Enzimas - Relatório Celulase PRONTO

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Isadora Caroline Sawoniuk
Vitoria Gouveia Resta
PRODUÇÃO DE CELULASE POR TRICHODERMA EM BAGAÇO DE MALTE SOB FERMENTAÇÃO SÓLIDA: RELATÓRIO AULA PRÁTICA
Londrina
2019
Isadora Caroline Sawoniuk
Vitoria Gouveia Resta
PRODUÇÃO DE CELULASE POR TRICHODERMA EM BAGAÇO DE MALTE SOB FERMENTAÇÃO SÓLIDA: RELATÓRIO AULA PRÁTICA
Atividade referente à disciplina de Enzimas em Biotecnologia (2BIQ129) do programa de pós-graduação em biotecnologia da Universidade Estadual de Londrina.
Londrina
2019
1.FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
Celulases
	Enzimas estão entre os produtos mais importantes de necessidade humana obtidos de fonte microbiológica (SHARADA, R. et al., 2013).
	Ao longo dos anos, e até os dias de hoje, contribuições científicas vêm sendo geradas continuamente, no que tange ao isolamento de micro-organismos produtores de celulases, ao aumento da expressão de celulases por mutações gênicas, à purificação e caracterização de componentes deste complexo enzimático, ao entendimento sobre os mecanismos de ataque à celulose, à clonagem e expressão de genes, à determinação de estruturas tridimensionais das celulases e à demonstração do potencial industrial dessas enzimas (CASTRO, A. M.; PEREIRA JR, N., 2010). 
	As enzimas do complexo celulolítico são hidrolases que clivam ligações O-glicosídicas, sendo classificadas pela Enzyme Comission (EC) com a codificação 3.2.1.x, onde o valor de x varia com a celulase avaliada. A classificação das celulases, de acordo com seu local de atuação no substrato celulósico, as divide em três grandes grupos: endoglucanases (EnG), que clivam ligações internas da fibra celulósica; exoglucanases (ExG), que atuam na região externa da celulose; e b-glicosidases (BG), que hidrolisam oligossacarídeos solúveis em glicose (CASTRO, A. M.; PEREIRA JR, N., 2010). 
 Substratos lignocelulósicos
	A celulose presente nos materiais renováveis de composição lignocelulósica é considerada o substrato orgânico de maior abundância no mundo como potencial matéria-prima química.	
O desenvolvimento de um processo para produção de celulase que seja econômico é dificultado se o substrato necessário for celulose pura (material de alto custo), ou ainda se o meio de cultura precisar ser enriquecido ou envolver metodologias de preparo caras, além disso o rendimento de produção de celulase por unidade de glicose pode não compensar os gastos de produção. Como uma tentativa de favorecer a produção, fontes de celulose de baixo custo como materiais lignocelulósicos de resíduos agroindustriais podem ser utilizados como substrato para cultivo de microrganismos sob fermentação em estado sólido (SHARADA, R. et al., 2013).
	Uma das mais emergentes aplicações das enzimas do complexo celulolítico atualmente é a hidrólise de biomassas. As matérias-primas de origem lignocelulósica, contém de 20 a 60% de celulose, que pode ser totalmente convertida em glicose, por ação enzimática. Em etapas seguintes, esse monossacarídeo pode ser utilizado para a obtenção de uma imensa gama de produtos, que abrange desde biocombustíveis até polímeros, sendo o etanol uma das moléculas de maior interesse (CASTRO, A. M.; PEREIRA JR, N., 2010). 
	Diversas pesquisas vem sendo desenvolvidas para avaliar a hidrólise enzimática de potenciais substratos lignocelulósicos, como pó de serra, resíduos de abacaxi, laranja e mandioca, biomassa de ervilha e óleo de palma, bagaço de cana-de-açúcar, farelo de arroz, trigo e aveia, palha de arroz, milho e trigo, casca de arroz, soja, algodão, milho, grama, resíduos de malte, casca de uva, dentre outros (SHARADA, R. et al., 2013).
 Processos produtivos e aplicações das celulases
	Celulases estão entre as enzimas mais utilizadas na indústria. Essas enzimas podem ser produzidas por fungos, bactérias ou actinomicetos, sendo os fungos os produtores mais comumente encontrados (SHARADA, R. et al., 2013).
	As duas principais estratégias para a produção de celulases por micro-organismos são a fermentação no estado sólido (FES) e a fermentação submersa (FS). Um dos parâmetros mais exaltados na diferenciação desses dois tipos de processos é o teor de água presente no meio reacional. Na FES há ausência ou quase ausência de água livre. A água presente nesses sistemas encontra-se complexada com a matriz sólida de substrato ou como uma fina camada absorvida pela superfície das partículas. Em geral, nesses processos o teor de umidade varia entre 30-85% e a atividade de água típica vai de 0,40-0,90, mimetizando condições encontradas na natureza e permitindo até que sejam conduzidos sem prévia esterilização, visto que a contaminação é pouco provável (CASTRO, A. M.; PEREIRA JR, N., 2010).
	As celulases têm diversas aplicações biotecnológicas, por exemplo, na indústria têxtil, conferindo melhor acabamento aos tecidos, tornando-os mais lisos, macios (CASTRO, A. M.; PEREIRA JR, N., 2010) e no processo de envelhecimento do jeans, através da remoção parcial do corante índigo. (LOPES, C., 2011). Também são utilizadas na indústria de bebidas, essas enzimas facilitam a extração de sucos e a maceração para produção de néctares de frutas, rompendo a rede de celulose liberando o líquido das células vegetais. Na vinificação as celulases são utilizadas pois auxiliam a extração de pigmentos e substâncias aromatizantes presentes na casca da uva, degradam compostos de sabor desagradável liberando substâncias flavorizantes, assim conferindo um melhor aroma e sabor ao vinho. (CASTRO, A. M.; PEREIRA JR, N., 2010). As celulases também exercem papel importante na nutrição animal, sendo incorporadas à ração, essas enzimas, juntamente com as celulases produzidas pelos microrganismos presentes no rúmen do animal, aumentam a digestibilidade das fibras da parede celular vegetal, facilitando a conversão do alimento ingerido em carne e leite (MARTINS, A. et al., 2007). Na fabricação de detergentes, proporcionam maior limpeza e menor degradação dos tecidos (PAYNE, C. et al., 2015; LIMA, A. et al., 2005) e na indústria de polpa e papel, tornam o papel mais branco e liso (CASTRO, A. M.; PEREIRA JR, N., 2010). Além disso, a possibilidade de emprego das celulases no processo de produção de etanol a partir de resíduos lignocelulósicos representa uma aplicação de grande interesse industrial (PAYNE, C. et al., 2015; WRIGHT, J. et al., 1988).
Trichoderma 
O gênero Trichoderma compreende fungos filamentosos, saprófitas de vida livre, que se reproduzem assexuadamente, habitam solos e matérias orgânicas em decomposição (RIBEIRO, T., 2009). Estes fungos tem a capacidade de sobreviver em diferentes ambientes, desde um habitat rico e diversificado como uma floresta tropical até um ambiente escuro e estéril como um fermentador biotecnológico ou frascos agitados (SCHUSTER e SCHMOLL, 2010), isso tudo devido a sua capacidade metabólica diversa e natureza competitiva (FLORENCIO, 2011).
 Perspectivas para enzimas no Brasil 
O mercado de enzimas está dividido em enzimas industriais (enzimas técnicas, enzimas para indústria de alimentos e para ração animal) e enzimas especiais (enzimas terapêuticas, diagnósticos e para pesquisa). As enzimas de uso industrial presentam 60% do mercado mundial, com destaque de grande uso as amilases, celulases e lipases.
 A América Latina representa 3,4% da demanda mundial de enzimas, sendo o Brasil correspondendo 60% do consumo de enzimas na região. O Brasil importa cerca de 86% de enzimas, e exporta 14%. Estes dados revelam um atraso tecnológico e estratégias em termos de produção e biocatalisadores. Porém esse quadro pode ser revertido com o avanço no mercado de biocombustível, ração animal e no mercado de polpa e papel. Em 2007 o Governo Federal Brasileiro instituiu uma Política de Desenvolvimento da Biotecnologia (PDB), que inclui a produção e o uso industrial de enzimas no Brasil. (MONTEIRO, V. N.; SILVA, R., 2009).
2.OBJETIVOS
	Cultivaro fungo Trichoderma em bagaço de malte, sob condições de fermentação em estado sólido;
	Desenvolver curvas de calibração dos métodos: Determinação de açúcares redutores pelo método do ácido 3,5-dinitrosalicílico DNS (MILLER, 1958); e determinação de proteínas totais pelo método descrito por Lowry, 1951.
	Determinar a atividade da enzima celulase pelo método descrito por Periyasamy et al., 2017.
	Determinar a concentração de proteínas totais pelo método descrito por Lowry, 1951;
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Microrganismo e manutenção
O microrganismo utilizado no experimento foi o fungo Trichoderma Th003 isolado de solos da região de Londrina-PR, no Departamento de agronomia da Universidade Estadual de Londrina. A manutenção desta cepa foi realizada através de repiques trimestrais em meio de batata, dextrose e ágar (BDA).
	3.1.1 Preparo do inóculo
A cepa do fungo Trichoderma foi transferida do meio de manutenção para tubos de ensaio contendo meio de Vogel Mínimo com 1 % de xilose, e foram incubados a 28 ± 2 ° C por 7 dias. Após esse período os esporos produzidos foram retirados assepticamente pela adição de salina fisiológica contendo Tween 80 0,1% e a suspensão obtida foi quantificada em câmara de Neubauer.
	3.1.2 Meio de cultivo
Para o crescimento do fungo Trichoderma sob fermentação em estado sólido foi utilizado, como meio de cultivo e substrato, bagaço de malte previamente seco em estufa a ±70ºC por volta de 4 dias.
	3.1.3 Fermentação em estado sólido
	O microrganismo foi inoculado em 2 Erlenmeyers de 50mL (2 e 3) contendo 1,4 g de pulverizado de bagaço de malte umedecidos com 10mL de Vogel mínimo. E incubados a 28 ± 2 °C por 7 dias.
	Também foi incubado um Erlenmeyer de 50mL (1) contendo apenas bagaço de malte, ausente de microrganismo para ser utilizado como controle.
	3.1.4 Interrupção dos cultivos
Para interrupção dos cultivos foram adicionados aos Erlenmeyers 2 e 3, contendo material fermentado (bagaço de malte e Trichoderma), e no Erlenmeyer 1, contendo apenas bagaço de malte, 1 mL de água destilada. Em seguida com um bastão de vidro o conteúdo dos frascos foram homogeneizados, o sobrenadante foi transferido para tubos Falcon e então centrifugados a 6000 rpm por 15 minutos para a sedimentação dos esporos e a obtenção de Extrato Bruto Enzimático (EBE). A partir do EBE foram realizadas as determinações analíticas.
3.2 Determinação do pH
O EBE das amostras foram submetidas a verificação do pH em potenciômetro, sendo o pH inicial da amostra controle (1) e pH final das amostras com cultivos (2 e 3).
3.3 Determinação do peso seco do material sólido fermentado
O material sólido fermentado foi transferido para barquinhos preparados com papel alumínio, previamente etiquetados e com peso determinado, e permaneceram em estufa a 70 °C até peso constante para determinação do peso seco.
3.4 Análise da presença de enzimas nas amostras
	3.4.1 Determinação da atividade celulásica
Uma unidade de atividade celulásica é definida como a quantidade de enzimas capaz de liberar µ moles de glicose por minuto por mL do extrato enzimático. O sistema de incubação foi feito com 0,5 mL da mistura de tampão citrato 50 Mm pH 5,0 contendo CMCase 1% e 0,5 mL de extrato enzimático (PERIYASAMY et al., 2017). O sistema foi mantido a 50 °C por 10 minutos e interrompido pela adição de 1 mL de DNS (MILLER, 1958). Os açúcares redutores liberados foram determinados segundo a técnica descrita por Miller, 1958. O sistema de incubação utilizado pode ser observado a seguir:
Tabela 1 – Sistema de incubação para determinação da atividade enzimática da celulase
	Reagentes
	Branco
	Reação
	C1
	C2
	CMCase 1% em tampão citrato 50 mM (pH 5,0)
	-
	0,5 mL
	-
	0,5 mL
	Tampão citrato 50 mM 
(pH 5,0)
	1 mL
	-
	0,5 mL
	0,5 mL
	Enzima (EBE)
	-
	0,5 mL
	0,5 mL
	-
	Incubar 10 min. em Banho Maria a 50ºC
	DNS
	0,5 mL
	0,5 mL
	0,5 mL
	0,5 mL
	Banho Maria fervente 10 min.
	H2O Destilada
	3,5 mL
	3,5 mL
	3,5 mL
	3,5 mL
	Homogeneizar e fazer a leitura em 540 nm
C1 – Controle da enzima; C2 – Controle do substrato
	A absorvância líquida referente ao conteúdo de açúcares redutores dos tubos foi calculado pela equação de DO líquida, demonstrada a seguir: 
e a atividade enzimática da celulase foi determinada por meio pela equação:
3.4.2 Determinação de proteínas
	A determinação do conteúdo proteico das amostras foi realizada pelo método de Lowry (LOWRY, et al., 1951). Trata-se de um método espectrofotométrico para quantificação de proteínas totais.
4.RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Contagem dos esporos em câmara de Neubauer
Tabela 2 – Resultados da contagem de esporos nos quadrantes observados
	Quadrante
	1
	2
	3
	4
	5
	Nº de esporos
	40
	32
	49
	53
	50
A média do número de esporos por quadrante é 44,8, considerando os 25 quadrantes da porção observada na câmara de Neubauer o número total de esporos equivale a 1120, este valor multiplicado pelo fator 104 (referente a área x volume), resulta em 1,1x107. A amostra observada no microscópio foi diluída 10 vezes, dessa forma, considerando o resultado obtido 1,1x107 e a diluição feita, confirmou-se que a suspensão obtida contendo 1,1x108 UFC/mL está de acordo com o autor referência (REZENDE et al., 2002).
4.2 Determinação do Ph
Tabela 3 – Resultados da determinação de pH das amostras
	Amostra
	pH
	Considerações
	1
	4,1
	Valor de pH inicial da análise
	2
	6,1
	Valor de pH final da análise
	3
	6,0
	Valor de pH final da análise
	É possível perceber, na tabela 3, que as amostras que foram inoculadas com o fungo Trichoderma tiveram, após o desenvolvimento do inóculo, um aumento no valor de pH, o que significa que o meio de cultivo ficou mais alcalino. Pode-se interpretar tal acontecimento como sendo efeito do acúmulo dos produtos metabólicos do fungo cultivado.
4.3 Determinação do peso seco do material sólido fermentado
Tabela 4 – Resultados da determinação do peso seco do material sólido fermentado das amostras 
	Amostra
	Pesagem 1 (barquinho de alumínio)
	Pesagem 2 (barquinho + material sólido)
	Peso final (material sólido - barquinho)
	1
	0,28 g
	3,11 g
	2,83 g
	2
	0,24 g
	2,32 g
	2,08 g
	3
	0,28 g
	2,18 g
	1,90 g
Os barquinhos de alumínio contendo o material sólido fermentado foram deixados em estufa a 70ºC por 3 dias, tempo necessário para que a amostra adquirisse peso constante. Como é possível perceber na tabela 4, o peso do material seco fermentado da amostra controle foi de 2,83 g, valor superior aos encontrados para as amostras, sendo 2,08 g para a amostra 2 e 1,90 g para a amostra 3. O comportamento observado demostra que a amostra que não recebeu o inóculo (1) teve maior conteúdo de material sólido fermentado, ou seja o meio de cultivo sofreu menos transformação em material solúvel, enquanto que as amostras que receberam inóculo do fungo Trichoderma (2 e 3) tiveram ao final do cultivo menor conteúdo de material sólido fermentado, pois o bagaço de malte foi consumido pelos microrganismos servindo de substrato ao metabolismo celular para obtenção de energia e desenvolvimento.
4.4 Determinação da atividade celulásica
	A absorvância líquida referente ao conteúdo de açúcares redutores dos tubos foi calculado pela equação de DO líquida, com os valores de R1, R2, C1 e C2 sendo os determinados pelas leituras de absorvância em espectrofotômetro a 540nm, descritos na tabela 5.
Tabela 5 – Resultados das absorvâncias em duplicata das amostras, controle da enzima (C1) e controles do substrato (C2)
	Amostra
	ABS R
	ABS C1
	ABS C2
	DO líquida
	
	 (540nm)
	 (540nm)
	 (540nm)
	 (540nm)
	 Cultivo 1 *
	-
	-
	0,011
	-
	Cultivo 2
	0,691
	0,574
	0,011
	0,098
	Cultivo 3
	0,631
	0,521
	0,011
	0,151
*Cultivo1 (controle)
Cálculo da DO líquida para a amostra 2:
Cálculo da DO líquida para a amostra 3:
O método DNS, utilizado para a quantificação de açúcaresredutores das amostras, é um método espectrofotométrico que requer uma curva de calibração feita com relação entre a absorvância e a concentração de açúcares redutores de uma solução padrão, na metodologia foi utilizada solução padrão de glicose 1 mg/mL e as leituras realizadas a 540 nm. A curva de calibração e a equação da reta obtidas podem ser visualizadas a seguir:
Figura 1 – Curva de calibração do método do ácido 3,5-Dinitrosalicílico (DNS) para a determinação de glicose
Abs. 540 nm
Concentração (mg/mL)
A partir da equação da reta, considerando Y o valor de absorvância e X a concentração de glicose em mg/mL, foi determinada a concentração de glicose referente ao valor de absorvância da DO líquida (0,103). O valor de X foi determinado para as amostras como demonstrado a seguir:
Determinação de X para a amostra 2:
Determinação de X para a amostra 3:
Então a determinação da atividade enzimática da celulase foi determinada para cada uma das amostras de acordo com a equação a seguir, sendo que como a amostra não precisou ser diluída o Fator de Diluição (FD) não precisou ser considerado:
Determinação da atividade enzimática para a amostra 2:
Determinação da atividade celulásica para a amostra 3:
Os resultados evidenciaram que as amostras apresentaram uma atividade celulásica média de 0,1038 µ moles de glicose liberados por minuto por mL de extrato enzimático. A análise feita por Khan et al., 2007 utilizando palha de arroz como substrato para produção de celulases por Trichoderma spp. obteve o valor de 0,10 U/mL, valor semelhante ao determinado pela presente análise.
4.5 Determinação de proteínas
O método de Lowry, utilizado para a quantificação do conteúdo proteico das amostras, é um método espectrofotométrico que requer uma curva de calibração feita com relação entre a absorvância e a concentração de proteínas totais de uma solução padrão, na metodologia foi utilizada solução padrão de albumina bovina 400 µg/mL e as leituras realizadas a 660 nm. A curva de calibração e a equação da reta obtidas podem ser visualizadas a seguir:
Figura 2 – Curva de calibração do método de Lowry para a determinação de proteínas
A partir da equação da reta, foram determinadas as concentrações de proteínas totais das amostras 1, 2 e 3. Considerando Y o valor encontrado de absorvância para cada amostra determinou-se o valor de X referente a concentração de proteínas totais de cada amostra.
Tabela 6 – Resultados das absorvâncias em duplicata das amostras e da determinação da concentração de proteínas totais
	Amostra
	Absorvância 1
	Absorvância 2
	Média
	Proteínas totais (µg/mL)
	1
	0,562
	0,571
	0,567
	341,17
	2
	0,719
	0,733
	0,726
	474,09
	3
	0,668
	0,666
	0,667
	424,92
Os valores médios de absorvância encontrados para as amostras foram utilizados para substituir Y na equação da reta () e os valores de X, concentração de proteínas totais das amostras, foram determinados. 
Exemplo:
Considerando os valores de proteínas totais determinados para as amostras, percebe-se que o conteúdo proteico das amostras de cultivo, 2 e 3, é superior ao do controle, amostra 1. Uma vez que a produção das celulases, que são proteínas, é realizada pelo microrganismo que foi inoculado somente nas amostras de cultivo (2 e 3), o resultado encontrado corresponde ao esperado. A presença de conteúdo proteico no controle é considerado como sendo correspondente a composição do bagaço de malte e não a produção de enzimas pelo microrganismo.
Figura 3 – Resultados das análises do extrato bruto enzimático (EBE) do cultivo de Trichoderma em bagaço de malte
5.CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos pelo trabalho realizado, podemos concluir que o fungo Trichoderma produziu celulase com a utilização de bagaço de malte como substrato. O método de Periyasamy mostrou ser eficiente para determinação de atividade celulásica.
6.REFERÊNCIAS
CASTRO, A. M.; PEREIRA JR, N. Produção, propriedades e aplicação de celulases na hidrólise de resíduos agroindustriais. Química Nova, v. 33, n. 1, p. 181-188, 2010.
KHAN, M.H.; ALI, S.; FAKHRU’LRAZI, A.; ALAM, Z. Use of fungi for the bioconversion of rice straw into cellulase enzyme. Journal of Environmental Science and Health, Part B: Pesticides, Food Contaminants, and Agricultural Wastes, v.42, p.381386, 2007.
LIMA, A. L. G.; NASCIMENTO, R. P.; BON, E. P. S.; COELHO, R. R. R. Streptomyces drozdowiczii cellulase production using agro-industrial by-products and its potential use in the detergent and textile industries. Enzyme and Microbial Technology, v. 37, p. 272-277, 2005
LOPES, C. S. D. Análise ambiental da fase de acabamento do jeans. Interfacehs Revista de Saúde, Meio Ambiente e Sustentabilidade, v. 6, n. 3, p. 87-102, 2011.
LOWRY et al. J. Biol. Chem., V. 193, p. 265, 1951.
MARTINS, A. S.; VIEIRA, P. F.; BERCHIELLI, T. T.; PRADO, I. N. Degradabilidade de volumosos utilizando enzimas fibrolíticas. Acta Scientiarum: Animal Sciences, v. 30, n. 4, p. 435-442, 2008.
MILLER, G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determinations of reducing sugar. Anal. Chem., p.426-428, 1958.
MONTEIRO, Valdirene; SILVA, Roberto. Aplicações Industriais da Biotecnologia Enzimática. Processos Químicos/SENAI, Departamento Regional de Goiás -Goiânia, v.3, n.5, p. 9-23, jan/jun, 2009.
PAYNE, C. M.; KNOTT, B. C.; MAYES, H. B.; Hansson, H.; HIMMEL, M. E.; SANDGREN, M.; STÅHLBERG, J.; BECKHAM, G. T. Fungal cellulases. American chemical society (ACS) publications, Chem. Rev, v. 115, p. 1308−1448, 2015.
PERIYASAMY, K.; SANTHALEMBI, L.; MORTHA, G.; AUROUSSEAU, M.; GUILLET, A.; DALLERAC, D.; SIVANESAN, S. Production,partial purification and characterization of enzyme cocktail from Trichoderma citrinoviride AUKAR04 through solid state fermentation. Arab. J. Sci. Eng. V.42, p.53-63, 2017.
REZENDE, M.I.; BARBOSA, A.M.; VASCONCELOS, A.F.D.; SAKURADA, A.E. Xylanase Production by Trichoderma harzianum Rifai By Solid State Fermentation on Sugarcane Bagasse. Brasilian Journal of Microbiology, v.33, p.67-72, 2002.
RIBEIRO, Tanara da Silva. O fungo Trichoderma spp. no controle de fitopatógenos: dificuldades e perspectivas. 2009. 35f. Monografia (Especialização em Tecnologias Inovadoras no Manejo Integrado de Pragas e Doenças de Plantas) – Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto alegre, 2009.
SHARADA, R.; VENKATESWARLU, G.; VENKATESHWAR, S.; ANAND RAO, M. Production of cellulase – A review. International Journal of Pharmaceutical, Chemical and Biological Sciences, 3(4), p. 1070-1090, 2013.
SCHUSTER, A.; SCHMOLL, M. Biology and Biotechnology of Trichoderma. Applied Microbiology and Biotechnology. v, 87, p. 787-799, 2010.
WRIGHT, J. D.; WYMAN, C. E.; GROCHMANN, K. Simultaneous saccharification and fermentation of lignocellulose: Process evaluation. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 17, p. 75-90, 1988.