FOFATASE ALCALINA

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Enzimologia 2018/2019
	Universidade da Madeira 
Licenciatura em Bioquímica 
Enzimologia 2018/2019
Profª. Drª. Carla Lopes
	Fosfatase alcalina EC 3.1.3.1
	
Luís Miguel da Silva Pais nº2022518
Funchal, 26 de abril de 2019
Índice
Resumo:	3
Introdução:	3
Descrição:	5
Nomenclatura científica	5
Isoenzimas da Fosfatase alcalina	6
Estrutura da Fosfatase alcalina	9
Conclusão	11
Referencias:	12
Resumo:
Houve um aprofundamento do conhecimento das enzimas nos tempos recentes no que respeita a características estruturais e também funcionais. A Fosfatase alcalina (ALP) é uma glicoproteína dimérica que catalisa reações de hidrólise de monoésteres de fosfato a valores ótimos de pH’s básicos, encontrando-se geralmente na superfície celular ligada à membrana plasmática. A ALP tem quatro isoenzimas, sendo três delas tecido específicas (placentária, intestinal e de células germinativas) e uma tecido não especifica que pode ser dividida consoante o órgão ou tecido onde é sintetizada (osso, rim e fígado). Esta enzima pode ser útil no diagnostico de doenças hepáticas, ósseas e renais através da deteção de alterações da sua concentração na corrente sanguínea.
Introdução:
As enzimas são catalizadores biológicos de alta especificidade, possuem natureza proteíca e aumentam a velocidade das reações quimicas através da diminuição da energia de ativação. 
Todas as enzimas apresentam aspectos estruturais e funcionais, independentemente da reação que irão catalisar. As enzimas são proteínas e contêm um local funcional que se designa por centro activo, onde os substratos são convertidos em produtos. As enzimas são constituidas por duas partes ou dois constituintes diferentes: a parte proteica (apoenzima) e parte não-proteica (cofactor).
 Há caracteristicas especificas quando uma reação é catalisada por uma enzima, como por exemplo, cinética de saturação, suscetibilidade a inibição, suscetibilidade a inativação quimica, especificidade e velocidade de reação.
As enzimas classificam-se consoante o tipo de reação que catalisam, dividindo-se em sete subclasses: oxirredutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases, ligases e translocases. Com o desenvolvimento da bioquímica fortaleceu-se a ideia de que dentro dos seres vivos, existiam substâncias capazes de catalisar de modo especifico determinadas reações químicas. 
Uma enzima é um catalisador biológico, que mesmo em baixas concentrações aumenta a velocidade da reação. As enzimas diminuem a energia de ativação, mas não afectam o equilíbrio da reação. Na Figura 1 pode-se observar como é que uma reação evolui na presença e na ausencia de uma enzima e como a energia de ativação é influeciada.
Figura 1-Esquema de reação catalisada com enzima e sem enzima e respetivas energias de ativação.
Para que uma reação química aconteça, as moléculas que vão reagir necessitam de alcançar um estado energético maior que o seu estado habitual (estado de transição). A energia necessária para elevar o nível energético dos reagentes até esse estado de transição é chamada de energia de ativação. Quando há presença de um catalisador, os reagentes atingem o estado de transição num nível energético inferior àquele que atingiriam na ausencia de catalisador. O gasto energético da reação é, portanto, menor na presença de catalisaor. A presença de um catalisador aumenta a velocidade de uma reação quimica porque diminui a energia de ativação e desta forma, os reagentes atingem mais facilmente o estado de transição. Quando se formam os produtos da reação, o catalisador deixa de ser necessário e fica disponivel para poder catalisar novas reações. A reação que é catalisada por uma enzima utiliza a mesma quantidade de substrato e produz a mesma quantidade de produto que uma reação que não foi catalisada. Isto é, as enzimas não alteram o equilibrio da reação entre o substrato e o produto. 
Figura 2-Esquema de uma reação enzimática
No decorrer deste trabalho, terei como foco a enzima Fofatase alcalina (EC 3.1.3.1). 
Descrição:
A Fofatase alcalina (ALP), também designada por fosfomonoesterase alcalina, glicerofosfatase ou fosfohidrolase alaclina , é uma glicoproteína dimérica (cada monómero com 484 resíduos) que catalisa a hidrólise de monoésteres fosfatados em meio alcalino, libertando fofato inorgânico. Encontram-se geralmente na superficie celular, ligadas á membrana plasmática. A ALP tem como co-factores o Zinco (Zn2+) e o Magnesio (Mg2+), ligados ao centro catalítico da enzima.
Figura 3- Reação de hidrólise de um monoéster de fosfato
Nomenclatura científica
 Fosfatase alcalina (EC 3.1.3.1); 
3. O primeiro número alfanumérico refere-se á classe da enzima e refere o tipo de reação que esta intervem.Neste caso, indica-nos que a enzima pertence a classe das hidrolases. 
3.1. O segundo numero está associado a subclasse e indica as ligações modificadas na hidrólise . O número alfanumérico 1 indica-nos que a enzima faz a rotura hidrolitica da ligação química éster.
3.1.3. Caracteriza o tipo de reação e identifica grupos envolvidos. Hidrólise de monoésteres fosfóricos.
3.1.3.1 Fosfatase alcalina
A Fosfatase alcalina está presente na grande maioria dos seres vivos e em muitos tecidos do organismo. A ALP está dividida em quatro isoenzimas maioritárias consoante o sítio onde é expressa, ALP placentária (PLALP); ALP intestinal (IALP); ALP de células germinativas (GCALP) e Fosfatase tecidual não específica, fígado, osso e rim (LALP, BALP e KALP). Os locus da ALP placentária e intestinal estão localizados no cromossoma 2 enquanto os locus da L/B e KALP estão situados no cromossoma 1.
Isoenzimas da Fosfatase alcalina 
Como referido anteriormente, as isoformas da Fosfatase alcalina são diferenciadas consoante o orgão de onde são sintetizadas. Focando-nos um pouco na espécie humana, podem ser classificadas quarto isformas maioritárias. São encontrados níveis totais desta enzima no sangue que variam consoante o género e idade do individuo. Uma quantidade/concentração anormal da enzima no sangue pode ser indicativa de uma doença, mas antes temos que saber a proveniencia da enzima ou a isoforma que provocou tal aumento. Usualmente um aumento da concentraçao de ALP total no sangue esta associada à LALP ou à BLALP e poderá ser indicativo de uma doença hepática ou óssea.
Fofatase alcalina placentaria 
A ALP placentária humana foi detetada/mapeada no cromossoma 2 por hibridização ´´in situ``. A PLALP é uma enzima termoestável encontrada em maiores concentrações na placenta mas tambem está presente no sangue. A PLALP é uma enzima polimórfica, ao contrário das outras isoformas, com mais de dezoito alelo-enzimas resultantes de mutações pontuais. Os niveis desta enzima podem aumentar, por exemplo, durante a gravidez.
Fosfatase alcalina intestinal 
 A ALP intestinal é uma proteína endógena expressa pelo epitélio intestinal. Acredita-se que a enzima terá um papel central na manutenção da homeostase e do microbioma intestinal. Uma diminuição da sua expressão poderá levar a inflamações intestinais e dibiose (desiquilibrio da flora intestinal). Os lipopolisacarídeos (LPS) são encontrados em abundância no trato gastrointestinal estando estes asociados a inflamações sistémicas. A IALP consegue inativar estes LPS com a remoção de um grupo fosfato, baixando significativamente o nível de toxicidade destes e impedindo assim a expressão de citocinas inflamatórias. Além disto, a IALP também regula o microbioma intestinal através da desfosforilação da adenosina trifosfato (ATP) que em quantidades elevadas leva a um decréscimo da diversidade bacteriana havendo uma maior exposição do intestino a inflamações ou doenças. Com isto percebemos a importância a IALP no combate a infeções e doenças intestinais.
Fosfatase alcalina de células germinativas 
Muitas vezes associada a ALP placentária, a ALP de células germinativas (GCALP) possui uma compatibilidade de 98% com a sequência de aminoácidos da PALP. Esta isoforma da Fosfatase alcalina, também foi mapeadano cromossoma 2. É uma enzima termoestável presente em pequenas concentrações em células germinativas embrionárias e tecidos neoplásicos. Tal como as isoenzimas discutidas anteriormente, a GCALP está ligada á membrana plasmática e pode ser detetada na placenta em baixos níveis. Tal como a ALP placentária, pode ser ´´reexpressa`` por células tumorais.
Fosfatase alcalina tecido não especifica
É expressa em muitos tecidos do organismo, mas sobretudo no tecido hepático, esquelético e renal e, por isso, pode ser dividida em três classes: ALP do Fígado/osso/ rim (LALP/BALP/KALP). Ao contrário das restantes isoenzimas, foi mapeada no cromossoma 1.
Figura 4: Diagrama da estrutura L/B/K ALP
 A ALP do fígado/hepática (LALP), como referido anteriormente, é a isoenzima que mais altera os níveis totais da ALP na corrente sanguínea. Os níveis de LALP na corrente sanguínea, aumentam ainda numa fase inicial da doença hepática, antes de ser detetada clinicamente pela maioria dos testes ao fígado. O grupo de doenças associado ao aumento da LALP são: a cirrose, doenças hepáticas induzidas por drogas, hepatite aguda entre outras.
A ALP óssea (BALP) é sintetizada nos osteoblastos e é normalmente elevada devido a um aumento da atividade osteoblástica. É a isoforma que mais contribui na atividade da ALP total na espécie humana. Presume-se estar envolvida no processo de calcificação óssea, logo será de esperar que em fases de crescimento ósseo elevado, como por exemplo nas crianças, que os níveis de ALP ósseo estarão com níveis de concentração acima do normal. O mesmo se verifica em indivíduos com mais 50 anos. O aumento dos níveis de ALP ósseo estão algumas vezes associados à doença de Paget, cancro ósseo ou ainda doença celíaca. Em contraste, uma diminuição da ALP óssea em crianças pode ser atribuída ao cretinismo ou à hipofosfatasia (devido a metabolismo anormal do substrato piridoxal-5-fosfato predominante na vitamina B6).
A ALP renal (KALP) está associada a doenças urológicas renais e também será aquela que menos conhecimento científico existe. Verificaram-se, através de testes clínicos, que durante doenças urológicas envolvendo os rins, os níveis de KALP na corrente sanguínea aumentavam e após tratamento das mesmas doenças estes níveis voltavam ao normal. Sendo assim, a Fosfatase alcalina pode contribuir também para diagnosticar doenças renais com base em alterações da sua concentração na corrente sanguínea.
Estrutura da Fosfatase alcalina 
As ALP’s são, em regra, proteínas homodiméricas, cada monómero com 484 resíduos, que contêm no seu sítio ativo 3 iões metálicos, dois zincos (Zn2+), nos sítios M1 e M2, e um magnésio (Mg2+), no sítio M3, essenciais á atividade catalítica. Estas enzimas encontram-se ligadas á superfície celular, têm como inibidores L-aminoácidos e peptídeos, sendo esta inibição descrita por um mecanismo não competitivo havendo algumas diferenciações consoante a isoforma da enzima. Até à pouco tempo, só tinha sido analisada a ALP de Escherichia coli (ECALP), mas esse ´´contratempo`` foi resolvido com o aprofundamento do conhecimento nas ALP’s de mamíferos analisando a ALP placentária humana. Desta análise concluiu-se que o núcleo é composto por uma folha β prolongada com hélices α flanqueadoras. Na estrutura global, é possível ainda observar quatro átomos metálicos, seiscentas e três moléculas de água e um ião fosfato. Comparativamente à ALP de Escherichia coli existem apenas 8% de resíduos em comum. Existem ainda elementos adicionais de estrutura secundaria, compreendendo uma hélice α com terminal-N (resíduos 9 a 25), uma hélice α e uma folha β numa zona divergente (resíduos 208 a 280). No sítio ativo apenas os elementos preponderantes para a catalise enzimática são preservados, como por exemplo a Ser, os três iões metálicos e seus respetivos ligandos. Numa zona da enzima é possível distinguir 3 zonas distintas: uma hélice α terminal-N longa, o domínio da coroa e um quarto sítio de ligação ao metal (M4) ocupado pelo cálcio (Ca2+). Este último sítio de ligação ao metal prossegue com significado estrutural e funcional desconhecido. Todas as ALP’s de mamíferos possuem 5 resíduos de cisteína por subunidade antagonicamente à ECALP que só possui 4 resíduos. Estes resíduos de Cys, estabelecem entre si duas pontes de dissulfeto enquanto 1 resíduo fica na forma livre. O domínio da coroa da ALP é composto por 60 resíduos (resíduo 366 a 436) de cada monómero. Composto por duas pequenas folhas β, cada uma delas composta por três cordões paralelos e rodeados por uma malha contento uma hélice α esta é a região que exibe uma conservação inferior. Tem também propriedades especificas, como a inibição não competitiva e comportamento alostérico atribuída ao resíduo 429. Outro resíduo de com ´´peso`` estrutural é o Y367, muito semelhante ao resíduo 429, também está envolvido nas propriedades da inibição não competitiva e seu caracter alostérico. 
A interface monómero-monómero nas ALP’s de mamíferos é de caracter hidrofóbico contrariamente a ECALP. A flexibilidade da interface deve-se a baixa quantidade de ligações por pontes de hidrogénio. A estrutura 3D da PALP humana contribuiu para a confirmação do caracter alostérico da enzima, sendo este comportamento ainda mais auxiliado pela boa qualidade da interface do dímero. Por fim, as ALP’s de mamíferos estão ligadas a membrana plasmática através de uma âncora de glicosil-fosfatidilinositol (GPI).
Figura 5: Estrutura tridimensional da ALP placentária
Conclusão
Com a realização deste trabalho sobre a Fosfatase alcalina, podemos concluir que a enzima intervém em reações de hidrolise, tendo vários benefícios no organismo humano, entre outros, como por exemplo na preservação do microbioma intestinal e em processos de calcificação óssea. A Fosfatase alcalina pode ainda ser uma ferramenta útil para diagnósticos clínicos de várias doenças hepáticas renais e ósseas.
Referencias:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2254479/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1304289/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4062654/
https://www.uniprot.org/uniprot/?query=EC+3.1.3.1&sort=score
https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/alkaline-phosphatase
http://www.aaltoscientific.com/product/alkaline-phosphatase/
http://www.jbc.org/content/247/6/1767.full.pdf
https://enzyme.expasy.org/EC/3.1.3.1
https://www.brenda-enzymes.org/enzyme.php?ecno=3.1.3.1#APPLICATION
http://www.bioline.org.br/request?bk07007
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4834149/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1525473
https://www.brenda-enzymes.org/all_enzymes.php?ecno=3.1.3.2&table=Reaction
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2254479/figure/Fig1/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=4062654_12291_2013_408_Fig5_HTML.jpg
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