POP - Manipulação de Reagentes e Soluções

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Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento 
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Embrapa Arroz e Feijão
	Código
036.015.005.006
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PROCEDIMENTO PARA MANIPULAÇÃO DE SOLUÇÕES
SUMÁRIO
1. OBJETIVO....................................................................................................................................2
2. CAMPO DE APLICAÇÃO............................................................................................................2
3. REFERÊNCIAS............................................................................................................................2
4. SIGLAS E ABREVIAÇÕES..........................................................................................................2
5. RESPONSABILIDADES...............................................................................................................2
6. ESPECIFICAÇÕES.......................................................................................................................2
7. DESCRIÇÃO DA MANIPULAÇÃO DE REAGENTES E SOLUÇÕES.....................................3
7.1- EDTA (0,5M, pH=8,0).................................................................................................................3
7.2- NaOH 10M (Hidróxido de Sódio).............................................................................................3
7.3 - Tris HCl (1M, pH=8,0)..............................................................................................................3
7.4 - Tampão de Extração para sementes – SDS – Extração Convencional.............................3
7.5 – Tampão A (Extração Alcalina)...............................................................................................4
7.6 – Tampão B (Extração Alcalina)...............................................................................................4
7.7 – Tampão Estoque (DART).......................................................................................................4
7.8 – Tampão CTAB (DART)...........................................................................................................4
7.9 – Sarcosyl 5% (DART)...............................................................................................................5
7.10 – Tampão de Trabalho (DART)..............................................................................................5
7.11 - Clorofórmio + Álcool isoamílico - CIA (24:1).....................................................................5
7.12 - T.E. (pH=8,0).........................................................................................................................5
7.13 - Gel de Agarose a 1,0%.........................................................................................................5 
7.14 - Solução Estoque de Acrilamida (40%)..............................................................................6
7.15 - Solução MATRIZ para gel de Acrilamida...........................................................................6
7.16 - Solução de fixação do gel na placa de vidro “inteira”.....................................................6
7.17 - Solução TBE 10X para 1L de reagente................................................................................6
7.18 - Solução de Persulfato de Amônia (10%).............................................................................6
7.19 - Preparo do LAMBDA DNA.....................................................................................................7
7.20 -Soluções de fixação com Etanol (10%) e Ácido Acético (1%)............................................7
7.21 - Solução de Oxidação/ pré-tratamento com Ácido Nítrico (1,5%)......................................7
7.22 - Solução de impregnação com Nitrato de Prata..................................................................8
7.23 - solução de revelação com carbonato de Sódio e Formaldeído........................................8
7.24 - Solução de bloqueio com Ácido Acético (5%)....................................................................8
7.25 – Diluição de primers estoque................................................................................................8
8. CONTROLE DE REGISTRO.........................................................................................................9
9. HISTÓRICO DE REVISÃO............................................................................................................9
1. OBJETIVO
Apresentar o procedimento para manipulação de soluções utilizadas nos protocolos implementados no laboratório de biotecnologia.
2. CAMPO DE APLICAÇÃO
Laboratório de Biotecnologia
3. REFERÊNCIAS
Manual de elaboração e controle de documentos – Embrapa (011.01.04.00.2.001).
Manual de Procedimentos para Elaboração de Normas – Embrapa (037.01.04.02.5.001).
Regimento Interno da Embrapa – Arroz e Feijão.
4. SIGLAS E ABREVIAÇÕES
Embrapa – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
EDTA – Ácido Etileno Diamino Tetracético
NaCl – Cloreto de Sódio
SDS – Dodecil Sulfato de Sódio
CTAB – Brometo de Cetil Trimetil Amônio
PVP-40 – Polivinilpirrolidona 40
TE – Solução de Tris e EDTA
TBE – Solução de Tris, Ácido Bórico e EDTA
5. RESPONSABILIDADES
Pesquisadores, analistas, assistentes, estagiários e bolsistas.
6. ESPECIFICAÇÕES
As soluções são utilizadas nos protocolos implementados no laboratório de biotecnologia.
7. DESCRIÇÃO DA MANIPULAÇÃO DE REAGENTES E SOLUÇÕES
7.1- EDTA (0,5M, pH=8,0)
- Pesar 18,61g de EDTA e reservar;
- Adicionar, em um béquer com agitador magnético, cerca de 60mL de água destilada;
- Adicionar o EDTA previamente pesado;
- Em seguida, ajustar o pH adicionando NaOH (hidróxido de sódio) até obter pH=8,0;
O EDTA dissolve somente em pH=8,0
Se necessário utilizar NaOH 10M para ajustar
- Completar para 100mL;
 - Armazenar em geladeira devidamente identificado.
7.2- NaOH 10M (Hidróxido de Sódio)
- Pesar 40g de Hidróxido de Sódio 
Utilizar máscara para pó durante a pesagem.
- Adicionar, em um béquer com agitador magnético, cerca de 50mL de água destilada;
- Na Capela, adicionar, lentamente, o Hidróxido de Sódio previamente pesado;
Essa reação é muito exotérmica (libera calor)
- Completar para 100mL;
- Armazenar a temperatura ambiente devidamente identificado.
7.3 - Tris HCl (1M, pH=8,0)
- Pesar 12,114g de Tris Base ou Tris Ultra Puro;
Sempre que tiver dúvida verificar o peso molecular descrito no frasco, pois o Tris utilizado nesse protocolo possui PM=121,14g
- Adicionar cerca de 60mL de água destilada;
- Em seguida, ajustar o pH adicionando HCl (Ácido Clorídrico) até obter pH=8,0;
Se necessário utilizar HCl concentrado na capela ou utilizando máscara com filtro específico para gases
- Completar o volume para 100mL;
- Armazenar em geladeira devidamente identificado.
7.4 - Tampão de Extração para sementes – SDS – Extração Convencional
- Medir 40 mL de Tris-HCl 1M pH7,5 e transferir para um béquer;
- Adicionar 11,5 mL de NaCl 5M;
- Adicionar 5,0 mL de EDTA 0,5M pH 7,5;
- Adicionar 10 mL de SDS 10%;
- Completar o volume para 200mL adicionando 128,5 mL de Água Deionizada;
- Armazenar a temperatura ambiente devidamente identificado.
7.5 – Tampão A (Extração Alcalina)
- Medir 98,5 mL de Água Deionizada;
- Adicionar 1,0 mL de Tween 20;
- Adicionar 0,5 mL de NaOH 10M.
É aconselhável preparar esse tampão somente no momento de uso.
7.6 – Tampão B (Extração Alcalina)
- Medir 44,8 mL de Água Deionizada;
- Adicionar 5,0 mL de Tris-HCl 1M pH 8,0;
- Adicionar 0,2 mL de EDTA 0,5M pH 8,0.
7.7 – Tampão Estoque (DART)
 
- Medir 50 ml Tris-HCl 1M pH 8,0 e transferir para um béquer;
- Adicionar 5 ml de EDTA 0,5 M pH 8,0;
- Adicionar 350 mL de Água MiliQ;
- Pesar 31,9 g de Sorbitol e dissolver na solução acima;
- Completar o volume para 500 mL com Água MiliQ; 
- Armazenar a temperatura ambiente devidamente identificado.
7.8 – Tampão CTAB (DART)
- Medir100 mL Tri-HCl 1M pH 8,0 e transferir para um béquer;
- Adicionar 50 mL EDTA 0,5 M pH 8,0;
- Adicionar 200 mL de NaCl 5 M; 
- Adicionar 100 mL de Água MiliQ;
- Pesar 10 g CTAB e dissolver na solução (aquecer se necessário);
- Completar o volume para 500 mL com Água MiliQ;
- Armazenar a temperatura ambiente devidamente identificado.
7.9 – Sarcosyl 5% (DART)
- Medir 90 mL de Água MiliQ e transferir para um béquer;
- Pesar 5 g de Sarcosyl e dissolver no béquer acima;
- Completar o volume para 100 mL com água MiliQ;
- Armazenar a temperatura ambiente devidamente identificado.
7.10 – Tampão de Trabalho (DART)
- Medir 50 mL de tampão de Extração e transferir para um béquer;
- Medir 50 mL de tampão de CTAB;
- Adicionar 20 mL de Sarcosyl 5%;
- Pesar 0,6 g de Bissulfito de Sódio e dissolver na solução acima;
- Pesar 2,4 g de PVP-40 e dissolver a solução acima;
- Armazenar a temperatura ambiente devidamente identificado.
 Utilizar esse tampão de trabalho no máximo 4 dias, após esse período preparar novo tampão de trabalho.
7.11 - Clorofórmio + Álcool isoamílico - CIA (24:1)
- Medir em uma proveta 240mL de Clorofórmio;
- Medir em uma proveta 10mL de Álcool isoamílico e transferir para o recipiente contendo o clorofórmio medido anteriormente;
- Armazenar a temperatura ambiente devidamente identificado.
7.12 - T.E. (pH=8,0)
- Medir em um proveta cerca de 90mL de água destilada;
- Adicionar 1mL da solução Tris HCl (1M, pH=8,0);
- Adicionar 200 μL da solução de EDTA (0,5M, pH=8,0);
- Completar com água para 100mL.
- Armazenar a temperatura ambiente devidamente identificado.
7.13 - Gel de Agarose a 1,0% 
- Pesar 1,0g de agarose;
- Medir, em uma proveta, 100mL da solução de TBE 1X e transferir para um erlenmeyer;
- Transferir a agarose previamente pesada;
- Levar para o microondas por 2min ou até completa dissolução;
- Esperar esfriar (não deixar polimerizar) e verter na cuba.
 7.14 - Solução Estoque de Acrilamida (40%)
- Pesar 228g de Acrilamida;
- Pesar 12g de BIS-Acrilamida;
- Adicionar, em um béquer cerca de 300mL de água destilada;
- Adicionar 60mL de TBE 10X;
- Após dissolver, completar para um volume de 600mL;
- Armazenar em geladeira devidamente identificado.
7.15 - Solução MATRIZ para gel de Acrilamida
- Em uma proveta, medir 90mL da solução de Acrilamida estoque e transferir para um béquer com agitação;
- Adicionar 60mL de TBE 10X;
- Pesar 252g de uréia e transferir para o béquer;
- Após dissolver, completar com água para 600mL de solução;
- Armazenar em geladeira devidamente identificado.
7.16 - Solução de fixação do gel na placa de vidro “inteira”
- Medir 1mL de Álcool Etílico;
- Adicionar 3 μL de Ácido Acético ( placa grande 5 μL);
- Adicionar 3 μL de Bind Silane (placa grande 5 μL).
7.17 - Solução TBE 10X para 1L de reagente
- Pesar 108g de Tris Base;
- Pesar 55g de Ácido Bórico;
- Adicionar 40mL de ETDA (0,5M, pH=8);
- Completar para 1L de solução 
- Armazenar a temperatura ambiente devidamente identificado.
7.18 - Solução de Persulfato de Amônia (10%)
- Pesar 5,0 g de Persulfato de Amônia;
- Dissolver em 40 mL de água deionizada;
- Completar o volume para 50 mL;
- Aliquotar 1,0 mL ou 2,0 mL em microtubo tipo eppendorf;
- Armazenar no congelador da geladeira localizado na sala de acrilamida devidamente identificado.
7.19 - LAMBDA DNA
- Preparar o reagente utilizando o exemplo descrito abaixo:
 Se o reagente LAMBDA está a uma concentração de 500ng/ μL e deseja-se preparar uma solução de 1mL com uma concentraççao de 20ng/ μL.
M 1= 500ng/ μL
V1 = ?
M 2 =20ng/ μL
V2 = 1000 μL
 Fórmula: M 1 x V1 = M 2 x V2
 500ng/ μL x V1 = 20 ng/ μL x 1000 μL
 V1 = 40 μL
- Retirar uma alíquota de 40 μL do LAMBDA DNA e 960 μL de água MiliQ para obter uma concentração de 20ng/ μL.
7.20 - Solução de fixação com Etanol (10%) e Ácido Acético (1%) 
- Medir em uma proveta 1500 mL de água deionizada;
- Adicionar 200mL de Etanol p.a. (99,5%);
- Adicionar 20mL de Ácido Acético p.a.;
- Completar o volume para 2000 mL com água deionizada;
- Armazenar em geladeira devidamente identificado.
Essa solução poderá ser reutilizada no máximo 3 vezes
7.21 - Solução de Oxidação/ pré tratamento com Ácido Nítrico (1,5%)
- Medir em uma proveta 1500 mL de água deionizada;
- Adicionar 20mL de Ácido Nítrico p.a.;
- Completar o volume para 2000 mL com água deionizada;
- Armazenar em geladeira devidamente identificado.
Essa solução poderá ser reutilizada no máximo 5 vezes
7.22 - Solução de impregnação com Nitrato de Prata
- Medir em uma proveta 600 mL de água deionizada e transferir para um béquer;
- Pesar 2g de Nitrato de Prata e dissolver no béquer acima;
- Transferir para uma proveta e completar para 2000 mL com água deionizada;
- Armazenar em geladeira devidamente identificado.
Essa solução poderá ser reutilizada no máximo 3 vezes
7.23 - Solução de revelação com Carbonato de Sódio e Formaldeído.
- Medir em uma proveta 800 mL de água deionizada;
- Pesar 60g de Carbonato de Sódio e dissolver no béquer acima;
- Transferir para uma proveta e ajustar o volume para 2000 mL com água deionizada;
- Armazenar em geladeira devidamente identificado.
Essa solução não poderá ser reutilizada e deverá ser preparada no dia que será utilizado, porém, adicionar 1080 μL de formaldeído 37% antes de iniciar a revelação.
7.24 - Solução de bloqueio com Ácido Acético (5%)
- Medir 1500 mL de água deionizada;
- Adicionar 100 mL do Ácido Acético p.a.
- Completar o volume para 2000 mL com água deionizada;
- Armazenar em geladeira devidamente identificado.
Essa solução poderá ser reutilizada no máximo 5 vezes
7.25 – Diluição de primers estoque
A diluição de primers é realizada de acordo com a concentração descrita no certificado de análise, podendo ser diluídos com água ou TE para 100 µM ou 500 µM, conforme exemplos abaixo:
Diluição de estoques para 500 µM
Quando a concentração do primer está em picomoles, dividindo o valor da concentração por 500, encontra-se o volume de TE ou água que deverá ser adicionado para diluir o primer.
Quando a concentração do primer está em nanomoles, multiplicando o valor da concentração por 2, encontra-se o volume de TE ou água que deverá ser adicionado para diluir o primer.
Primer diluído em TE são mais estáveis, porém, o EDTA pode interferir em algumas reações de PCR e neste caso deverá ser diluído em água
A partir dos primers estoque utiliza-se a fórmula C1V1 = C2V2 para preparar as soluções de trabalho.
8 CONTROLE DE REGISTRO
Dados a ser preenchido pelo NGQ
	Identificação
	Proteção
	Coleta
	Indexação
	Acesso
	Arquivo
	Armazenamento
	Tempo
	Disposição
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
9 HISTÓRICO DE REVISÃO
	Revisão
	Capítulo
Seção
Subseção
	Histórico de revisão
	Data
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	Elaboração
	Verificação
	Aprovação
	Registro e Codificação
	Fernanda Oliveira da Cunha Magalhães 
	Gesimária Ribeiro Costa Coelho
	Paula Arielle Mendes Ribeiro Valdisser
	
	Analista
	Analista
	Analista
	NGQ
	17/12/2012
	26/12/2012
	28/12/2012
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