Dissertação_Vanessa_Bernardes_VERSÃO_FINAL_2014_pronta - com correções da banca

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PUC-GOIÁS

Nayara Borges

02/08/2020

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA
MOLECULAR

Vanessa Bernardes

ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E TRANSFERIBILIDADE DE
MARCADORES MICROSSATÉLITES DE Byrsonima cydoniifolia A.
JUSS. (MALPIGHIACEAE)

Orientador (a): Mariana Pires de Campos Telles

GOIÂNIA - GO
FEVEREIRO – 2014
ii

VANESSA BERNARDES

ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E TRANSFERIBILIDADE DE
MARCADORES MICROSSATÉLITES DE Byrsonima cydoniifolia A.
JUSS. (MALPIGHIACEAE)

Orientador (a): Mariana Pires de Campos Telles

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Genética e Biologia Molecular
da Universidade Federal de Goiás, como parte
das exigências para obtenção do título de
Mestre.

GOIÂNIA - GO
FEVEREIRO – 2014
iii

DEDICATÓRIA

DEDICO À MINHA AMADA FAMÍLIA

OFEREÇO AOS MEUS QUERIDOS AMIGOS

“Eu quase que nada não sei. Mas desconfio de muita coisa.”
Guimarães Rosa

AGRADECIMENTOS

Agradeçer não é o suficiente, mas é a forma como tenho para expressar sua
importância na minha vida, mesmo que seja durante anos ou minutos, cada instante foi
essencial para que no decorrer da minha caminhada eu me encontrasse agora onde estou.
Agradeço a vocês meus amados, pai Nivaldo, mãe Marta e irmã Aline que durante
toda minha existência sempre me apoiaram, me deram força quando eu achava obstáculos
difíceis demais e sempre foram exemplos para mim. A toda minha família obrigada pelo
amor incondicional.
Sou grata a você minha querida orientadora, professora Doutora Mariana Pires de
Campos Telles, por toda sua dedicação, paciência, empenho e esforço para que eu me
tornasse melhor como pessoa e como profissional. Muito obrigada por todas as
oportunidades e por sua confiança em mim. Serei eternamente grata.
Agradeço vocês professores, colegas e amigos do Laboratório de Genética &
Biodiversidade (LGBIO) da UFG sem os quais esse trabalho não existiria, obrigada pela
ajuda, pela disposição, responsabilidade e trabalho em conjunto. Foi um prazer conviver
com vocês, dividindo as angústias de quando os experiementos davam errados e as alegrias
de quando tudo dava certo. Em especial agradeço a Ramilla, Sara, Daniela, Tatiane,
Kássia, Elen, Mariana, Rejane, Ariane, Wárita, Luciana e Leciane pela amizade e por dias
de trabalho mais sorridentes e divertidos.
À vocês meus queridos e estupendos amigos o meu muito obrigada por me darem
força, me incentivar e acreditar em mim. Por nas horas tristes e felizes estarem ao meu
lado, por compreenderem minha ausência e estarem sempre de braços abertos para me
receber. Por todas as conversas e espairecimento nos finais de semana. Em especial a Aline
(irmã e amiga), Kamila, Raquel, Ada, Dônovan, Samantha e Valdemar por me
incentivarem a prestar o mestrado, ao Maithan, Thaís Rubioli, Raysa, Carla, Suellen,
Juliana por sempre me apoiarem na minha decisão.
Agradeço à oportunidade de preparar as bibliotecas genômicas no Laboratório de
Análise Genética e Molecular (CBMEG) da UNICAMP e a Capes, Fapeg e CNPq pelo
suporte financeiro fundamental na execução deste trabalho.
Muito obrigada a todos por mais uma etapa da minha vida ser concluída, cada um
teve sua participação no meu crescimento.
―A felicidade só é real quando compartilhada.‖ (H. David Thoreau).
v

RESUMO
Marcadores moleculares são sequências de DNA identificáveis, encontrados em locais
específicos do genoma e transmitidos pelas leis padrão de herança de uma geração para a
seguinte. Os marcadores moleculares conhecidos como microssatélites são indicados para
análises genético-populacionais, por serem amplamente distribuídos no genoma e
apresentarem alto conteúdo de informação polimórfica por loco. Para subsidiar diferentes
práticas de manejo, bancos de germoplasma e estudos de conservação é importante realizar
a análise da variabilidade genética nas populações naturais das espécies de interesse. No
bioma Cerrado encontram-se inúmeras espécies medicinais e frutíferas que são utilizadas
de forma extrativista, dentre elas estão as do gênero Byrsonima sp., conhecidas
popularmente como murici, que são pertencentes à família Malpighiaceae. No Brasil,
existem cerca de 70 espécies com ampla distribuição no Cerrado. O murici é uma planta de
múltiplas potencialidades e apesar de não ser domesticada, a sua exploração econômica
apresenta potencial. Nesse contexto, o objetivo do trabalho foi desenvolver um conjunto de
marcadores microssatélites para a espécie Byrsonima cydoniifolia A. JUSS. e testar o
potencial de transferibilidade deste conjunto de marcadores para a espécie Byrsonima
crassifolia L. Kunth. As regiões microssatélites foram isoladas utilizando bibliotecas
genômicas enriquecida para regiões repetitivas e, posteriormente, as mesmas foram
utilizadas para o desenho de primers. A partir dos primers desenvolvidos foram testadas
condições de temociclagem e seus produtos foram caracterizados utilizando o DNA de 90
indivíduos de B. cydoniifolia e 24 indivíduos de B. crassifolia. Das 60 sequências obtidas,
foi possível identificar 22 regiões microssatélites e desenhar pares de primers para 17.
Destes, 14 locos apresentaram polimorfismo e três foram monomórficos em três
populações de B. cydoniifolia. O número de alelos variou de 3 a 17, com uma média de
10,45 alelos por loco. A heterozigosidade observada foi semelhante à heterozigosidade
esperada, com os valores variando de 0,20 a 0,92 e 0,43 a 0,92, respectivamente. Foram
identificados 39 alelos privados. Este conjunto de marcadores apresentou alta
probabilidade combinada de exclusão de paternidade (Q) igual a 0,999 e probabilidade de
identidade combinada (I) igual a I=7,84x10-1. Os valores globais obtidos para o índice de
fixação (FIS) não foram significativos (P<0,05), enquanto que os valores de FST=0,082 e
FIT=0,143 foram significativos. Para a espécie Byrsonima crassifolia, nove pares de
primers produziram bons padrões de amplificação cruzada na população avaliada,
apresentando uma média de 7,56 alelos por loco. A heterozigosidade observada variou de
0,250 a 0,958, maior do que a heterozigosidade esperada, que variou de 0,223 a 0,905. A
probabilidade combinada de exclusão de paternidade (Q) foi alta igual a 0,998 e a
probabilidade combinada de identidade igual a 6,42x10
-9
. A estratégia de desenvolvimento
de marcadores microssatélites a partir da metodologia de biblioteca genômica enriquecida
foi eficiente para gerar um painel com onze marcadores microssatélites polimórficos para
B. cydoniifolia e nove marcadores microssatélites polimórficos transferidos com sucesso
para B. crassifolia, disponibilizando uma ferramenta útil para estudos genético-
populacionais não só para as espécies B. cydoniifolia e B. crassifolia, mas possivelmente
para outras espécies próximas evolutivamente.

Palavras-chave: Genética de populações, Murici, SSR, variabilidade genética.
vi

ABSTRACT

Molecular markers are identifiable DNA sequences found at specific sites in the genome
and transmitted by the standard laws of inheritance from one generation to the next.
Markers known as microsatellite are indicated for genetic population analysis; due they are
widely distributed in the genome and their high polymorphic information content per
locus. To support different management practices, genebanks, conservation studies is
important to perform the analysis of genetic variability in natural populations of the species
of interest. In the biome Cerrado there are inumerous medicinal and fruit trees that are used
in a extractive way, among them are those of the gender Byrsonima sp. popularly known as
murici, belonging to the family Malpighiaceae.In Brazil presents about 70 species with
wide distribution in the Cerrado. The murici is a multi- potential plant and although not be
domesticated, its economic exploitation can be viable. In this context, the objective was to
develop a set of microsatellite markers for species Byrsonima cydoniifolia A. JUSS. and
test the potential transferability of this set of markers for species Byrsonima crassifolia L.
Kunth. The microsatellite regions were isolated using genomic libraries enriched for
repetitive regions and then they were used for primer design. Using the primers designed
temociclagem conditions were tested and the products were characterized using the DNA
of 90 individuals of B. cydoniifolia and 24 indivuduals of B. crassifolia. Of these, 14 loci
were polymorphic and 3 monomorphic in three populations of B. cydoniifolia. The number
of alleles ranged from 3 to 17, with an average of 10.45 alleles per locus. The observed
heterozygosity was similar to the expected heterozygosity, the values ranged from 0.20 to
0.92 and 0.43 to 0.92; respectively. 39 private alleles were identified. This set of markers
showed high combined probability of paternity exclusion (Q) equal to 0.999 and combined
probability of identity (I) equal to I=7.84x10-1. The global values for the fixation index
(FIS) were not significant (P<0.05), whereas the values of FST=0,082 and FIT=0,143 were
significant. For Byrsonima crassifolia species, nine pairs of primers produced good
patterns of cross amplification in the study population, with a mean of 7.56 alleles per
locus. The observed heterozygosity ranged from 0.250 to 0.958, which was higher than the
expected heterozygosity ranging from 0.223 to 0.905. The combined probability of
paternity exclusion (Q) was equal to 0.99847 and high combined probability of identity
equal to 6.42x10
-9
. The strategy of development of microsatellite markers from the
genomic library enriched methodology was efficient to generate a panel with eleven
polymorphic microsatellite markers for B. cydoniifolia and nine polymorphic microsatellite
markers successfully transferred to B. crassifolia, providing a useful tool for population
genetic studies not only for the species B. cydoniifolia and B. crassifolia, but possibly for
other related species evolutionarily.

Key words: Genetic variability, Murici, population genetic, SSR.

SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................ 8
LISTA DE TABELAS ....................................................................................................... 10
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 11
2. OBJETIVOS ........................................................................................................ 14
2.1 OBJETIVO GERAL ..................................................................................................... 14
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................... 14
3. REFERÊNCIAL TEÓRICO .............................................................................. 15
3.1 MARCADORES MOLECULARES ............................................................................ 15
3.1.1 Microssatélites ....................................................................................................... 16
3.1.1.1 Desenvolvimento de microssatélites ..................................................................... 22
3.2 ESPÉCIES DO GÊNERO Byrsonima NO CERRADO ............................................... 25
3.3 DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO DE MARCADORES MICROSSATÉLITES
PARA ESPÉCIES NATIVAS DO CERRADO ........................................................... 29
4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 31
4.1 MATERIAL BIOLÓGICO .......................................................................................... 31
4.2 EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA .......................................................... 32
4.3 CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS GENÔMICAS ENRIQUECIDAS COM
MICROSSATÉLITES .................................................................................................. 32
4.4 BUSCA DE REGIÕES MICROSSATÉLITES E DESENHO DOS PRIMERS .......... 34
4.5 PADRONIZAÇÃO DOS PRIMERS DE REGIÕES MICROSSATÉLITES ............... 35
4.5.1 Amplificação dos fragmentos de DNA ................................................................. 35
4.5.2 Desenvolvimento de multiplex de eletroforese para obtenção de genótipos ........ 36
4.6 CARACTERIZAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA ..................................... 37
4.7 TRANSFERIBILIDADE PARA A ESPÉCIE Byrsonima crassifolia ......................... 38
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................ 40
5.1 BIBLIOTECAS GENÔMICAS ENRIQUECIDAS COM MICROSSATÉLITES ...... 40
5.2 BUSCA DE REGIÕES MICROSSATÉLITES E DESENHO DE PRIMERS LOCOS-
ESPECÍFICOS ............................................................................................................. 43
5.3 PADRONIZAÇÃO DA AMPLIFICAÇÃO DOS PRIMERS DE REGIÕES
MICROSSATÉLITES .................................................................................................. 46
5.4 CARACTERIZAÇÃO DOS MARCADORES MICROSSATÉLITES COM BASE
EM INFORMAÇÕES POPULACIONAIS DA ESPÉCIE Byrsonima cydoniifolia .... 49
5.5 TRANSFERIBILIDADE DE MARCADORES DE BYRSONIMA CYDONIIFOLIA
PARA Byrsonima crassifolia ....................................................................................... 56
5 CONCLUSÃO ..................................................................................................... 60
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 61
APÊNDICE ........................................................................................................................ 77
ANEXOS .......................................................................................................................... 83
8

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Mecanismo de mutação slippage durante a replicação em uma região
microssatélite. Adaptado de Goldstein & Schlotterer, 1999............................. 20
Figura 2. (A) Representa um genótipo homozigoto para uma região microssatélite. (B)
Representa um genótipo heterozigoto para uma região microssatélite. (C)
Padrão co-dominante visualizado em gel de eletroforese. Adaptado de Ferreira
& Grattapaglia, 1995. ....................................................................................... 21
Figura 3. Protocolo do isolamento de microssatélites a partir de seleção por hibridização
com oligonucleotídeos 5’ biotinilados e revestido de estreptavidina (Kandpal et
al., 1994 , Kijas et al., 1994, Billotte et al., 1999). Adaptado de Zane et al.,
2002. ................................................................................................................. 23
Figura 4. (A) Árvore pertencente ao complexo Byrsonima sp. (murici). (B) Folhas
coriáceas e pilosas de 14 a 20 cm de comprimento presentes no complexo de
espécies de murici. (Fonte:
http://4.bp.blogspot.com/_DzmJnyxWMz8/TSYMVFdTO6I/AAAAAAAAAA
0/dmUuetXcC08/s1600/murici+arvore.jpg). .................................................... 26
Figura 5. (A) Inflorescência de Byrsonima sp. com glândulas visíveis nos cálices. (B)
Flores de corola amarela ou alaranjada após a polinização. (C) Inflorescências
racemo terminal de Byrsonima sp. (Fonte: http://www.flickr.com/photos/
marlene_monteiro/ 4537978971/ lightbox/;http://www.flickr.com/
photos/mercadanteweb/ 8289008291/ ; http://noticias.uol.com.br /album/
110921arvorescentenarias _album.htm). ..........................................................27
Figura 6. (A) Frutos imaturos de murici contendo até 2 cm de diâmetro. (B) Sementes
contendo 0,5 cm de diâmetro. (C) Frutos maturos de Byrsonima sp. apresentam
colocaração amarela. (Fonte:
http://www.flickr.com/photos/adilson2010/5215514743/in/pool639490@N20/;
http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/murici/imagens/murici-2.jpg;
http://www.tyba.com.br/portugues/min). ......................................................... 28
Figura 7. Pontos de coleta específicos das espécies Byrsonima cydoniifolia e Byrsonima
crassifolia. Fonte: species Link. Disponível em: http://splink.cria.org.br/. ..... 31
Figura 8. Biblioteca 16 indicada com a seta pertence à espécie B. cydoniifolia. Perfil de
gel de agarose 1% corado com brometo de etídeos mostrando a fragmentação
do DNA de B. cydoniifolia com a enzima AfaI. ............................................... 40
Figura 9. Biblioteca 16 indicada com a seta pertence à espécie B. cydoniifolia. Perfil de
gel de agarose 1% corado com brometo de etídeos mostrando os fragmentos de
DNA ligados aos adaptadores amplificados. .................................................... 41
Figura 10. Biblioteca 16 indicada com a seta pertence à espécie B. cydoniifolia. Perfil de
gel de agarose 1% corado com brometo de etídeos mostrando os fragmentos
enriquecidos amplificados em um padrão ideal (entre 200 e 1200pb). ............ 41
Figura 11. Biblioteca 16 indicada com a seta pertence à espécie B. cydoniifolia. Perfil de
gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo mostrando o produto da
amplificação dos clones demostrando que dos 12 clones, 11 continham
insertos. ............................................................................................................. 42
Figura 12. Biblioteca 16 pertence à espécie B. cydoniifolia. Perfil de gel de agarose 1%
corado com brometo de etídeo indicou boa qualidade e concentração da
extração plasmidial, com bandas fortes e nítidas. ............................................. 42
Figura 13. Sequências obtidas a partir dos 60 clones sequênciados em Byrsonima
cydoniifolia. ...................................................................................................... 43
9

Figura 14. Porcentagem dos motivos de repetição presentes nas 22 regiões microssatélites
identificadas no genoma da espécie Byrsonima cydoniifolia. .......................... 44
Figura 15. Gel de agarose 3% da etapa de otimização dos locos microssatélites de B.
cydoniifolia utilizando o marcador 100bp. ....................................................... 46
Figura 16. Gel de acrilamida 6% corado com nitrato de prata para verificação de
polimorfismos nos locos microssatélites. Todos os locos neste gel foram
polimórficos para a espécie B. cydoniifolia. ..................................................... 47
Figura 17. Gel de acrilamida 6% corado com nitrato de prata para verificação de
polimorfismos nos locos microssatélites. Os locos BCY04, BCY 15, BCY 17
foram monomóficos para a espécie B. cydoniifolia. ......................................... 47
Figura 18. Locos microssatélites que apresentaram alelos nítidos sem inespecificidades no
analisador automático de DNA ABI3500 e foram utilizados para realizar a
análises genético-populacionais. (A) BCY14, (B) BCY05, (C) BCY07, (D)
BCY12, (E) BCY10, (F) BCY06, (G) BCY09, (H) BCY01, (I) BCY02, (J)
BCY11, (K) BCY08. ........................................................................................ 48
Figura 19. Distribuição das frequências alélicas do loco microssatélite, estimadas para
cada uma das três populações de B. cydoniifolia. O eixo Y indica a freqüência
alélica e o eixo X indica o tamanho do alelo em pares de base. ....................... 51
Figura 20. Distribuição das frequências alélicas do loco microssatélite, estimadas para
cada uma das três populações de B. cydoniifolia. O eixo Y indica a freqüência
alélica e o eixo X indica o tamanho do alelo em pares de base. ....................... 52
Figura 21. Distribuição das frequências alélicas dos locos microssatélites, estimadas para
cada uma das três populações de B. cydoniifolia. O eixo Y indica a freqüência
alélica e o eixo X indica o tamanho do alelo em pares de base. ....................... 53
Figura 22. Gel de acrilamida 6% corado com nitrato de prata para verificação de
polimorfismos nos locos microssatélites. Os locos BCY03, BCY04, BCY13,
BCY15 e BCY17 não apresentaram produto de amplificação para a espécie B.
crassifolia. ........................................................................................................ 56
Figura 23. Distribuição das frequências alélicas dos 9 locos microssatélites estimadas para
a população de B. crassifolia. ........................................................................... 58

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Classificação das regiões microssatélites (Adaptado de Kalia et al., 2011) ....... 17
Tabela 2. Localização das populações naturais de Byrsonima cydoniifoliae Byrsonima
crassifolia. ........................................................................................................ 31
Tabela 3. Protocolo para reação de PCR para um indivíduo da espécie Byrsonima
cydoniifolia. ...................................................................................................... 35
Tabela 4. Protocolo de reação de PCR otimizado para genotipagem. ................................ 37
Tabela 5 - Características dos 17 locos microssatélites isolado do genoma de Byrsonima
cydoniifolia. ...................................................................................................... 45
Tabela 6. Painel com as reações multiplex utilizadas na genotipagem dos 90 indivíduos de
B. cydoniifolia. .................................................................................................. 48
Tabela 7. Relação dos locos com seus respectivos número de alelos (A), heterozigosidade
esperada (He), heterozigosidade observada (Ho), probabilidade de exclusão de
paternidade (Q) e probabilidade de identidade (I). ........................................... 50
Tabela 8.Variabilidade genética em três populações de B. cydoniifolia utilizando 11
marcadores microssatélites. (N) número de indivíduos, (A) número de alelos,
(He) heterozigosidade esperada, (Ho) Heterozigosidade observada, (FIS) índice
de fixação. ......................................................................................................... 53
Tabela 9. Relação dos locos que apresentaram alelos privados, com os respectivos alelos
de cada loco e suas frequências alélicas em cada população. ........................... 54
Tabela 10. Painel com as reações multiplex utilizadas na genotipagem dos 24 indivíduos
de B. crassifolia. ............................................................................................... 57
Tabela 11. Variabilidade genética da população de B. crassifolia com seus respectivos
número de alelos (A), heterozigosidade esperada (He), heterozigosidade
observada (Ho), índice de fixação (FIS), probabilidade de exclusão de
paternidade (Q), probabilidade de identidade (I). ............................................. 59

1. INTRODUÇÃO

Os estudos de genética de populações avançaram visivelmente a partir da
década de 70, devido aos avanços na biologia molecular que proporcionaram novas
ferramentas como os marcadores moleculares. Os marcadores moleculares permitem
identificar a variação da sequência de DNA e são definidos como sequências de DNA
identificáveis, encontrados em locais específicos do genoma e transmitidos pelas leis
padrão de herança (Semagn et al., 2006).
Assim, a obtenção de marcadores moleculares é de grande utilidade para a
análise genética dos organismos, pois permitem a determinação de variabilidade genética e
identidadegenética, a partir da detecção de polimorfismo (Duran et al., 2009).
Existem diversas classes de marcadores moleculares, que se diferenciam em
seus princípios e metodologias, dentre estas, os marcadores microssatélites são altamente
polimórficos e podem ser usados para o estudo de populações naturais de plantas, pois
permitem agregar conhecimento da distribuição da variabilidade genética entre e dentro de
populações naturais, o que é essencial para a adoção de estratégias eficientes para
conservação de germoplasma ex situ e in situ (Oliveira et al., 2006).
Os marcadores microssatélites são uns dos mais eficientes para estudos de
diversidade genética, genética populacional e estudos evolutivos, tais como análises de
estrutura populacional, sistemas de cruzamentos, fluxo gênico, análise de paternidade e
para vincular a variação fenotípica e genotípica por meio de mapeamentos genéticos e
físicos (Ferreira & Grattapaglia, 1998, Varshney et al., 2005). Além disso, também são
usados em pesquisas fundamentais, como na análise de genoma, mapeamento de genes e
seleção assistida por marcadores (Kalia et al., 2011). A aplicação de marcadores
microssatélites tem gerado bancos de dados cada vez maiores a respeito de estudos
genéticos sobre os efeitos causados pelo pequeno tamanho populacional em extensão e a
distribuição da variação genética neutra (Ouborg et al., 2010). Porém, os diversos estudos
proporcionados pelas aplicações destes marcadores dependem do conhecimento prévio da
sequência de DNA, isolamento e desenvolvimento de pares de primers espécie-específicos
para as regiões microssatélites a serem amplificadas via PCR (Ferreira & Grattapaglia,
1998).
Diferentes estratégias de desenvolvimento de marcadores microssatélites são
conhecidas, a mais tradicional é o desenvolvimento diretamente a partir de bibliotecas de
DNA genômico, as quais podem ser de shotgun ou enriquecidas para microssatélites
12

específicos e bibliotecas de cDNA. Além disso, após o surgimento das novas tecnologias
de sequenciamento de nova gereação (NGS) em 2005, há atualmente a possibilidade de
identificar regiões microssatélites em sequências de genomas ou transcriptomas geradas
por NGS (Perry & Rowe 2011). Alternativamente, microssatélites também podem ser
encontrados através de pesquisa pública de sequências depositadas em bases de dados tais
como GenBank e EMBL ou através da transferibilidade entre espécies (Kalia et al., 2011).
Uma vez desenvolvidos, os marcadores microssatélites geram informações
relevantes para a investigação de processos genéticos que ocorrem em populações, tais
como a diversidade genética de populações, padrões de fluxo gênico, incidência de deriva
genética, geração de vizinhança genética e, portanto, subsidia na identificação de unidades
de conservação e em produção de bancos de germoplasma (Heywood & Iriondo, 2003).
Além disso, estes marcadores são potencialmente transferíveis para espécies
filogeneticamente próximas, reduzindo os custos quando o grupo de pesquisa trabalha com
um conjunto de espécies relacionadas (Varshney et al., 2005).
O Cerrado ocupa mais de 2 milhões de km² no Brasil central e amazônico,
representando cerca de 23,1% do território nacional (Klink & Machado, 2005; Ministério
do Meio Ambiente). A partir do ano 2000, o Cerrado passou a ser considerado um hot spot
de diversidade, compondo umas das 25 áreas do mundo importantes para a conservação da
biodiversidade (Myers et al., 2000). O desmatamento desordenado das práticas agrícolas
sobre este bioma gerou áreas degradadas, extinguindo seus recursos naturais. De acordo
com o programa Monitoramento do Bioma Cerrado do Meio Ambiente as áreas naturais
remanescentes das degradações antrópicas diminuíram de 55,53% em 2002 para 51,54%
em 2008. Estima-se que as áreas do Cerrado remanescentes não representam áreas
consideradas bem conservadas em seu estado original, visto que inclui áreas de vegetação
utilizada como pastagens nativas, áreas submetidas a queimadas, à produção de carvão
vegetal e outras práticas não-sustentáveis (Silva & Bates, 2002; Dias 2008).
No bioma Cerrado encontram-se inúmeras espécies medicinais e frutíferas que
apresentam potencial de utilização econômica e que são exploradas de maneira extrativista,
dentre elas encontram-se em um complexo de espécies do gênero Byrsonima sp.,
conhecido popularmente como murici (Garritano et al., 2006). Diversas espécies de murici
são nativas do Brasil podendo ser encontradas em vários ambientes. Dentre as espécies
pertencentes ao bioma Cerrado podem ser citadas: Byrsonima cydoniifolia, B. crassifolia,
B. verbascifolia, B. pachyphylla, B.intermedia entre outras. Estas espécies raramente são
cultivadas, porém sua presença é frequente em seu habitat natural de campos cerrados,
13

dunas, savanas e capoeiras ralas, sempre sobre solos arenosos, de toda a região amazônica
até a Bahia, Goiás e Mato Grosso (Lorenzi et al., 2006).
Apesar de Byrsonima sp. ainda não ter sido domesticada, sua exploração
econômica pode ser viável, desde que sejam resolvidos problemas técnicos para a
reprodução e o estabelecimento da cultura (Chaves & Naves, 1998; Naves, 1999; Garritano
et al., 2006). Para tanto, a análise da variabilidade genética existente nas populações das
espécies de interesse torna-se importante para subsidiar diferentes práticas de coleta,
implantação e manejo de coleções de germoplasma (Faleiro et al., 2007).

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Desenvolver e caracterizar um painel informativo de marcadores
microssatélites para estudos de genética populacional da espécie Byrsonima. Cydoniifolia
A. JUSS (murici) e testar o potencial de transferibilidade desses marcadores para
Byrsonima crassifolia L. Kunth.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

i. Montar bibliotecas genômicas e sequenciá-las para isolar regiões microssatélites do
genoma da espécie B. cydoniifolia;
ii. Realizar a busca de regiões microssatélites e o desenho dos pares de primers que
flanqueiam as mesmas no genoma da espécie B. cydoniifolia;
iii. Padronizar as condições de termociclagem para os pares de primers desenvolvidos
para cada loco microssatélite;
iv. Caracterizar a variabilidade genética nos locos desenvolvidos para B.cydoniifolia.
v. Avaliar a magnitude e a distribuição da variabilidade genética entre populações de B.
cydoniifolia.
vi. Testar para a espécie B. crassifolia o potencial de transferibilidade dos marcadores
microssatélites desenvolvidos para B. cydoniifolia;
vii. Avaliar a variabilidade genética das regiões microssatélites a partir dos marcadores
transferidos para B. crassifolia.

3. REFERÊNCIAL TEÓRICO

3.1 MARCADORES MOLECULARES

Os recentes avanços na biologia molecular proporcionaram novas ferramentas
que permitem abordar questões evolutivas, ecológicas e taxonômicas. A variação da
sequência de DNA pode ser observada a um nível de precisão e rendimento que antes era
impossível. A maior parte das variações no nível de nucleotídeo muitas vezes não é visível
ao nível fenotípico, portanto marcadores baseados em DNA têm muitas vantagens sobre
marcadores fenotípicos, visto que eles são herdáveis, de mais fácil detecção e não são
afetados pelo ambiente (Duran et al., 2009).
Marcadores moleculares são sequências de DNA identificáveis, encontrados
em locais específicos do genoma, e transmitidos pelas leis padrão de herança de uma
geração para a seguinte, portanto são ferramentas extremamente úteis para analisar a
variação genética, detectando polimorfismos. A maioria dos marcadores moleculares é
amplamente utilizada para realizar estudos de diversidade genética, mapeamento genético,
estudos de associação marcador-fenótipo e em programas de seleção assistida por
marcadores (Semagn et al.,2006).
Existem várias técnicas moleculares, que se diferenciam em seus princípios e
metodologias: forma de detecção do polimorfismo, abundância e distribuição no genoma, e
reprodutibilidade. Assim, uma gama de marcadores moleculares está disponível e podem
ser aplicáveis em diversas situações, por isso, torna-se necessário a realização de uma
escolha cuidadosa do marcador, levando-se em conta as questões biológicas que são de
interesse para cada estudo (Buso et al., 2003; Semagn et al., 2006).
Nos anos 70 surgiu o primeiro tipo de marcador molecular que detecta a
variabilidade entre indivíduos diretamente na molécula de DNA (Grodzicker, 1975). Esse
marcador, denominado RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), baseia-se na
ação de enzimas de restrição que revelam uma diferença entre os tamanhos de fragmentos
de DNA em organismos individuais (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Em meados da década de 80, a principal descoberta que impulsionou os
marcadores moleculares baseados em DNA foi a invenção da PCR (Polymerase Chain
Reaction), realizada pelo pesquisador britânico Kery Mulis. Trata-se de um processo
simples de multiplicar em escala exponencial uma determinada quantidade inicial de DNA
(Mulis e Falona, 1987). Qualquer região genômica poderia, então, ser amplificada in vitro
16

e analisada em muitos indivíduos sem a necessidade de clonagem, bem como grandes
quantidades inicias de DNA genômico (Schlötterer, 2004).
Assim, de acordo com o método de análise, os marcadores moleculares são
classificados como: (i) marcadores baseados em hibridação, assim como marcadores de
polimorfismos no comprimento de fragmentos de restrição (RFLPs); (ii) os marcadores
baseados em PCR, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) (Williams et al., 1990),
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), ISSR (Inter Simple Sequence
Repeats), SSR (Simple Sequence Repeat) ou microssatélites; (iii) marcadores de
polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) (Varshney et al., 2007).
Diante de todos estes marcadores moleculares, os marcadores microssatélites
tem considerável importância e eficiência em estudos de genética populacional devido a
suas propriedades desejáveis: natureza multialélica, herança codominante,
reprodutibilidade, abundância relativa, cobertura extensa do genoma (incluindo genomas
organelares), local específico do cromossomo e receptividade à automação (Kalia et al.,
2011).

3.1.1 Microssatélites

Os marcadores microssatélites são baseados na amplificação de sequências de
DNA, denominadas de regiões microssatélites conhecidas como repetições curtas em
tandem (STR; Edwards et al.,1991) ou sequências simples repetidas (SSR; Tautz, 1989), as
quais são repetições em tandem que apresentam de 1 a 6 nucleotídeos como motivos de
repetição (Agarwal et al., 2008).
As regiões microssatélites são classificadas de acordo com seu tamanho, o tipo
de unidade de repetição e a sua localização no genoma. Segundo o número de nucleotídeos
por unidade de repetição, as regiões microssatélites são classificadas como: -mono, -di, -tri,
-tetra, -penta ou -hexanucleotídeos (Kalia et al., 2011). Dependendo do arranjo dos
nucleotídeos presentes nos motivos de repetição, as regiões microssatélites são
classificadas como perfeita simples, imperfeita simples, composto perfeita ou composto
imperfeita (Wang et al., 2009). Estas regiões estão distribuídas de forma ampla em
genomas de organismos eucariotos e procariotos, tanto no genoma nuclear (nuSSR),
quanto nos genomas cloroplastidiais (cpSSR) e mitocondriais (mtSSR) (Kalia et al., 2011)
(Tabela 1).

Tabela 1. Classificação das regiões microssatélites (Adaptado de Kalia et al., 2011)
A. Baseados no número de nucleotídeos por repetição(n)
Mononucleotídeos (A)n ...AAAAAAAAA...
Dinucleotídeos (CA)n ...CACACACACA...
Trinucleotídeos (CGT)n ...CGTCGTCGTCGTCGT...
Tetranucleotídeos (CAGA)n ...CAGACAGACAGACAGA...
Pentanucleotídeos (AAATT)n ...AAATTAAATTAAATT...
Hexanucleotídeos (CTTAAG)n ...CTTAAGCTTAAGCTTAAG...
B. Baseados no arranjo dos nucleotídeos nos motivo de repetição (Wang et al., 2009)
Perfeito simples (CA)n
Imperfeito simples (AAC)n ACT (AAC)n
Composto perfeito (CA)n (GA)n
Composto Imperfeito (CCA)n ATT (CGA)n
C. Baseado na localização da região microssatélite no genoma
Nuclear nuSSR
Mitocondrial mtSSR
Cloroplastidial cpSSR

A distribuição e a frequência de regiões microssatélites variam entre diferentes
classes de organismos. Os microssatélites são distribuídos de forma não aleatória ao longo
de genomas eucarióticos, e mostra diferentes propriedades em regiões genômicas de
funcionalidade diferente (Katti et al., 2001). Genomas eucarióticos são caracterizados pela
predominância de repetições de mononucleotideos sobre outras classes (Sharma et al.,
2007). Geralmente poli (A/T) são as repetições mais abundantes em cada táxon,
principalmente no genoma humano (Toth et al., 2000). Em todos os vertebrados e
artrópodes, AC/GT é a repetição de dinucleotídeos a mais comum (Beckmann & Weber,
1992), enquanto em plantas repetições de AT seguidas por GA são as mais frequentes
(Lagercrantz et al., 1993; Schug et al., 1998).
As regiões microssatélites com motivo de repetição composta por
dinucleotídeos são as mais comuns em muitas espécies, porém a menos frequente em
regiões codificantes (Li et al., 2002). De acordo com o estudo realizado em trigo por Yu e
colaboradores (2004), 19 % de repetições dinucleotídeas foram encontradas em regiões
codificadoras, 42% em região 5’UTRs e 39% em 3’ UTRs. Em contraste, 74% das
repetições de trinucleotídeos foram encontradas em regiões codificadoras, 20 % em região
5’ UTRs e 6 % em 3’ UTRs.
A maior frequência de repetições de trinucleotídeos em regiões codificantes em
comparação com os outros tipos de repetições pode ser explicada baseada na pressão
18

seletiva que existe levando a supressão de microssatélites não triméricos nas regiões
codificadoras, isso ocorre devido à mudança no quadro de leitura de um gene que poderia
ser causada, com aumento ou um decréscimo no número de unidades de repetição (Kalia et
al., 2011).
Assim, marcadores microssatélites que possuem microssatélites presentes em
regiões de DNA não-codante, ou seja, em sequências intergênicas ou nos íntrons são
classificados como marcadores microssatélites genômicos (SSR), enquanto que
marcadores com regiões microssatélites encontradas em regiões transcritas do genoma
(gênica) são denominados de marcadores microssatélites gênicos (EST-SSR)(VARSHNEY
et al, 2005).
A gênese dos microssatélites pode ser explicada por duas hipóteses, a primeira
sugere que as regiões microssatélites podem surgir espontaneamente a partir de/dentro de
sequências únicas (de novo microssatélites) e a segunda hipótese propõe que os
microssatélites são trazidos em forma primordial de uma localização genômica receptiva
por transposons (adopted microssatélites) (Buschiazzo & Gemmell, 2006).
A evolução do microssatélite, ou seja, qualquer mudança na região repetitiva
resultando no aumento ou diminuição no número de repetição está associada com a sua
taxa de mutação (Ellegren 2004). A taxa de mutação de microssatélites é muito mais
elevada em comparação com as mutações pontuais em regiões codificantes (10
-9
a 10
-10
),
variando de 10
-2
a 10
-6
eventos por loco por geração em eucariotos (Sia et al., 2000,
Schlötterer, 2000).
Convencionalmente, dois modelos de mutações têm sido considerados para os
microssatélites, o Modelo Mutacional Stepwise (SMM) e o Modelo de Alelos Infinitos
(IAM) (Bhargava & Fuentes, 2010). Inicialmente, o conceito de SMM foi apresentado por
Ohta & Kimura (1973), no qual uma unidade de repetição pode ser adquirida ou perdida,
resultando numa expansão ou contração da região microssatélite. Sendo assim, todos os
eventos mutacionais envolvem a mudança emuma única repetição em tandem e, por
conseguinte, possivelmente para um alelo já presente na população. O SMM é geralmente
assumido como pressuposto ao estimar parentesco entre indivíduos e sub-estruturação
populacional (Oliveira et al., 2006). Enquanto que o modelo IAM assume que cada
mutação resulta na criação de um novo alelo e não permite homoplasia (Kimura & Crow,
1964). O IAM descreve que as mutações podem envolver a perda ou ganho de qualquer
número de repetições da região microssatélite, portanto gera novos alelos amostrados, não
encontrados anteriormente na população (Estoup & Cornuet, 1999). Há relatos que o
19

modelo IAM não é apropriado para microssatélites por causa das altas taxas de mutação e
dos processos de mutação dos microssatélites, que conservam memória ancestral de
estados alélicos (Bhargava & Fuentes, 2010), e que o modelo SMM é suposto ser mais
adaptado para variação microssatélite do que o IAM (Estoup & Angers, 1998).
Vários mecanismos mutacionais têm sido propostos para explicar a alta taxa de
mutação em regiões microssatélites, incluindo retrotransposição, recombinação do DNA
(crossing-over desigual) e slippage da polimerase durante a replicação do DNA (Oliveira
et al., 2006; Wang et al., 2009).
De acordo com o primeiro mecanismo, a análise de uma porção do genoma
humano demonstrou o surgimento dos microssatélites a partir da associação de
microssatélites com retrotransposons. Quando ocorre a retrotransposição, fragmentos de
DNA repetitivos (retrotransposons) podem ser inseridos nos cromossomos depois de serem
transcritos reversamente a partir de uma molécula de RNA (Nadir et al., 1996). Entretanto,
uma elevada densidade de elementos transponíveis nem sempre coincidi com uma elevada
densidade de microssátelites (Schlotterer, 2000).
O segundo mecanismo determina que a evolução dos microssatélites se dá
devido a uma taxa elevada de recombinação desigual na região que contém as repetições
microssatélites, ou seja, ocorre crossing-over entre cromossomos homólogos que estão
imperfeitamente pareados devido à grande quantidade de repetições. Assim, pode levar a
contrações e expansões de grande escala da matriz de repetição (Richard & Paques, 2000).
O mecanismo mutacional mais comumente aceito é o Slip Strand Mispairing
(SSM) o qual propõe que a evolução dos microssatélites ocorre devido ao deslizamento da
fita simples de DNA durante a replicação. Neste último modelo, durante a replicação do
DNA, o ―deslizamento‖ da DNA polimerase III ao longo da região de repetição pode
provocar a dissociação temporária da fita molde com a fita a ser recém-sintetizada e o
rápido realinhamento incorreto, permitindo erros de emparelhamento de base e a
continuação do alongamento da cadeia (Bhargava & Fuentes, 2010). As fitas de DNA
alinhadas incorretamente formam uma estrutura denominada ―loop‖, que pode ser
estabilizado por hairpin, arranjo quádruplo ou cruciforme dos filamentos de DNA (Xu et
al., 2000). Isto pode resultar em um aumento do número de repetições (adições) no alelo se
o erro ocorre na fita complementar ou em uma diminuição do número de repetições
(deleções) se o erro ocorrer na fita molde (Goldstein & Schlotterer, 1999; Oliveira et al.,
2006) (Figura 1).
20

Figura 1. Mecanismo de mutação slippage durante a replicação em uma região microssatélite. Adaptado de
Goldstein & Schlotterer, 1999.

Erros de SSM das fitas de DNA são corrigidos pelo sistema de reparo, assim a
estabilidade do microssatélite depende de um equilíbrio entre o ―deslizamento‖ durante a
replicação do DNA e a eficácia do sistema de reparo (Ellegren, 2000; Kalia et al., 2011).
Embora o processo ―slippage‖ durante a replicação favoreça tanto o aumento quanto a
diminuição da região microssatélite, há uma tendência para a expansão da região
microssatélite, enquanto que a mutação pontual quebra uma repetição longa em duas ou
mais sequências mais curtas, rearranjando a região repetitiva em uma mistura de
sequências únicas e trechos curtos repetitivos (Li et al., 2004). Assim, as mudanças na
relação das frequências de ―slippage‖ e mutações pontuais têm efeito direto sobre a
distribuição dos microssatélites em um genoma (Li et al., 2002). A estabilidade dos
microssatélites varia dentro e entre espécies, há altas taxas de mutação nos microssatélites
com maior número de repetições, devido à dificuldade do mecanismo de reparo reconhecer
erros SSM em repetições longas (Dettman & Taylor, 2004).
Os microssatélites são loco-específicos e possuem altos níveis de polimorfismo
devido aos mecanismos de mutação que afeta o número de repetições das regiões
microssatélites, são abundantes por todo o genoma, tanto em procariotos quanto em
eucariotos; apresentam padrão de herança co-dominante (Figura 2), variação multi-alélica
e alta reprodutibilidade (Duran et al., 2009). Tais características inerentes aos
microssatélites tornaram estas regiões potencialmente eficientes para desenvolvimento de
21

marcadores utilizados em mapeamento, testes de paternidade e estudos de genética de
populações (Schlötterer, 2004).

Figura 2. (A) Representa um genótipo homozigoto para uma região microssatélite. (B) Representa um
genótipo heterozigoto para uma região microssatélite. (C) Padrão co-dominante visualizado em gel de
eletroforese. Adaptado de Ferreira & Grattapaglia, 1995.

Os marcadores microssatélites são capazes de gerar informações relevantes
para a identificação de unidades de conservação e para a investigação sobre processos
genéticos que ocorrem em populações, como a diversidade genética de populações,
padrões de fluxo gênico, incidência de deriva genética e geração de vizinhança genética
(Heywood & Iriondo, 2003). Além disso, fornecem um número de vantagens sobre os
outros marcadores moleculares: (i) pequenas quantidades de DNA é necessária, (ii) vários
alelos microssatélites podem ser detectados em um único loco a partir de uma simples
PCR, (iii) a análise de detecção do alelo é passível de automatização e dimensionamento
(Schlötterer, 2000, Duran et al., 2009).
Embora existam todas estas vantagens, uma das limitações para se obter
marcadores microssatélites é o conhecimento prévio da sequência de DNA, pois há a
necessidade de isolador e desenvolver pares de primers específicos para cada região
microssatélite, a fim de delimitar cada loco microssatélite da espécie de interesse. Este é
um processo que demanda mão de obra qualificada e apresenta um custo relativamente
22

alto, porém, o benefício ocorre pela praticidade e reprodutibilidade na utilização deste
marcador que utiliza-se da técnica de PCR para avaliar o polimorfismo nos indivíduos e
populações (Caixeta et al., 2006). Além disso, uma vez desenvolvidos, estes marcadores
são potencialmente transferíveis para espécies filogeneticamente próximas, devido à
natureza homóloga da sequência de DNA nas regiões flanqueadoras dos microssatélites.
Sendo assim, como essas regiões são altamente conservadas entre táxons, isso possibilita a
amplificação cruzada entre espécies relacionadas (Varshney et al., 2005; Barbara et al.,
2007). A taxa de amplificação bem sucedida diminui à medida que a divergência genética
entre as espécies aumenta (Primmer & Merilä, 2002).

3.1.1.1 Desenvolvimento de microssatélites

Inicialmente proposta, a estratégia de desenvolvimento de marcadores
microssatélites mais tradicional consiste na construção de uma biblioteca genômica da
espécie de interesse, hibridização com sondas contendo repetições simples,
sequenciamento dos clones positivos e desenho dos pares de primers que flanqueiam a
região microssatélite (Rassmann et al. 1991; Caixeta et al., 2006). Em termos de tempo e
esforço esta estratégia apresenta um desafio técnico considerável e esta abordagem pode
vir a ser extremamente ineficiente para espécies com baixa frequências de microssatélites.Por isso, diversos protocolos alternativos foram desenvolvidos para reduzir o tempo
investido e aumentar significativamente o rendimento (Zane et al., 2002).
Diferentes metodologias baseadas na construção de bibliotecas enriquecidas
para microssatélites foram propostas. Estratégias baseadas na extensão de primers foram
descritas por Paetkau (1999) e Ostrander et al.(1992), resultando em uma eficiência na
obtenção de colônias positivas de 40-50% a até 100%, respectivamente. Estes protocolos
de extensão de primers envolvem a produção de uma biblioteca primária, no qual o DNA
genômico fragmentado é inserido em um vetor de fago a fim de obter um conjunto de
filamentos únicos de moléculas de DNA circulares, os quais serão utilizados como molde
para uma reação de extensão do primer preparado com oligonucleótidos específicos para
determinada repetição, assim apenas os vetores que contenham a repetição desejada gerará
produtos de fita dupla. Na etapa da produção da biblioteca primária, apenas uma parte
limitada do genoma investigado é clonado, o que resulta na perda de motivos de repetição
raros, além disso, o grande número de etapas realizadas limitou a popularização destes
métodos (Zane et al., 2002).
23

Outra classe de métodos de isolamento de microssatélites é a partir da
construção de bibliotecas enriquecidas baseadas na hibridização seletiva. Os protocolos
básicos como proposto por Karagyozov et al.(1993), Armour et al.(1994), Kijas et
al.(1994), são relativamente simples e extremamente populares. Todas as estratégias
consistem na hibridização de uma sequência sintética de um oligonucleotídeo de
microssatélite com o DNA genômico (Billotte et al., 1999). Primeiramente, os fragmentos
de DNA genômico são ligados a uma sequência conhecida (adaptadores), posteriormente
será hibridizado com uma sonda contendo repetições que pode ser vinculada a uma
membrana de nylon (Karagyozov et al., 1993; Armour et al., 1994) ou 5’ biotinilado
revestido de estreptavidina (Kandpal et al., 1994 , Kijas et al., 1994, Billotte et al.,
1999)(Figura 3), seguida uma série de lavagens o DNA enriquecido é recuperado por PCR
e clonado em um vetor adequado, para que finalmente possa ocorrer o sequenciamento dos
clones positivos e obtenção das sequências para identificação das regiões microssatélites
(Zane et al., 2002).

Figura 3. Protocolo do isolamento de microssatélites a partir de seleção por hibridização com
oligonucleotídeos 5’ biotinilados e revestido de estreptavidina (Kandpal et al., 1994 , Kijas et al., 1994,
Billotte et al., 1999). Adaptado de Zane et al., 2002.
24

Outra metodologia é a obtenção de marcadores microssatélites a partir de
bibliotecas de cDNA. Neste método, a diferença crucial é que para a produção da
biblioteca são utilizadas sequências de mRNA, a partir de um conjunto de genes expressos
em uma amostra de um determinado organismo. Portanto, os marcadores microssatélites
desenvolvidos por esta metodologia são gênicos, ou seja, estão presentes em sequências
transcritas (ESTs-SSR) (Blair & Hurtado, 2013).
Para evitar a construção das bibliotecas genômicas ou de cDNA, uma
metodologia alternativa para o desenvolvimento de marcadores microssatélites é buscar
sequências em bancos de dados tais como EMBL and GenBank, utilizando recursos
computacionais (Morgante & Olivieri, 1993; Kalia et al., 2011). Uma limitação é que a
maioria das sequências disponíveis nos bancos de dados são sequências transcritas (ESTs).
Estas sequências, então, podem ser verificadas quanto à identificação de microssatélites a
partir de programas computacionais, os quais são geralmente referidos como
microssatélites gênicos ou EST-SSRs (Varshney et al., 2005). A desvantagem deste
método é que a obtenção dos marcadores é limitada às espécies que possuem sequências
suficientes disponibilizadas nos bancos de dados, que geralmente são poucas para a
maioria das espécies de plantas silvestres (Cardle et al.,2000; Hu et al., 2004).
A partir de 2005, surgiram novas tecnologias de sequenciamento de DNA
denominadas de sequenciamento de nova geração (NGS), suas plataformas geram
informação sobre milhões de pares de bases em uma única corrida (Mardis, 2008). Assim,
permite sequenciamento de genomas e transcriptomas (RNA-seq), o que propicia uma
aplicação com ampla utilidade que é a rápida identificação de marcadores moleculares,
como os SNPs e os microssatélites (Perry & Rowe 2011). Zheng e colaboradores (2013)
relataram o desenvolvimento de 205 marcadores microssatélites em duas espécies de
Amorphophallus usando sequências de transcriptomas geradas por NGS.
Posteriormente à obtenção das sequências do genoma de interesse necessita-se
ainda: (i) identificar regiões microssatélites únicas nas sequências obtidas dos clones
positivos ou de sequências encontradas em bancos de dados ou de sequências geradas por
NGS; (ii) desenhar pares de primers específicos em regiões adequadas; (iii) otimizar o
protocolo de PCR para a obtenção de produto de PCR referente a cada loco microssatélite;
(iv) analisar os padrões das bandas e dos produtos de PCR com relação ao polimorfismo
para validação das regiões microssatélites como marcadores moleculares (Roder et al.,
1998; Semagn et al., 2006).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Blair%20MW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23590131
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hurtado%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23590131
25

Uma metodologia alternativa ao desenvolvimento de novos marcadores
microssatélites muito importante é a transferibilidade. Muitos estudos mostraram que os
pares de primers desenhados para uma espécie podem ser utilizados para outras espécies
do mesmo gênero (Cipriani et al, 1999; Barbara et al., 2007), ou de uma mesma família
(Roa et al., 2000; Zucchi et al, 2002; Barbara et al., 2007), devido a conservação das
regiões flanqueadoras entre espécies relacionadas. Esta característica das regiões
microssatélites permite a amplificação heteróloga dos primers e, portanto, a
transferibilidade entre espécies. A transferibilidade pode reduzir os custos quando o grupo
de pesquisa trabalha com um conjunto de espécies relacionadas. Tanto marcadores
microssatélites gênicos e genômicos podem ser transferidos entre as espécies, no entanto,
espera-se que marcadores microssatélites gênicos apresentem uma alta taxa de
transferência devido à conservação das regiões transcritas entre as espécies relacionadas
(Varshney et al., 2005, Ellis & Burke 2007; Kalia et al., 2011).

3.2 ESPÉCIES DO GÊNERO Byrsonima NO CERRADO

O bioma Cerrado é uma savana tropical (Klink& Machado, 2005), constituindo
um complexo vegetacional composto por tipos fitofisionômicos distintos. Os cinco
principais tipos estruturais do cerrado são reconhecidos por botânicos como: Cerradão, um
tipo de floresta densa (8-15 m de altura), que muitas vezes apresenta um dossel
completamente fechado; Cerrado sensu stricto, apresenta bosques (5-8 m de altura) com
mata fechada e árvores mais espalhadas que no Cerradão; Campo Cerrado, um Cerrado
aberto (3-6 m de altura) com poucas árvores; Campo sujo, pastagens (2-3 m de altura) com
arbustos dispersos; e por fim, Campo limpo, pastagem apresentando alguns arbustos ou
nenhum, ou plantas lenhosas mais altas (Silva & Bates, 2002).
Uma rica biodiversidade é encontrada no Cerrado, estimada em 160 mil
espécies de plantas, fungos e animais. Há cerca de 800 espécies de árvores e arbustos de
grande porte e várias vezes esse número de espécies terrestres (ervas e subarbustos). De
ampla ocorrência no Cerrado, a família Malpighiaceae apresenta 66 gêneros e 1200
espécies, com distribuição tropical e subtropical (Souza & Lorenzi, 2008). No Brasil,
ocorrem 32 gêneros e aproximadamente 300 espécies (Barroso et al., 1991).
A família Malpighiaceae é composta por árvores, arbustos, lianas e ervas
perenes.Suas flores apresentam uma organização uniforme na família, são vistosas de
coloração amarelada ou rosada, compostas por cinco sépalas, hermafroditas, reunidas em
26

inflorescências de posição axilar ou terminal (Joly, 2002). Possuem antese diurna e alta
viabilidade polínica (Sigrist & Sazima 2004, Costa et al., 2006). Esta família apresenta
como uma característica primordial a presença de nectários extraflorais dispostos aos pares
na base das sépalas, em quase todas as espécies. A estratégia de recompensa floral aos
visitantes aplica à suas flores, que são polinizadas por abelhas, principalmente fêmeas da
família Apidae, visto que utilizam o óleo produzido pelas glândulas presente no cálice, os
elaióforos (Peixoto et al., 2011).
Byrsonima Rich. está entre os maiores gêneros da família Malpighiaceae.
Constitui mais de 150 espécies, distribuídas ao longo do México, difundindo-se por toda
América do Sul (Aguiar, 2005). Apresenta cerca de 70 espécies presentes no Brasil (Flinte
et al., 2003), com ampla distribuição no Cerrado sensu stricto e Campos Cerrados
(Garritano et al., 2006). No Brasil, as espécies do gênero Byrsonima Rich. são
popularmente conhecidas como ―murici‖ (Figura 4), com diversas variações, tais como
―murici-cascudo‖, ―murici-pequeno‖ ou ―murici-vermelho‖ (Sannomyia et al., 2005).

Figura 4. (A) Árvore pertencente ao complexo Byrsonima sp. (murici). (B) Folhas coriáceas e pilosas de 14 a
20 cm de comprimento presentes no complexo de espécies de murici. (Fonte:
http://4.bp.blogspot.com/_DzmJnyxWMz8/TSYMVFdTO6I/AAAAAAAAAA0/dmUuetXcC08/s1600/muric
i+arvore.jpg).

O murici é caracterizado como uma árvore ou arbusto hermafrodita ramificado,
com ramos ascendentes e eretos, com base lenhosa, de 1-6m de altura, apresenta tronco
frequentemente tortuoso. Suas folhas são coriáceas e pilosas em ambas as faces, medindo
de 14-20 cm de comprimento. Apresenta inflorescência racemo terminal, constituída por
flores de corola amarela ou alaranjada após polinização, com glândulas visíveis no cálice,
27

possuindo de 5 a 10 cm de comprimento (Figura 5). A floração ocorre entre agosto e
dezembro em áreas de Cerrado (Silva Júnior, 2005). Os frutos apresentam até 2 cm de
diâmetro, drupa globosa, polpa suculenta e adocicada, cor amarela na maturação e podem
apresentar de uma a três sementes por fruto. As sementes, por sua vez, possuem 0,5 cm de
diâmetro (Garritano et al., 2006; Peixoto et al., 2011). A frutificação ocorre entre outubro e
fevereiro em áreas de Cerrado (Silva Júnior, 2005).

Figura 5. (A) Inflorescência de Byrsonima sp. com glândulas visíveis nos cálices. (B) Flores de corola
amarela ou alaranjada após a polinização. (C) Inflorescências racemo terminal de Byrsonima sp. (Fonte:
http://www.flickr.com/photos/ marlene_monteiro/ 4537978971/ lightbox/;http://www.flickr.com/ photos/mercadanteweb/ 8289008291/ ;
http://noticias.uol.com.br /album/ 110921arvorescentenarias _album.htm).

A espécie Byrsonima cydoniifolia é classificada como brevidecídua, com queda
foliar na estação da seca (julho-setembro) e brotamento de folhas jovens de setembro a
outubro. Ocorre em campos inundáveis na Bolívia, Amazônia e no Brasil Central (Pott &
Pott, 1994), exclusivamente em solos arenosos, colonizam beiras de estradas e áreas
desmatadas, capões, Campos-Cerrados inundáveis ou não, formando os canjiqueirais (Pott
& Pott 1994, Silva et al., 2000, Marimon & Lima 2001, Silvério & Fernandes-Bulhão
2009). Já a espécie Byrsonima crassifolia é comumente encontrada em savanas e pastos,
geralmente cresce em solos estéreis da seca para lugares muito úmidos (Holdridge, 1970).
Quanto à biologia reprodutiva das espécies do gênero Byrsonima Rich,
possuem sistema reprodutivo misto, apresentam sistemas de fecundação cruzada e
autofecundação com diferentes graus de compatibilidade entre suas espécies (Mendes et
al., 2001; Garritano et al., 2006). Em Byrsonima coccolobifolia (Benezar & Pessoni,
2006), B. rotunda (Mendes et al., 2001) e B. verbascifolia foi identificado níveis elevados
de alogamia e autogamia, demonstrando autocompatibilidade. Enquanto que em um estudo
28

envolvendo outras sete espécies do gênero Byrsonima Rich. relataram ―certo grau de
autocompatibilidade‖, com percentuais de frutificação por autopolinização variando entre
5,2% a 16,3% (Barros, 1992). Já espécies como Byrsonima crassifolia (Rêgo &
Albuquerque 1989), B. sericea (Teixeira & Machado 2000, Costa et al., 2006) e B.
microphylla foram consideradas auto-incompatíveis (Costa et al., 2006).
Os principais vetores de polinização são abelhas (figura 2) de médio e grande
porte dos gêneros: Centris, Epicharis e Bombus, responsáveis pela coleta de pólen e óleo.
Além de abelhas pequenas dos gêneros Trigonal, Apis, Augochloropsis, Tetragona,
Paratetrapedia e outros (Barros, 1992). A propagação de Byrsonima sp. se dá por
sementes contidas nos pirênios, os quais são constituídos pelo conjunto do endocarpo
pétreo resistente e as sementes (Figura 6). Segundo consta na literatura, a germinação de
algumas das espécies do gênero Byrsonima é lenta e acentuadamente desuniforme
(Lorenzi, 2002; Donadio et al., 2004; Nogueira et al., 2004; Carvalho et al., 2006;
Carvalho & Nascimento, 2008). Animais silvestres, tais como pássaros, roedores, tatus e
canídeos, funcionam como dispersores naturais das suas sementes, visto que o fruto do
murici é fonte de alimento para estes animais (Garritano et al., 2006).

Figura 6. (A) Frutos imaturos de murici contendo até 2 cm de diâmetro. (B) Sementes contendo 0,5 cm de
diâmetro. (C) Frutos maturos de Byrsonima sp. apresentam colocaração amarela. (Fonte:
http://www.flickr.com/photos/adilson2010/5215514743/in/pool639490@N20/;http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/murici/imagen
s/murici-2.jpg; http://www.tyba.com.br/portugues/min).

O murici é uma planta apícola e pode ser utilizada como ornamental e em
reflorestamento de áreas degradadas (Donadio et al., 2004). Demonstram tolerância aos
efeitos de incêndios, logo após as queimadas em uma área de Cerrado sensu stricto
29

membros do gênero Byrsonima Rich. são um dos primeiros a florescer. Isso ocorre devido
à presença de folhas densamente pilosas agrupadas no ápice dos ramos que protegem as
gemas apicais (Fielder et al., 2004).
As espécies do gênero Byrsonima Rich. apresentam múltiplas potencialidades.
Seus frutos são comestíveis podendo ser consumidos ao natural, como doces, sucos,
licores, geléias, pudins, pavês e sorvetes (Garritano et al., 2006). O óleo extraído da
semente é utilizado pela indústria alimentícia e farmacêutica (Sannomiya et al., 2005). A
planta é utilizada como forrageira, em épocas de falta de pasto, e a madeira é usada em
serviços de marcenaria, celulose, lenha e carvão (Pott & Pott, 1994; Garritano et al., 2006).
A casca do caule e as folhas são adstringentes empregadas na medicina popular como
antiasmáticas, antitérmicas, no tratamento de infecções de pele (Caceres, et al., 1993), no
tratamento de desordens gastrointestinais, contra tuberculose, bem como para picada de
cobra e bronquite (Pott & Pott, 1994, Rastrelli et al., 1997). Em estudos experimentais
relataram atividade antiprotozoária e antiinflamatória (Guilhon-Simplicio et al., 2012).
A exploração do murici ocorre de forma extrativista em agrupamentos nativos
(Souza et al., 2003) e, esporadicamente, é cultivado em pomares domésticos (Lorenzi,
2002). Apesar dessa espécie não ser domesticada, sua exploração econômica pode ser
viável, visto que é um complexo de espécies com elevado potencial de utilização e de fácil
cultivo, sem requerer elevados cuidados nos tratos culturais (Chaves & Naves, 1998;
Naves, 1999; Garritano et al., 2006).

3.3 DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO DE MARCADORES
MICROSSATÉLITES PARA ESPÉCIES NATIVAS DO
CERRADO

O primeiro estudo publicado utilizando microssatélite emespécies vegetais foi
realizado por Condit e Hubbell (1991), neste trabalho foi descrita a alta abundância de
regiões microssatélites do tipo dinucleotídeos em genomas de plantas e sugere que estas
regiões poderiam fornecer um grande número de marcadores polimórficos para estudos de
genética de populações de plantas.
Os parâmetros genéticos populacionais gerados a partir dos marcadores
microssatélites podem ter diversas aplicações. Estes parâmetros gerados podem auxiliar na
discriminação entre acessos e cultivares de bancos de germoplasma, detectando
30

duplicações, mistura de sementes, cruzamentos não controlados e deriva genética; dessa
forma uma das aplicações seria para a domesticação da espécie e sua utilização econômica
(Garritano et al., 2006). Estes parâmetros também podem ser úteis em estudos para
determinar áreas de conservações de espécies, pois permitem a identificação de diferentes
magnitudes de variabilidade genética dentro das populações, ou seja, permite a
compreensão da estrutura genética ou da divisão da variação entre indivíduos, populações
e espécie (Collevati et al., 2001), portanto, de acordo com os parâmetros previamente
verificados, pode se admitir diferentes estratégias para a conservação in situ ou ex situ
(Avise & Hamrick 1996). Além disso, estes paramtros podem ser utilizados na
determinação do grau de parentesco entre indivíduos e na construção de mapas genéticos
(Akkaya et al., 1995; Cregan et al., 1999).
No Brasil, estudos relacionados com o desenvolvimento e o uso de marcadores
microssatélites em plantas possuem aproximadamente apenas duas décadas e
primeiramente foi empregado em estudos de espécies florestais como Ceiba pentandra
(Brondani et al., 2003), Swietenia macrophylla (Lemes et al., 2002), Araucaria
angustifolia (Schmidt et al., 2007), Copaifera langsdorffi (Martins et al., 2008), Eugenia
uniflora (Ferreira-Ramos et al., 2008), e cultivada Oryza glumaepatula (Vaz et al., 2009).
Também estes marcadores já foram empregados em estudos de espécies do
Cerrado, Caryocar brasiliensis (Collevatii et al., 1999), Anemopaegma arvense (Bastini et
al., 2009), Tabebuia aurea (Braga et al., 2007), Hymenaea courbaril (Ciampi et al. 2008),
entretanto a maioria dos relatos são mais recentes, Lychnophora ericoides (Rabelo et al.,
2011), Tibouchina papyrus (Telles et al., 2011), Dipteryx alata (Soares et al., 2012),
Anacardium humile (Soares et al., 2013) e Eugenia dysenterica (Telles et al., 2013).
Visando estudos genéticos populacionais para a espécie do Cerrado B.
cydoniifolia, torna-se importante o desenvolvimento de pares primers para as regiões
microssatélites da espécie.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 MATERIAL BIOLÓGICO

Um total de amostras de 90 indivíduos da espécie Byrsonima cydoniifolia
foram coletadas na região do Médio Araguaia, provenientes de três populações naturais
com ocorrência nos municípios de Barra do Garças (MT), Araguaiana (MT) e Bom Jardim
(GO). Além disso, amostras de tecido foliar de uma população de 24 indivíduos da espécie
Byrsonima crassifolia foram coletados no município de Silvânia (GO). Os pontos de coleta
(Figura 7) das espécies Byrsonima cydoniifolia e Byrsonima crassifolia foram
georeferenciadas por um GPS (Global Position System), conforme descrito na tabela 2.

Figura 7. Pontos de coleta específicos das espécies Byrsonima cydoniifolia e Byrsonima crassifolia. Fonte:
species Link. Disponível em: http://splink.cria.org.br/.

Tabela 2. Localização das populações naturais de Byrsonima cydoniifoliae Byrsonima crassifolia.
Espécie Pop. Estado Município Coordenadas
B.cydoniifolia
1
MT
Barra do Garças W 52°16'50,3" S 15°30'20,6"
2 Araguaiana W 51°44'19" S 14°41'48,1"
3 GO Bom Jardim W 52°02'23,5" S 16°16'41,6"
B. crassifolia 1 GO Silvânia W 48°13'12,9'' S 16°43'6,8''

4.2 EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA

As amostras de tecido foliar foram acondicionadas em papel alumínio, sacos
plásticos, identificadas e transportadas em caixas com gelo. O tecido foliar de todos os
indivíduos foi utilizado para extração de DNA no Laboratório de Genética &
Biodiversidade (LGBio), localizado no Instituto de Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Goiás, campus Samambaia.
O DNA total de todos os indivíduos coletados (90 indivíduos de B. cydoniifolia
e 24 indivíduos de B. crassifolia) foi extraído a partir de amostras de tecido foliar em
duplicata seguindo o protocolo CTAB (brometo de cetil-trimetil amônio) descrito por
Doyle & Doyle (1987) otimizado para o tempo de maceração automática de 40 segundos
para ambas as espécies Byrsonima cydoniifolia e Byrsonima crassifolia.
A verificação da qualidade e quantificação do DNA extraído foi realizada em
gel de agarose 1% corado com brometo de etídio (10mg/mL) e tampão para eletroforese
TBE (Tris Borato-EDTA) na concentração 1x, utilizando o marcador de massa molecular
DNA de fago Lambda (λ) a uma concentração conhecida. Posteriormente, o gel foi
visualizado com luz ultravioleta/366 nm através de um trans-iluminador UV, fotografado
por fotodocumentador, seguindo a quantificação visual de cada amostra. A diluição do
DNA foi realizada com água ultrapura. Para realizar o desenvolvimento de marcadores
microssatélites, o DNA genômico total de um único indivíduo de B. cydoniifolia foi
diluído para uma concentração final de 250 ng de DNA genômico por µl. Para a
padronização das reações de PCR, a fim de caracterizar os locos microssatélites e testar a
transferibilidade, o DNA e cada um dos 90 indivíduos de B. cydoniifolia e dos 24
indivíduos de B. crassifolia foram diluídos a uma concentração de 2,5 ng/µL.

4.3 CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS GENÔMICAS
ENRIQUECIDAS COM MICROSSATÉLITES

O desenvolvimento de marcadores microssatélites foi realizado a partir da
construção de uma biblioteca genômica enriquecida utilizando o protocolo descrito por
Billote et al., (1999). O protocolo detalhado encontra-se no Anexos. Todo o procedimento
de construção das bibliotecas genômicas enriquecidas com microssatélites foi efetuado no
33

Laboratório de Análise Genética e Molecular (CBMEG), pertencente à Universidade
Estadual de Campinas, Campinas, SP.
Para a construção das bibliotecas enriquecidas com microssatélites, após a
extração do DNA, procedeu-se a disgestão do DNA genômico total de um único indíviduo
de Byrsonima cydoniifolia, com a enzima de restrição de corte freqüente AfaI (Promega)
antiga RsaI (Invitrogen), em seguida ocorreu a ligação de adaptadores, visando um
terminação comum e uma pré-amplificação via PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
obtenção de uma maior quantidade de fragmentos. A purificação do produto de PCR foi
realizada utilizando o kit ―QIAquick PCR purification kit‖ (QIAGEN cat. # 28106),
conforme as instruções do fabricante e a seleção dos fragmentos contendo sequências
microssatélites ocorreu por meio de sondas específicas para dois motivos de
microssatélites com repetições de dinucleotídios em tandem (CT)8 e (GT)8, ligados
quimicamente à proteína biotina (biotIIIII(CT)8 e biotIIIII (GT)8), respectivamente; e
beads magnéticas (Promega) recobertas pela proteína estreptavidina. Os fragmentos
selecionados foram amplificados via PCR para gerar fragmentos de fita dupla em maior
quantidade, foram ligados a um vetor de clonagem pGEM-T (kit Vector System -
Promega) e células competentes de Escherichia coli (cepa XL1-Blue) foram transformadas
com os vetores contendo o inserto. Os clones positivos foram selecionados e armazenados.
A biblioteca genômica foi estocada em freezer (-80°C) até a extração do DNA plasmidial
das colônias recombinantes para a etapa seguinte de sequenciamento no sentido sense e
anti-sense realizado no analisador automático de DNA modelo ABI-3500 (Applied
Biosystems).
As sequências obtidas foram editadas, retirando os trechosrelativos ao vetor e
adaptador, a partir do programa CHROMAS (disponível em:
http://www.mybiosoftware.com/sequence-analysis/1979). Posteriormente, as sequências
foram transformadas em formato ―FASTA‖ pelo programa CHOMATOGRAM Explorer
(disponível em: http://www.dnabaser.com/download/chromatogram-explorer/) e as
sequências sense e anti-sense foram agrupadas em uma sequência consenso a partir do
programa CAP3 (disponível em: http://doua.prabi.fr/software/cap3).
Posteriormente, cada sequência consenso foi submetida à ferramenta
Vecscreen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/) disponibilizada pelo GenBank
(htt://www.ncbi.nlm.nih.gov). Esta ferramenta permite localizar rapidamente os segmentos
de uma nova sequência que podem ser compatíveis com sequência de vetores depositadas
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/
34

no GenBank. Assim, as sequências que apresentaram identidade com a sequência do vetor
foram excluídas da busca por microssatélites.

4.4 BUSCA DE REGIÕES MICROSSATÉLITES E DESENHO DOS
PRIMERS

A busca por regiões microssatélites nas sequências obtidas foi realizada pelo
programa WebSat (disponível em: http://wsmartins.net/websat/). Os parâmetros utilizados
para realizar a busca foram: preferencialmente regiões microssatélites de dinucleotídeos
com no mínimo sete repetições, posteriormente trinucleotídeos com no mínimo quatro
repetições e tetranucleotídeos, pentanucleotídeos e hexanucleotídeos com no mínimo três
repetições.
O desenho dos pares de primers que flanqueiam as regiões microssatélites foi
realizado usando o software Primer3 (Rozen & Skaletsky, 2000), disponível em:
http://frodo.wi.mit.edu/. Os parâmetros foram configurados para a obtenção de primers
cujo produto final da amplificação estivesse no intervalo de 150 a 220pb; o tamanho dos
primers entre 18 e 22pb, a diferença de temperatura de melting (Tm) entre os pares de
primers não deveria passar de 3°C e a porcentagem de CG estar no intervalo entre 40 e
60%. Também foi avaliada a complementaridade das sequências dos primers em função da
formação de dímeros na extremidade 3’OH, bem como para a formação de estruturas
secundárias dentro dos iniciadores.
As sequências cuja região microssatélite apresentava menos de 30 bases de
distância de uma das extremidades foram excluídas e sequências com microssatélites
compostos imperfeitos que possuíam mais de 40 bases de distância de uma região
microssatélite da outra, privilegiou a realização do desenho de primers para apenas uma
das sequências microssatélites, a região de maior número de repetições.

http://wsmartins.net/websat/
http://frodo.wi.mit.edu/
35

4.5 PADRONIZAÇÃO DOS PRIMERS DE REGIÕES
MICROSSATÉLITES

4.5.1 Amplificação dos fragmentos de DNA

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada para a amplificação de
cada loco microssatélite de DNA utilizando todos os pares de primers desenvolvidos para a
espécie Byrsonima cydoniifolia em termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied
Biosystems).
Primeiramente, os pares de primers locos-específicos sintetizados foram
testados em reações de PCR com diferentes temperaturas de anelamento, utilizando-se três
indivíduos da espécie Byrsonima cydoniifolia para analisar a eficiência da amplificação de
cada loco microssatélite isolado.
As condições para a preparação de cada reação de PCR seguiu o protocolo
abaixo (Tabela 3), o qual poderia ter temperaturas de anelamento ajustadas, visando
diminuir amplificações inespecíficas. A amplificação dos fragmentos de DNA seguiu as
seguintes etapas: (1) desnaturação a 95°C durante 5 minutos, (2) desnaturação a 94°C
durante 30 segundos; (3) temperatura específica de anelamento do par de primer ao
fragmento de DNA durante 1 minuto (específico para cada par de primer), (4) extensão da
molécula Taq polimerase a 72°C por 1 minuto, (5) extensão a 72°C durante 30 minutos. As
etapas 2 a 4 seguiram 35 ciclos.

Tabela 3. Protocolo para reação de PCR para um indivíduo da espécie Byrsonima cydoniifolia.
Reagentes Concentração Volume (µL) Concentraçãofinal
H2O ultrapuraultrapura: - 4,7 -
DNA : 2,5ng/µL 2 5ng
Primer (F+R) : 0,9µM 4 0,24 µM
Tampão da enzima c/ MgCl2 : 10X 1,5 1x
BSA : 25mg/ml 1,3 2,16mg
dNTP’s : 2,5µM 1,3 0,216µM
Taq-polimerase : 5 U 0,2 1 U
TOTAL - 15 -

Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 3%
com tampão TBE 1X, por 60 minutos a uma voltagem de 70V, seguindo uma coloração
com brometo de etídeo (10mg/mL). Para verificar o tamanho dos produtos amplificados,
36

cada banda foi avaliada de forma comparativa com o marcador de massa molecular 100 pb.
Neste passo, foram identificados os locos microssatélites que apresentaram produtos de
PCR, que seguiram para a próxima etapa, em gel de poliacrilamida para detecção de
polimorfismo.
A fim de visualizar com mais precisão a amplificação de cada loco
microssatélite realizada na etapa anterior, os amplicons foram submetidos à eletroforese
vertical em gel desnaturante de poliacrilamida 6% por cerca de 2 horas a 70W, seguido do
sistema de coloração por nitrato de prata, como proposto por Creste et al., (2001). O
tamanho de cada alelo foi determinado por comparação com marcador de massa molecular
DNA Ladder 10 pb (Invitrogen). A visualização dos géis realizada logo após a secagem,
sobre luz branca, permitiu a identificação dos genótipos e posteriormente os géis foram
escaneados para documentação dos resultados. Os locos microssatélites que não
apresentaram polimorfismo dentre os 3 indivíduos foram novamente submetidos a uma
nova PCR e testados em uma amostragem maior de 16 indivíduos. Assim, os locos
microssatélites que não apresentaram polimorfismo dentro da amostragem de 16
indivíduos foram descartados das análises. Todas as sequências das regiões micossatélites
em que o desenho dos pares de primers proporcionaram amplificações foram depositadas
no banco de dados GenBank para que outros pesquisadores possam ter o acesso.

4.5.2 Desenvolvimento de multiplex de eletroforese para
obtenção de genótipos

Para a obtenção dos genótipos em eletroforese capilar, no analisador
automático de DNA modelo ABI-3500 (Applied Biosystems), por meio da detecção por
fluorescência, o primer forward de cada loco foi marcado em sua extremidade 5’, com um
dos fluoróforos descritos a seguir: verde (HEX), azul (6-FAM) e amarelo (NED).
A concentração de cada par de primer e a temperatura foram novamente
padronizadas para cada loco utilizando quatro indivíduos de B. cydoniifolia. O protocolo
de reação de PCR otimizado para os locos microssatélites foi descrito abaixo (Tabela 4).

Tabela 4. Protocolo de reação de PCR otimizado para genotipagem.
Reagentes Concentração Volume (µL) Concentração final
H2O ultrapura: - 2,55 -
DNA : 2,5ng/µL 1,5 3,75ng
Primer (F+R) : 0,9µM 2,6 0,23µM
Tampão da enzima c/ MgCl2 : 10X 1,0 1x
BSA (bovine serum albumin) : 25mg/ml 1,3 3,25mg
dNTP’s : 2,5µM 0,9 0,23µM
Taq-polimerase : 5 U/ µL 0,15 0,75 U
TOTAL - 10

Os locos microssatélites que apresentaram ausência de amplificação
inespecífica foram considerados com um bom padrão na eletroforese capilar e foram
utilizados para a montagem de painéis multiplex de eletroforese. Para tanto, os locos que
apresentam alelos na mesma amplitude de tamanho foram marcados com fluorescências
diferentes, enquanto os que apresentaram alelos de tamanhos diferentes, no mínimo 10 pb,
foram marcados com a mesma fluorescência, permitindo combinações dos mesmos em
painéis multiplex.
Após a realização da eletroforese capilar, a obtenção dos genótipos foi
realizada com o auxílio do programa GeneMapper 3.5 (Applied Biosystems) para permitir a
identificação automática dos alelos, utilizando uma janela de detecção (bin) para
determinar o tamanho