síntese de proteínas. Essas moléculas são transcritas no DNA, porém não apresentam função codificante. São RNAs pequenos, podem ter vários alvos no interior do núcleo e apresentam aproximadamente 22 nucleotídeos. De acordo com Júlio et al (2006): Os miRNAs são hoje reconhecidas como reguladores fundamentais da expressão gênica em plantas e animais. Até o momento, identificaram- se 462 genes de miRNA no genoma humano e estima-se que esse número supere 1000 miRNAs distintos. Análise bioinformáticas indicam que um único miRNA atue em diversos RNAs mensageiros, influenciando múltiplas vias de sinalização [...] apresentando enorme potencial regulatório. Leitura complementar: Artigo de referência e consulta: Júlio, C.M., et al; MicroRNAs: nova classe de reguladores gênicos envolvidos na função endócrina e câncer, Arquivos Brasileiros de Endrocrinologia e Metabiologia, Vol. 50, nº 6, São Paulo, dez 2006. Site: Scielo.br A molécula de RNA apresenta em sua estrutura um açúcar denominado ribose, um grupo fosfato e uma base nitrogenada, podendo ser Uracila, Adenina, Citosina ou Guanina. Os nucleotídeos de RNA são chamados de ribonucleotídeos em algumas literaturas. Na figura 4, abaixo, explica a diferença das pentoses encontradas na molécula de RNA e no DNA. A figura 5 apresenta as principais características que diferem a molécula de RNA da molécula de RNA. Ambos ácidos nucleicos são importantes para a transmissão e manutenção da informação genética e controle celular. É importante salientar que nem todos os genes serão transcritos e RNAm e em seguida traduzidos em proteínas, as moléculas de RNAs podem obter várias funções importantes já mencionadas e algumas desconhecidas. Do mesmo modo, nem todos os genes do DNA estão ativos e disponíveis para serem reconhecidos e transcritos, todo esse assunto será abordado nos módulos seguintes e descobriremos como o genoma humano é complexo e misterioso. Segue abaixo o quadro com as principais diferenças entre DNA e RNA: Figura 4: No carbono 2 da molécula de RNA encontra-se um grupo hidroxila, assim como na molécula de DNA a hidroxila é substituída por hidrogênio. Figura 5: Quadro com as principais diferenças entre as moléculas de RNA e DNA. Fonte: https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/2311662/mod_resource/content/0/pdf_Apresent_14_Gr14.pdf https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/2311662/mod_resource/content/0/pdf_Apresent_14_Gr14.pdf 3.0 INFORMAÇÃO GENÉTICA E ESTRUTURA DOS GENES O que são genes? Essa definição nem sempre existiu uma resposta. A ideia de gene iniciou-se com as pesquisas e ideias de Gregor Mendel, quando utilizou espécies específicas de ervilhas e flores para “testar” a transmissão dos caracteres genéticos por meio do cruzamento. a percepção a respeito de gene estava longe de ser compreendida totalmente, as experiências que comprovaram a existência do gene eram indiretas, pois desconhecia-se a natureza do DNA. Nesta época, gene era considerado uma unidade transmissora de um caractere. Em meados da década de 40, os pesquisadores George Beadle e Edward Tatum desenvolveram uma série de experimentos que os levaram a ideia de um gene=uma proteína (enzima como mencionaram na época). Ou seja, o gene seria responsável por produzir uma proteína. Conquanto, novas pesquisas e descobertas confirmam que o gene pode conter informações genéticas para produzir uma proteína mas que essa relação não é única, isto é, a realidade de um gene é muito mais complexa que esse modelo. Um gene pode, além de conter informações para síntese de uma proteína, existem genes responsáveis pela síntese de proteínas sem função enzimática, assim como contém genes responsáveis por transcrever RNA ribossomal ou RNA com funções de regulação de expressão dos genes que não serão traduzidos em proteínas. Isso denota a ideia de que o genoma eucarionte apresenta um modelo de complexa compreensão. Seguindo o pensamento acima, o gene é um segmento ou um fragmento de DNA que contém uma informação, sendo elas, mencionadas acima. Cada gene é composto por uma sequência de nucleotídeos, de numeração variada por cada tipo de gene, que contém instruções para criar os vários tipos de RNAs existentes e mencionados (volte ao capítulo anterior). Milhares de genes juntos formam o DNA, a quantidade de genes é variável por espécies, podendo uma célula procarionte contém mais de 3000 genes. Uma célula humana, em sua alta complexidade, contém aproximadamente 3,2 x 10 sendo essa quantidade o suficiente para codificar aproximadamente 3 milhões de proteínas. A maior porcentagem dos genes do genoma humano estão contidas nos cromossomos, forma mais condensada do DNA. O cromossomo é constituído de DNA ligado a proteínas histonas. Cada célula humana contém no interior do nucleoplasma um total de 23 pares de cromossomos e os mais variados genes estão “espalhados” em todos os cromossomos. Observe a figura 6, os genes são encontrados nos cromossomos em seu maior nível de condensação, na qual a célula esta se preparando para uma divisão celular e duplicação do material genético: Ao falar de genes, não pode deixar de mencionar que existem duas cópias do mesmo gene em você! Observem que os gametas feminino e masculino postam consigo apenas 23 cromossomos únicos resultado do processo conhecido como Meiose (vou deixar uma referência desse estudo no final do capítulo). Nesse processo o número de cromossomo é alterado de 23 pares de cromossomos ou 46 cromossomos para apenas 23 cromossomos individuais. Após a fecundação dos gametas, o número de cromossomo passará para 46 cromossomos ou 23 pares de cromossomos (quantidade ideal para o desenvolvimento de uma vida). Todas as células somáticas do seu corpo portam 23 pares de cromossomos, apenas as células germinativas que comportam 23 cromossomos únicos. Dois cromossomos de um par são muito semelhantes entre si, tanto na forma quanto no tamanho. Ambos os cromossomos do mesmo par carregam contigo os mesmos genes encontrados nas mesmas regiões, ou seja, o mesmo gene que produz a insulina encontrado no cromossomo materno é encontrado do mesmo modo no cromossomo paterno, com a exceção de variações genéticas que ocorrem nos genes. No entendo, existem diversas variações do mesmo gene, fazendo com que sejamos pessoas diferentes com características diferentes. Por exemplo, nos dois cromossomos 9 do genoma humano, encontram-se os genes responsáveis pelo tipo sanguíneo A, B, AB ou O. Se o cromossomo materno apresentar tipo sanguíneo A e o cromossomo paterno apresentar o tipo sanguíneo B, prevalecerá o gene considerado dominante. Por termos duas cópias do mesmo gene e também uma infinita variação genômica desses genes, o que prevalece (mesmo em “dose” pequena) é o gene dominante. Os genes são classificados quanto a capacidade de manifestação de uma característica, isto é, quando os dois cromossomos pares apresentam variações do mesmo gene, prevalece o gene mais dominante. Os genes dominantes são chamados assim por definirem a características fenotípica ou genotípica mesmo na presença de outra variação do gene. Isso deve porque os genes dominantes não precisam de um par alelo, são transcritos e manifestados mesmo sem a mesma variação do gene do cromossomo pareado. Já o gene recessivo apresenta essa nomenclatura pois para serem expressos são necessários que os dois genes dos dois cromossomos pares sem Figura 6: Observa-se o cromossomoduplicado e a extensão do DNA até chegar nos genes. Repare que no interior dos genes há a existências de 2 subdivisões do gene: introns e exons (conteúdo que veremos mais a frente). Fonte: Imagem retirada do site infoescola. iguais. Por exemplo: o gene para cor dos olhos castanhos é dominante, isto é, se apenas a mãe expressar esse gene já é necessário para o filho ter olhos castanhos. O gene da cor de olhos azuis é recessivo, sendo necessário que ambos os genes de ambos os cromossomos expressem o mesmo tipo de gene para cor azul, observe a figura 7. Essa classificação também é empregada para problemas de saúdes proveniente de meios genéticos e para mutações do gene. A célula utiliza seus genes de forma seletiva, quando necessário para executar suas funções internas. Isso é possível graças a sequências específicas do DNA capazes de controlar quando e com qual intensidade será expressa o gene para formar uma enzima, por exemplo. Todas as células do corpo humano possuem os mesmos genes, porém as células expressam os genes que lhe garantem funcionalidade, desativando outros genes considerados “inúteis” ou “desnecessários” para a célula. Esse assunto será abordado no tópico Controle de Expressão Gênica, e lá você irá compreender porque todas as células não podem expressar todos os genes. Resumindo, os genes são as unidades funcionais do DNA que possuem de uma informação para transcrição de uma proteína ou um RNA funcional que não passará por tradução. Os genes carregam consigo informações hereditárias que podem ou não ser expressos pela célula. E os mais variados tipos do mesmo gene podem ser dominantes ou recessivos variando de acordo com a informação genética herdada. 4.0 REPLICAÇÃO DO DNA Figura 7: Observa-se os cromossomos homólogos. Ambos os cromossomos apresentam o mesmo tipo de gene na mesma região. Contudo há variações nos genes que podem interferir nas características. Para que um gene recessivo seja expresso, com certeza é necessário que ambos os genes expressem a mesma condição. Fonte: Imagem retirada do site: todoestudo.com Leitura complementar: Cromossomos: Site: https://pt.khanacademy.org/science/biology/cellular-molecular-biology/intro- to-cell-division/a/dna-and-chromosomes-article Genes dominantes e recessivos: https://pt.khanacademy.org/science/biology/classical- genetics/mendelian--genetics/a/the-law-of-segregation https://pt.khanacademy.org/science/biology/cellular-molecular-biology/intro-to-cell-division/a/dna-and-chromosomes-article https://pt.khanacademy.org/science/biology/cellular-molecular-biology/intro-to-cell-division/a/dna-and-chromosomes-article https://pt.khanacademy.org/science/biology/classical-genetics/mendelian--genetics/a/the-law-of-segregation https://pt.khanacademy.org/science/biology/classical-genetics/mendelian--genetics/a/the-law-of-segregation Uma característica fundamental para a transmissão da informação genética é a duplicação do material genético, isto é, o Ácido Desoxirribonucleico ou comumentemente chamado, o DNA. O processo de duplicação do DNA envolve vários mecanismos que atuam em um conjunto perfeito para construir uma nova fita de ácido nucleico. A replicação ou duplicação do DNA é semiconservativa, ou seja, cada fita dupla de DNA é usada como molde para construir uma fita complementar o que significa que ao final da replicação haverá duas fitas idêntica. Em outras palavras, a molécula mãe de DNA se dividirá, ambas as fitas serão complementadas e ao final da replicação, haverá duas fitas “filhas” de DNA. Observe a figura 8: Devido ao DNA ser base da informação genética, o processo de replicação deve ter executada de modo que qualquer erro de trocas ou faltas de bases no DNA seja rapidamente consertada e organizada. Erros na sequência do DNA, denominada de mutação gênica, pode levar o organismo a correr risco de saúdes, como câncer. O processo de replicação envolve a participação de diversas enzimas, dentre elas a mais importante: Polimerase. A DNA Polimerase é a principal proteína enzimática a controlar o processo de síntese de DNA. Essa enzima Figura 8: Veja que a fita “mãe” é a primeira dupla hélice de DNA de coloração vermelha. Nota que após a duplicação, tem-se duas fitas “filhas” de DNA. Para ficar mais didático, observe que as fitas filhas são idênticas a fita mãe. Para finalizar, vemos que de azul estão as sequências recentemente sintetizadas e de vermelho as fitas pertencentes ao DNA mãe. Fonte: Imagem retiradas do site no site https://pt.slideshare.net/jorgehenriqueangelim/duplicao-do-dna- e-sntese-proteica https://pt.slideshare.net/jorgehenriqueangelim/duplicao-do-dna-e-sntese-proteica https://pt.slideshare.net/jorgehenriqueangelim/duplicao-do-dna-e-sntese-proteica atua adicionando um nucleotídeo por vez, complementando a fita molde, sentindo 3’ do DNA. 4.1 Início da Replicação do DNA A duplicação do DNA inicia-se em um local específico do próprio DNA. Ao reconhecer esse sítio de ligação, algumas proteínas específicas, denominadas Helicase rompem das ligações de hidrogênio e separam as fitas de DNA, formando uma estrutura com formato de Y. Em outras palavras, a função da Helicase é quebrar as pontes de hidrogênios que ligam os nucleotídeos das fitas opostas. Após a separação da fita de DNA, são recrutadas Proteínas ligadoras de fita simples que impedem que as fitas de DNA se liguem novamente, isso faz com que as duas fitas mantenham-se separadas para a transcrição. A enzima DNA Polimerase somente adiciona nucleotídeos na presença de Primers, que são sequências simples de nucleotídeos encontrados no início da fita que será duplicada. Para isso, segue a ação das enzimas Primase. A Primase inicia o processo de síntese adicionando um trecho curto de aproximadamente 5 nucleotídeos. Esse pequeno fragmento de DNA fornece a sequência 3’ necessária para a DNA Polimerase seguir com seus mecanismos. Uma vez que a sequência Primer esta disposta na fita, a DNA Polimerase da continuidade na sequência de DNA, complementando a fita molde. Para adicionar nucleotídeos, a DNA Polimerase necessita de energia e esta é proveniente das moléculas precursoras dos nucleotídeos que são compostas por 3 fosfatos (desoxinucleosídeos trifosfato), lhe conferindo energia. Antes da adição dessas moléculas na fita de DNA, o grupamento fosfato é quebrado liberando energia que é usada para formar a nova ligação entre o nucleotídeo a fita que esta sendo construída. A enzima DNA Polimerase pode apenas reconhecer o sentido (a direção) 5’ -> 3’ do DNA. Como ambas as fitas são sintetizadas no mesmo momento e a dupla hélice de DNA são fitas antiparalelas, tem-se a seguinte questão: as duas enzimas DNA Polimerase estão em direção opostas seguindo o mesmo sentido do DNA, em algum momento da replicação elas se encontraram e ambas seguirão seus caminhos adiante completando a fita. Observe a figura 9: 4.2 Fragmentos de Okazaki Volta na figura 9, observe que o lado esquerdo da fita não esta completa. Do lado direito vimos uma fita de cor amarela recém sintetizada completa, chama de fita líder. Essa fita líder (Observe do lado direito da figura 9) é feita continuamente com apenas uma única sequência se primers no início da replicação. Ao lado esquerdo da figura 9, observa-se que a fita de cor amarela é composta de fragmentos ou pequenas partes de DNA. Essa fita é chamada de fita tardia, pois a DNA Polimerase se separa dos nucleotídeos recém colocados necessitando de mais sequências de primers ao longo da fita de DNA para que o DNA polimerase se ligue e continue na síntese de nova fita. Essa característica foi observada por Okazaki e seus colegas pesquisadores enquanto pesquisavam sobre a replicação de DNA na enterrobactériaE. coli. Concluindo: A Topoisomerases são enzimas que atuam controlando o grau de superenrolamento do DNA e são extremamente importantes, pois permitem que o DNA permaneça desenrolado para o término da replicação. O funcionamento perfeito da replicação inicia-se apenas com a ação dessas enzimas, que quebram ligações do DNA e asseguram que todas as moléculas do DNA que sofreram quebra estão ligadas a própria topoisomerases (para não se perderem) para serem recolocadas. A síntese de DNA é catalisada por diversas enzimas e proteínas que garantem perfeitamente a duplicação da molécula. A enzima mais importante e a DNA Polimerase que utiliza energia contida no nucleotídeo trifosfato para ligar o próprio no nucleotídeo na fita complementar. Quando inseridas na fita, os nucleotídeos devem respeitar a Regra de Chagarff, na qual Adenina sempre se ligará com Timina e Citosina com Guanina. A medida que os nucleotídeos são encaixados, o polinucleotídeo (DNA) vai sendo construído. Ao final da replicação, uma limpeza deve ocorrer na região nuclear para manter a integridade e funcionamento da maquinaria molecular. Para isso os primers são removidos, moléculas especializadas conferem se há algum tipo de mutação ou troca de bases e a enzima DNA Ligase é recrutada para ligar as duas fitas de DNA. Sendo assim, o processo de replicação ou duplicação envolve a atividade de enzimas: DNA Polimerase, Primase, DNA Helicase, DNA Figura 9: Observe esse grande maquinário molecular. Aqui fica mais entendível a função de cada enzima e proteína. Calma, vou comentar com vocês sobre Fragmentos de Okazaki. Mas agora quero que observem o sentido do caminho da DNA Polimerase. Veja que o sentido 5’ -> 3’ da fita (por ser antiparalela) seguem opostas e estas enzimas vão seguir caminhos opostos devido a fita de DNA ser antiparalela. No processo de Replicação do DNA, temos a atuação de duas Polimerases para que as duas fitas sejam replicadas simultaneamente. Fonte: Imagem do Blog disponível no link https://djalmasantos.wordpress.com/2010/10/31/duplicacao-do-dna/ https://djalmasantos.wordpress.com/2010/10/31/duplicacao-do-dna/ Ligase, Proteínas ligadoras de fita simples e topoisomerase. São necessárias 3 etapas simples e ao mesmo tempo complexas para formar uma nova fita de DNA: Iniciação, Ampliação ou alongamento e Termino. A replicação do DNA é a única maneira de manter a informação genética e transmiti-la hereditariamente. 5.0 TRANSCRIÇÃO DE RNA O DNA é a principal molécula que armazena a informação genética de um organismo ou indivíduo. Como já apresentado, na molécula de DNA contém milhares de genes formadores de proteínas ou de RNAs funcionais. Aos genes que portam uma informação para a síntese de uma proteína, necessita de todo um processo mediado por mecanismos moleculares para que ao final, uma proteína funcional seja produzida. O primeiro processo crucial para um gene expressar sua proteína é a formação do RNAm que, após sua transcrição, será o responsável por levar a informação até os ribossomos e assim traduzidos em proteínas. A transcrição é um processo fundamental que ocorre no genoma para a produção de proteínas. As proteínas são sequências de aminoácidos que juntos formam a cadeira polipeptídica. Essas moléculas são cruciais para a estrutura e funcionamento das células, isto é, importante para a manutenção da vida celular. O processo de transcrição de RNA é o primeiro momento da expressão gênica. Durante esse processo, uma sequência de DNA equivalente a um gene é copiada formando uma molécula de RNA, ou seja, o DNA transmite sua informação genética por intermédio de uma nova molécula, o RNA mensageiro ou RNAm. Para que inicie o processo de transcrição, é necessária que a dupla hélice de DNA se desenrole na região em que o gene transcrito se encontra, para isso, as pontes de hidrogênio são rompidas pelas helicases e as duas fitas são separadas. Nesse processo, uma das duas fitas serão usadas como molde para passar a informação ao RNA e o produto RNA é complementar a fita molde que será transcrita. O processo de transcrição inicia-se quando a RNA Polimerase se liga a região promotora do gene. Esta região não contém informações codificantes para a síntese de proteína, é apenas um local em que a enzima RNA Polimerase reconhece para se “ligar” e começar a transcrever. A região promotora é provida de sequências de nucleotídeos que permitem o reconhecimento e ligação da RNA Polimerase e outras moléculas. Após essa ligação, forma-se uma bolha de transcrição, uma região em aberto do DNA que contém moléculas para o processo de transcrição. Uma vez todas as moléculas posicionadas para a transcrição, a RNA Polimerase construí uma fita complementar, inserindo cada nucleotídeo correspondente ao nucleotídeo da fita molde do DNA, contudo, cada nucleotídeo que contém como base a Timina é substituída pela Uracila no transcrito de RNA. \ Observe as figuras 10 e 11 abaixo. Ao estudar Biologia Molecular, em algum momento você se questionou: Por que o RNA troca a Timina por Uracila? Ou: Qual a diferença entre Timina e Uracila? Pois bem, agora você nunca mais vai esquecer! O nome da Timina não é bem Timina como conhecemos, seu nome científico é 5-Metil-Uracila. Daí, sabemos que a Timina é a Uracila com um grupamento Metil no carbono 5º do seu açúcar. Então na molécula de DNA temos uma Uracila modificada pelo grupamento Metil. Contudo, durante a transcrição, a base nitrogenada Timina perde seu grupamento Metil, tornando-se a Uracila que fará parte da sequência nucleotídica do RNAm. Figura 10: Observe a bolha de transcrição. Esta ilustração, apenas uma fita de DNA é usada como molde para a produção da fita de RNAm. Fonte: Imagem retirada so site Nem tudo é Físio. A RNA Polimerase transcreve o RNA até o terminal composto por sinais para que o processo chegue ao fim, chamado de terminador (sequências específicas de nucleotídeos que apontam o término da transcrição. O fim do processo de transcrição é chamado de terminação. Após a transcrição, o transcrito de RNA está pronto para ser utilizado na tradução, no interior no hieloplasma (citoplasma) quando em humanos, e tem como denominação RNA mensageiro (ou RNAm). Em relação aos seres procariontes, como o material genético é disperso no citoplasma, o processo de transcrição e tradução do RNAm ocorrem concomitantemente, isto é, o processo de tradução pode iniciar enquanto o RNA ainda é transcrito no genoma. Nas bactérias, embora a transcrição ainda esteja em andamento, os ribossomos podem ligar-se ao transcrito de RNA e começa-lo a traduzir em proteína. Em células eucariontes, a presenta de compartimentos, a maior complexidade das organelas e a presença do envoltório nuclear, ambos os processos (transcrição e tradução) podem ocorrer apenas em locais diferentes na célula, fazendo com que o RNAm seja traduzido após o término da transcrição. Contudo, o processo de transcrição do RNA em células eucariontes é mais complexo quando comparado com células procariontes, pois para que o transcrito de RNA se torne um RNAm, é necessário passar por uma etapa especial antes de ser direcionado aos ribossomos. Isso significa que o processo de tradução não pode iniciar até que a transcrição seja concluída. Mas esse assunto será abordado mais a frente. Resumindo: A transcrição é um processo importante na expressão gênica e é um processo no qual um gene, formado por uma sequência de nucleotídeos, é usado como molde para a síntese de proteína. A RNA Polimerase é a principal enzima responsável pela transcrição do RNA a transcrição apenas inicia com o reconhecimento desta enzima na região promotora, o que permite que a enzima se ligue ao DNA e inicie a transcrição. Neste processo, o nucleotídeoque tem como base nitrogenada a Timina, é “substituída” pela Uracila devido a perda do grupamento metil presente na estrutura da Timina. A transcrição acaba no processo de terminação e resulta em transcritos de RNAs que serão modificados em RNAms e levados para o interior do hieloplasma para ligar aos ribossomos e iniciar a tradução. Figura 11: Observe a imagem. Esta figura apresenta a molécula de RNA sendo transcrito por muitas moléculas de RNA Polimerase. Cada RNA Polimerase apresenta uma “calda” atrás, equivalente ao RNAm. Observe que no início (Begin = extremidade 5’ do DNA) da parte do DNA em transcrição, há pequenos prolongamentos. Esses prolongamentos são fitas de RNAs sintetizadas pelo RNA Polimerase. No início do gene as fitas de RNAs são mais curtas e ficam cada vez maiores a medida que a RNA Polimerase percorre a fita de DNA molde do gene expresso, sendo “End” indicando a extremidade 3’ da fita. Fonte: Imagem modificada de "Transcription label en," by Dr. Hans-Heinrich Trepte, retirada do site Khan Academy. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Transcription_label_en.jpg 6.0 DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR Essa teoria foi postulada por Francis Crick após a sua descoberta com James Watson e colaboradores da estrutura física do DNA. Na década de 50, a hipótese de que o DNA é usado como molde para transcritos que deslocavam- se ao citoplasma para a síntese de aminoácido estava vigente. Após a descoberta que mudou a história da biologia, Crick postulou essa teoria como Dogma Central. Observe a figura 12: Essa teoria envolve os dois últimos capítulos desenvolvidos anteriormente. O DNA é um composto de unidades funcionais, chamada de genes. No genoma humano contém milhares de genes envolvido em alguma função no organismo humano. De acordo com o Dogma Central, os genes especificam produtos funcionais, como proteínas e enzimas, ou seja, cada tipo de gene expressa uma proteína que terá funções específicas na maquinaria celular. Exemplificando: um gene X, produz uma proteína que ajuda na produção de pigmentos, como flores, olhos, pele humana e etc.. Para essa teoria, o produto funcional o gene são os polipeptídicos ou mais conhecidos como proteínas. Os genes que contém informações para a síntese de polipeptídicos são chamados de codificadores de proteínas. Contudo, nem todos os genes são determinantes para obter como produto final uma proteína, por que o Dogma Central seja adequado a essa hipótese. Alguns genes fornecem instruções para a formação de RNA ribossômico e micros RNAs que desempenham papeis no controle da expressão gênica, assunto que será abordado. Figura 12: As setas indicam a direção que ocorre o fluxo da informação gênica. O que significa que o DNA é molde para o RNAm que é um intermediário para a síntese de aminoácido e produção de proteína. Fonte: Imagem retirada do Site Infoescola. Neste momento eu quero que você observe que o Dogma Central é uma teoria comprovada parcialmente, isto é, sabemos que o fluxo da informação gênica pode levar a um produto proteico, mas sabe-se que nem sempre um produto funcional é uma proteína. Ao final desde capítulo, indicarei referências apenas sobre Dogma Central, portando mais a frente veremos que nosso genoma é mais complexo do que se imagina. Retomando a figura anterior, as setas indicam a direção do fluxo gênico, na qual o DNA, no processo de duplicação ou replicação, gera ao final uma nova molécula de DNA; a seta entre o DNA e RNA que implica no processo de replicação, na qual o DNA servirá como molde para a formação de um transcrito e a tradução da molécula de RNA que será traduzida, coordenada pelo código do RNA. Observando a figura 12, nota-se que as setas são unilaterais, ou seja, para se obter uma proteína, é necessária uma fita transcrita de RNA. Nunca será possível uma proteína determinar a sequência de RNA. Quanto as moléculas de DNA e RNA, naquele momento não compreendia ao todo o funcionamento do genoma como nos dias atuais, portanto, consideravam que não era possível uma sequência de RNA sintetizava um DNA. Após muitos estudos com células procariontes e com o avanço do projeto genoma humano, foi possível observar que as cadeias de RNA podem atuar como molde para a síntese de DNA. O quadro 1 abaixo explica como funciona a síntese de DNA por intermédio da fita de RNA. 6.1 Como um gene especifica uma proteína? Muitos genes são compostos por sequência de nucleotídeos que compõe de informações codificantes para proteínas. Para que uma proteína seja fabricada, são necessários dois processos importantes: transcrição e tradução. Como foi apresentado no capítulo anterior, o processo de transcrição envolve a síntese de um transcrito de RNA para formar um RNAm. Em células procariontes o processo de tradução ocorre simultaneamente ao processo de transcrição. Em células eucariontes, o transcrito de RNA precisa ser finalizado, transformado em RNAm e direcionado ao citoplasma para unir-se aos ribossomos. Assim, ocorrerá a tradução. No processo de tradução, a sequência de RNAm é decodificada. O nome tradução remete a tradução de um código ou linguagem de aminoácidos que vai formar a sequência de polipeptídios. Desde modo, durante a expressão de um gene, informação flui do DNA RNA PROTEÍNA, essa teoria é conhecida como Dogma Central da Biologia Molecular. O processo de iniciar do DNA para produzir um produto funcional é conhecido como expressão gênica. O RNAm é uma sequência de nucleotídeos e sua sequência carrega códigos que serão traduzidos pelos ribossomos. Cada código é traduzido numa Quadro 1: No genoma humano há sequências de genes denominadas de Retrotransposons, um grupo da Família dos Transposons. Os retrotransposons codificam duas proteínas, dentre elas a Transcriptase Reversa (TR). Essa proteína é um tipo especial de DNA Polimerase que utiliza o molde de RNA para sintetizar o DNA. Esse assunto não será abordado com profundidade neste curso, porém deixarei uma indicação de artigo para mais pesquisas. Artigo: https://revistapesquisa.fapesp.br/2012/08/10/dna-cigano (Caso o link não abra, basta apenas inserir no navegador de pesquisa a frase “DNA Cigano – Revista FAPESP”. https://revistapesquisa.fapesp.br/2012/08/10/dna-cigano sequência de aminoácido de uma cadeia polipeptídica. Será apresentado também as etapas do processo de tradução e um quadro com os códons que são a base do código genético. Leitura complementar: • Etapas da transcrição: https://pt.khanacademy.org/science/biology/gene-expression- central-dogma/transcription-of-dna-into-rna/a/stages-of-transcription • Livro: Biologia Molecular do Gene – Watson – 7ª Edição. (Capítulo 2) • Livro: Biologia Molecular da Célula – Alberts – 6ª Edição (Capítulo 6) __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ Espero que essa apostila de Introdução a Biologia Molecular some nos seus estudos. Livros de Referências: Biologia Molecular do Gene, Genética: um enfoque molecular e The Cell. Bons Estudos! https://pt.khanacademy.org/science/biology/gene-expression-central-dogma/transcription-of-dna-into-rna/a/stages-of-transcription https://pt.khanacademy.org/science/biology/gene-expression-central-dogma/transcription-of-dna-into-rna/a/stages-of-transcription