Cinética Enzimática

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1. Introdução 
As enzimas são catalisadores biológicos extremamente eficientes, sendo capazes de 
acelerar uma reação química em até um milhão de vezes devido à alta especificidade aos seus 
reagentes (chamados de substratos). Todas as enzimas são proteínas, com exceção de um 
pequeno grupo de moléculas de RNA, chamado de Ribozimas. Sua atividade catalítica 
depende da integridade da sua conformação proteica nativa, em caso de desnaturação da 
enzima ou dissociação das suas subunidades, ela perde a sua atividade catalítica, ou seja, sua 
conformação estrutural tridimensional é essencial para que as enzimas possam exercer a 
catálise. 
 Algumas enzimas somente necessitam dos seus resíduos de aminoácidos para exercer 
sua função, porém, outras dependem de outros grupos químicos para tal, denominados 
cofatores. Cofatores podem ser divididos em metais (íons inorgânicos) e pequenas moléculas 
orgânicas, as coenzimas, essas comumente derivam de vitaminas, agem como carreadores 
transitórios de grupos funcionais específicos e podem se ligar à enzima de maneira firme ou 
frouxa. Quando estão ligadas firmemente as coenzimas são chamadas de grupos prostéticos e, 
quando frouxas, são semelhantes a cossubstratos pois são capazes de se ligar à enzima e 
serem liberados dela. Quando uma enzima está ligada ao seu cofator é chamada de 
holoenzima e quando apresenta somente a sua estrutura proteica é denominada apoenzima. 
 Devido aos diversos nomes que eram dados a uma enzima (baseados no nome dos 
seus substratos, à sua atividade etc.) definiu-se um sistema internacional de nomenclatura 
para que ambiguidades fossem evitadas e para que um padrão classificatório fosse 
estabelecido. Esse divide as enzimas em seis classes baseado no tipo de reação catalisada por 
elas, cada uma dessas classes contém várias subclasses. Portanto, cada enzima possui um 
número de classificação de quatro partes e um nome sistemático, que indicam qual reação é 
catalisada pela mesma. Tais classes são: Oxidorredutases (reações de oxirredução); 
Transferases (reações de transferência de grupos); Hidrolases (reações de hidrólise onde há 
transferência de grupos funcionais para a água); Liases (quebra de ligações C-C, C-S e certas 
ligações C-N); Isomerases (transfere grupos dentro de uma mesma molécula formando 
isômeros) e Ligases (forma ligações entre carbono e O, S e N acopladas à hidrólise de ATP). 
A enzima utilizada neste estudo chama-se Fosfatase Alcalina e ela está inserida na categoria 
das hidrolases, onde a mesma retira grupos fosfato de diversas outras moléculas. 
 Como já mencionado, as enzimas aceleram grandemente reações químicas, essas 
podem ocorrer espontaneamente, porém são muito lentas e sua catálise é essencial para os 
sistemas vivos. Para que uma reação ocorra, é necessário que as moléculas estejam em uma 
orientação exata e formem um produto intermediário instável, fatores que dificilmente 
acontecem no ambiente celular. As enzimas proporcionam um ambiente específico adequado 
para que essas reações possam ocorrer de forma mais rápida, esse, chamado de sítio ativo, é 
um bolsão na enzima formado por resíduos de aminoácidos com grupos nas cadeias laterais 
onde o substrato se liga. Quando ocorre a ligação do substrato ao bolsão enzimático tem-se 
um complexo enzima-substrato, sendo esse um complexo transitório em uma reação 
catalisada por uma enzima. 
 A função de um catalisador é aumentar a velocidade de uma reação, não alterar o seu 
equilíbrio químico. Substratos (S) e produtos (P) possuem a sua própria contribuição de 
energia para o sistema (reação), chamado de estado fundamental e a diferença da energia 
desses estados reflete o equilíbrio entre S e P em uma reação. Normalmente a energia de P é 
menor do que a de S, caracterizando uma reação exergônica (negativa), favorecendo uma 
maior produção de P. Para que o substrato possa ser convertido em produto (ou o contrário) é 
necessário que a barreira energética existente entre esses dois estados seja superada e as 
moléculas atinjam um nível energético superior. Esse momento é denominado de estado de 
transição, pois é um momento onde ocorrem quebra e formação de novas ligações, não 
possuindo uma estabilidade significativa. 
 É denominado energia de ativação a diferença entre o estado de transição e os níveis 
energéticos do estado basal. Quanto maior a energia de ativação mais lenta é uma reação, essa 
velocidade pode ser aumentada pela elevação da temperatura e pressão, que fará com que as 
moléculas tenham mais energia para superar a barreira energética, ou então essa energia de 
ativação pode ser reduzida, aumentando a velocidade da reação, tarefa essa executada pelos 
catalisadores, nesse caso, as enzimas. 
 As enzimas não são consumidas em uma reação química e a energia liberada nessas 
reações é capaz de fazer parte de outras vias metabólicas. Durante uma reação catalisada por 
uma enzima, espécies químicas transitórias são formadas e consumidas e são denominadas de 
intermediários da reação, como por exemplo, os complexos enzima-substrato (ES) e 
enzima-produto (EP). A conversão de um intermediário da reação em outro que ocorre em 
sequência, como a transformação de S em P, caracteriza uma etapa da reação e, na existência 
de várias etapas, a velocidade final é determinada pela etapa com a maior energia de ativação, 
sendo essa chamada de etapa limitante da velocidade. 
 Para que a enzima seja capaz de aumentar a velocidade de reações com tanta eficácia, 
é necessário que haja uma especificidade entre elas e seu substrato e que haja uma meticulosa 
distinção entre substratos muito semelhantes. As enzimas são capazes de fazer isso graças ao 
rearranjo de ligações covalentes que fazem com substratos (no sítio ativo) através de seus 
grupos funcionais, podendo assim ativar esse substrato para a reação. Além disso, ligações 
não covalentes entre enzima e substrato também se mostram muito importantes para a 
formação dos complexos proteicos específicos. Esses complexos, quando interagem, liberam 
uma energia de ligação e essa é a principal fonte de energia livre utilizada pelas livres para 
reduzir a energia de ativação das reações. 
 Essa redução acontece pois as enzimas são complementares aos estados de transição 
do seu substrato. Quando a ligação entre os dois ocorre, somente uma parte do substrato é 
utilizada inicialmente na formação do complexo e, após essas primeiras ligações serem feitas 
haverá um aumento da energia livre para que seja atingido o estado de transição. Entretanto, a 
energia de ligação entre a enzima e seu substrato no estado de transição é capaz de compensar 
a energia livre necessária para atingir o respectivo estado, acarretando em uma redução da 
energia de ativação. Logo, as ligações não covalentes (mais fracas) são de extrema 
importância para que a catálise ocorra e a velocidade da reação aumente. Ademais, essa 
mesma energia de ligação fornece às enzimas a sua especificidade devido aos múltiplosrearranjos que os grupos funcionais das mesmas podem ter, que serão capazes de fazer uma 
grande variedade de interações com um único substrato específico. 
 As enzimas dispõem de alguns mecanismos para superar as barreiras de reação e 
executar sua função, são elas: a redução da entropia, onde a energia de ligação manterá o 
substrato na posição correta para reagir, facilitando um processo que é normalmente raro; a 
dessolvatação do substrato pelas interações enzima-substrato, substituindo as ligações de 
hidrogênio que o mesmo faz com a água e que são capazes de impedir a reação; o ajuste 
induzido, em que a enzima sofre uma mudança conformacional quando ligada ao substrato e 
isso induz a formação de novas ligações fracas, aumentando a sua capacidade catalítica. 
 Todo esse mecanismo enzimático pode ser estudado através da determinação da 
velocidade das reações que são catalisadas e como elas são alteradas por mudanças de 
parâmetros experimentais, esse estudo é chamado de cinética enzimática. 
 Em um meio reacional, a concentração de S é capaz de alterar a velocidade das 
reações catalisadas pelas enzimas, porém, no decorrer desse processo essa concentração varia 
pois gradativamente esse substrato vai sendo convertido em produto e consequentemente a 
velocidade da reação vai sendo reduzida concomitantemente. Um método utilizado para 
superar esse problema é a determinação da velocidade inicial (V​0​), onde apenas 
concentrações muito pequenas de substrato (que estão presentes em quantidade até seis vezes 
maiores que as enzimas) serão convertidas em produto, não alterando o mesmo 
significantemente, podendo até considerar a sua concentração constante. Uma forma de 
identificar o V​0 de uma reação é observando o aumento do volume de produto formado em 
função do tempo, onde o mesmo aumenta gradualmente até um momento em que o equilíbrio 
é atingido e as concentrações de S e P praticamente não sofrem mais nenhuma mudança, 
logo, V​0​ pode ser definido pela concentração de produto quando a reação está começando. 
 
Gráfico 1 - quantidade de produto por tempo com diferentes concentrações de substratos em que a tangente 
traçada no tempo inicial indica V​0​. 
 
Fonte: Stryer, 2014 
 
V​0​, quando determinada, pode ser analisada em função da concentração de substrato, 
[S]. Quando a concentração de enzimas é constante e somente a de substrato é alterada, 
afere-se que quando as concentrações de S estão baixas, V​0 aumenta quase que linearmente 
conforme [S] aumenta e que quando S está em concentrações muito elevadas e progredindo 
V0 aumenta em pequenas quantidades até atingir uma região de platô, onde seu aumento se 
torna insignificante. Nessa região é definida a velocidade máxima da reação, V​máx​. Esse 
comportamento catalítico é explicado por uma teoria de ação de enzimas postulada por 
Leonor Michaelis e Maud Menten, que explica que primeiramente a enzima se combina com 
o substrato de forma reversível em uma etapa rápida, formando o complexo enzima-substrato, 
[ES] e em seguida, esse complexo é rompido em uma etapa mais lenta liberando enzima e 
produto. Essa segunda etapa, por ser mais lenta, limita a velocidade total da reação, logo, essa 
velocidade deve ser proporcional à concentração do complexo [ES]. No início de uma reação, 
quando [S] é baixa, a enzima existe em uma forma não combinada (E) e, portanto, a 
velocidade será proporcional à concentração de substrato no meio já que o equilíbrio está 
sendo deslocado para formação de [ES]. Porém, essa concentração de substrato vai 
aumentando e em determinado momento quase toda enzima estará como complexo ES e a 
quantidade de E será desprezível indicando uma “saturação” da enzima, nesse momento 
têm-se V​máx​. 
 
Gráfico 2 - V​0​ em função da concentração de substrato [S] indicando a região de V​máx​. 
 
Fonte: Stryer, 2014 
 
A curva que expressa essa relação entre [S] e V ​0 tem o mesmo perfil para a maioria 
das enzimas (aproximadamente uma hipérbole retangular) e pode ser expressa algebricamente 
pela equação de Michaelis-Menten, que define, portanto, uma equação da velocidade da 
reação com um único substrato catalisada por uma enzima: 
Imagem 1 - Equação de Michaelis-Menten. 
 
Fonte: Lehninger, 2014 
 
Onde: 
V​0​ = Velocidade inicial 
V​máx​ = velocidade máxima 
[S] = concentração de substrato 
K​m​ = constante de Michaelis 
 
 A constante de Michaelis (K​m​) utilizada nessa equação tem dois significados: 
equivale à concentração de substrato em que V ​0 é igual a metade de V​máx e é igual à 
constante de dissociação do complexo ES. Um valor de Km alto indica uma ligação forte 
enquanto que um valor baixo indica uma ligação fraca, caracterizando situações de baixa e 
alta afinidade da enzima pelo substrato, respectivamente. 
 A partir da equação de Michaelis-Menten, determinar valores precisos para K ​m e 
V​máx era impossível, já que V​máx possuía um valor aproximado de modo assintótico e K​m era 
calculado a partir desse valor. No entanto, existe uma maneira mais precisa de determinar 
V​máx e Km transformando a equação anterior em uma nova que apresenta um gráfico em 
linha reta. Essa nova equação é denominada equação de Lineweaver-Burk e o gráfico gerado 
é chamado de duplo-recíproco. 
 
Imagem 2 - Equação de Lineweaver-Burk. 
 
Fonte: Lehninger, 2014 
 
 Neste gráfico, a inclinação da reta corresponde a K ​m​/V ​máx​, a intersecção no eixo 
vertical é 1/ V​máx​ e a intersecção no eixo horizontal é -1/K​m. 
 
Gráfico 3 - Duplo-Recíproco. 
 
Fonte: Stryer, 2014 
 
A atividade das enzimas pode ser alterada quando pequenas moléculas e íons se ligam 
a elas. Chamados de inibidores, esses são capazes de diminuir ou interromper as reações 
enzimáticas. Pelo fato das enzimas catalisarem quase todos os processos da célula, diversos 
desses inibidores estão entre os medicamentos mais importantes. 
A inibição enzimática pode ser reversível ou irreversível. Os inibidores irreversíveis 
se ligam firmemente à enzima e, portanto, dissociam-se da mesma mais lentamente; o oposto 
ocorre com inibidores irreversíveis, em que há uma rápida dissociação do complexo 
enzima-inibidor (EI). Esse último tipo de inibição possui três tipos diferentes e que podem ser 
distinguidos por seus comportamentos cinéticos: competitiva, incompetitiva e 
não-competitiva. 
Na inibição competitiva, tanto o substrato quanto o inibidor podem ligar-se ao sítio 
ativo da enzima, porém, não conjuntamente, isso ocorre pois o inibidor é muito similar ao 
substrato da enzima. Quando ocorre uma ligação do inibidor no sítio ativo, o substrato é 
impossibilitado de se ligar e essa condição reduz a velocidade de catálise pois reduz a 
proporção de enzimas ligadas a um substrato. Porém, essa inibição pode ser removida 
aumentando a concentração de substrato no meio. 
Ao observar a cinética da inibição competitiva, há um aumento aparente de K​m​, 
significando que há necessidade de mais substrato para que a mesma velocidade da reaçãosem inibidor seja atingida e não há alterações no valor de V​máx​, pois ocorre saturação 
enzimática da mesma forma. 
 
Gráfico 4 - duplo-recíproco na presença e ausência de inibidor competitivo ilustrando a alteração em 
K​m​ e ausência de mudança em V​máx​. 
 
Fonte: Stryer, 2014 
 
Na inibição incompetitiva, o inibidor se liga somente ao ES, pois o sítio de ligação 
para esse inibidor só é criado quando ocorre a interação da enzima pelo seu substrato. 
Diferente da competitiva, esse tipo de inibição não pode ser superado pela adição de mais 
substrato. 
Quando ocorre a ligação do inibidor, forma-se um novo complexo 
enzima-substrato-inibidor (ESI) que não é capaz de formar qualquer produto, logo, como 
algum complexo do tipo sempre estará presente, o valor de V​máx será reduzido. Além disso, o 
valor aparente de Km também diminui, pois como os complexos ES estão sendo reduzidos 
pela presença do inibidor, mais S deve-se ligar à E para manter o equilíbrio de E e ES, logo, 
precisa-se de uma menor [S] para atingir metade da V ​máx​. 
 
Gráfico 5 - duplo-recíproco de inibição incompetitiva ilustrando a não alteração da inclinação e a 
redução equivalente de K​m​ e V​máx​ em relação à ausência de inibidor. 
 
Fonte: https://biochemanics.wordpress.com/2013/04/07/reversible-inhibition/ 
 
Na inibição não competitiva, inibidor e substrato podem ligar-se ao mesmo tempo na 
enzima, porém, em sítios de ligação diferentes e, esse tipo de inibidor é capaz de se ligar à 
enzima livre ou ao complexo ES, diferente do inibidor incompetitivo. A atuação desse 
inibidor é na redução da concentração de enzima funcional, acarretando em uma diminuição 
da renovação dessa enzima. A inibição não competitiva também não pode ser anulada 
aumentando [S]. Inibição mista é um padrão clássico de inibição não competitiva e ocorre 
quando a ligação do substrato é dificultada por um único inibidor e também ocorre a 
diminuição da renovação enzimática. 
Nesse caso, quando o substrato se liga ao complexo EI formando ESI, a reação 
também não prosseguirá para a formação de produto e o valor de V ​máx é diminuído, porém 
K​m não se altera. Isso ocorre pois, com o aumento da quantidade de enzimas não funcionais, 
a solução resultante se comporta como uma solução diluída da enzima. 
 
Gráfico 6 - duplo-recíproco de inibição não competitiva ilustrando a redução de V​máx​ e K​m ​ sem 
alteração em relação à ausência de inibição. 
 
 Fonte: Stryer, 2014 
 
​Além da existência desses mecanismos que alteram as reações enzimáticas através da 
formação de ES, existem também fatores que afetam a natureza proteica das enzimas, 
podendo criar um meio ótimo para que a reação aconteça ou um meio desfavorável, capaz de 
alterar a estrutura enzimática e, consequentemente, prejudicar a reação. Tais fatores são 
alterações de pH e temperatura do meio reacional. 
As alterações enzimáticas que ocorrem pelo pH estão relacionadas à propriedade 
anfótera das cadeias laterais dos aminoácidos presentes na estrutura proteica da enzima, ou 
seja, essas cadeias podem comportar-se como ácidos ou bases fracos em situações críticas 
onde a enzima necessita de um certo estado de ionização de seus aminoácidos para que a 
estrutura proteica se mantenha íntegra, acabando por desestruturá-la. Cada enzima têm uma 
faixa ótima de pH, onde sua estrutura se encontra na forma mais adequada e a atividade 
catalítica é máxima. 
A temperatura é capaz de alterar a atividade enzimática seguindo o comportamento de 
qualquer reação química comum, onde a sua velocidade aumenta conforme a temperatura do 
meio é elevada. Porém, a velocidade da reação aumenta até um máximo e após determinada 
temperatura declina rapidamente. Esse decrescimento ocorre, pois, temperaturas muito altas 
são capazes de romper a estrutura tridimensional das enzimas, impossibilitando que exerçam 
sua função. Esse nível máximo que a velocidade atinge é a temperatura ótima, em que a 
atividade catalítica da enzima será a mais elevada possível. 
 
 
2. Objetivos 
2.1. Objetivo geral: 
Verificar a atividade da enzima fosfatase alcalina em diferentes condições de 
temperatura, presença ou ausência de inibidor, concentração de substrato e curso temporal. 
2.2. Objetivos específicos: 
-Construir uma curva padrão de PNP; 
-Analisar o efeito de diferentes temperaturas na atividade enzimática; 
-Avaliar a formação de produto em função do tempo de reação; 
-Construir uma curva de Michaelis e Menten na presença e na ausência de inibidor; 
-Construir um gráfico de Lineweaver-Burk na presença e na ausência de inibidor; 
 
 
3. Material e Métodos 
3.1. Material: 
-Solução padrão de p-nitrofenol (PNP) 0,1 mM em tampão Tris-HCl pH 9, 5; 
-Solução de p-nitro-fenil-fosfato (PNPP) 1mM em tampão Tris-HCl pH 9,5; 
-Solução tampão Tris-HCl 0,2 M, pH 9, 5; 
-Solução de Na​2​HPO​4​___mM em tampão Tris-HCl 0,2 M pH 9,5 (sol. tampão 
Tris-Pi-HCl); 
-Solução de NaOH 2 M; 
-Solução de enzima fosfatase alcalina (EC 3.1.3.1)___ μ​g/mL (Sigma Fine 
Chemicals); 
-Pipetador automático 20-100 ​μ​L; 
-Pipetador automático 200-100 ​μ​L; 
-Pró-pipetes; 
-Tubos de ensaio; 
-Banho de gelo (4°C) 
-Banho-maria (37°C) 
-Banho-maria (68°C) 
-Placa de 96 poços; 
-Leitor de ELISA; 
 
3.2. Métodos: 
3.2.1. Curva padrão de PNP: 
Com o auxílio de pipeta e pró-pipete, foram transferidas alíquotas das soluções 
indicadas para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo: 
 
Tabela 1 - tubos e suas respectivas alíquotas para cada solução 
Tubo 
n° 
Solução Padrão de 
PNP (​μ​L) 
Tampão Tris-HCl 
pH 9,5 (​μ​L) 
Solução de 
NaOH 2M (​μ​L) 
B 0 800 200 
1 75 725 200 
2 150 650 200 
3 225 575 200 
4 300 500 200 
5 375 425 200 
6 450 350 200 
7 525 275 200 
Fonte: elaborada pelo autor 
Após a adição dos volumes indicados das soluções indicadas, os tubos ficaram 
com o mesmo volume e estes foram homogeneizados manualmente. 
Em seguida, os conteúdos dos tubos foram transferidos para uma placa de 96 
poços e esta foi levada ao leitor de ELISA. Neste aparelho foi realizada a leitura da 
absorbância a 405 nm de cada um dos tubos, utilizando o tubo branco (B) como 
referência de calibração. 
 
3.2.2. Curso temporal 
Com o auxílio de pipeta e pró-pipete, foram transferidas alíquotas das soluções 
indicadas para uma placa de 96 poços segundo a tabela abaixo: 
Tabela 2 - Meio de reação 
Tampão Tris-HCl pH 
9,5 (​μ ​L) 
PNPP 
1 mM 
(​μ​L) 
Enzima 
(​μ​L) 
 
125 62,5 12,5 
Fonte: Protocolo da prática de cinética enzimática 
Em seguida,a placa de 96 poços foi levada ao leitor de ELISA. Neste aparelho 
foi realizada a leitura da absorbância a 405 nm da solução final do meio reacional por 
60 minutos, onde uma leitura era feita a cada 3 minutos, totalizando 21 leituras. No 
tubo branco o meio reacional foi o mesmo, porém a enzima não foi adicionada. 
Obs: Vale ressaltar que todos os grupos utilizaram a mesma placa de 96 poços 
para a realização do experimento. O relatório em questão diz respeito à solução que se 
encontrava no poço identificado como A3. 
 
3.2.3. Influência da temperaturaCom o auxílio de pipeta e pró-pipete, foram transferidas alíquotas das soluções 
indicadas para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo: 
 
Tabela 3 - Relação dos tubos e suas respectivas alíquotas de tampão, PNPP, temperatura, 
enzima e NaOH 
Tubo 
 nº 
Tampão 
Tris-HCl 
pH 9,5 (​μ​L) 
PNPP 
1 mM 
(​μ ​L) 
Temperatura
(ºC) 
Enzima 
(​μ​L) 
Solução de 
NaOH 
(​μ ​L) 
1B 500 250 4 50 200 
1 500 250 4 50 200 
2B 500 250 Ambiente 50 200 
2 500 250 Ambiente 50 200 
3B 500 250 37 50 200 
3 500 250 37 50 200 
4B 500 250 68 50 200 
4 500 250 68 50 200 
Fonte: Protocolo da prática de cinética enzimática 
Antes de adicionar a solução de enzima, todos os tubos foram pré-incubados 
aos pares durante 5 minutos nas temperaturas indicadas e em seguida, com o auxílio 
de um pipetador automático, a da solução da enzima foi transferida a todos os tubos 
(exceto aos tubos brancos) em intervalos de 1 minuto, com a determinação do horário 
exato de início do ensaio. Após isso, os tubos foram homogeneizados manualmente e 
então foram incubados em suas respectivas temperaturas por 15 minutos. Em seguida, 
a reação foi paralisada adicionando NaOH 2M aos tubos de 1 a 4 em intervalos de 1 
minuto, e posteriormente, aos tubos brancos. Finalmente, foram transferidas alíquotas 
da solução de enzima para os tubos brancos. 
Por fim, 200​μ​L de cada solução foram transferidos para uma placa de 96 
poços e esta foi levada ao leitor de ELISA. Neste aparelho foi realizada a leitura da 
absorbância a 405 nm de cada um dos tubos, utilizando cada tubo branco (B) como 
referência de calibração. 
Obs: Vale ressaltar que para os tubos brancos (xB), o meio reacional para que 
a enzima seja introduzida no tubo já deve conter a solução de NaOH 2M. Ou seja, as 
soluções da enzima já foram introduzidas em meios onde não ocorreriam reação 
alguma. 
 
 
3.2.4. Curva de substrato e influência do inibidor 
Com o auxílio de pipeta e pró-pipete, foram transferidas alíquotas das soluções 
indicadas para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo: 
 
Tabela 4 - Relação dos tubos e suas respectivas alíquotas de soluções tampão, PNPP, enzima e 
NaOH sem inibidor 
Tubo 
nº 
Tampão 
Tris-HCl pH 9,5
(​μ​L) 
PNPP 
1mM 
(​μ​L) 
Enzima 
(​μ​L) 
Solução de 
NaOH 
(​μ​L) 
B 725 25 50 200 
1 725 25 50 200 
2 700 50 50 200 
3 675 75 50 200 
4 650 100 50 200 
5 600 150 50 200 
6 550 200 50 200 
7 500 250 50 200 
8 450 300 50 200 
9 375 375 50 200 
10 300 450 50 200 
11 225 525 50 200 
12 150 600 50 200 
13 75 675 50 200 
Fonte: Protocolo da prática de cinética enzimática 
Com o auxílio de um pipetador automático, a da solução da enzima foi 
transferida a todos os tubos (exceto ao tubo branco) em intervalos de 1 minuto, com a 
determinação do horário exato de início do ensaio. Quando o cronômetro atingiu os 
15 minutos, as reações foram paralisadas com a adição de NaOH 2M também com 
intervalos de 1 minuto de adição a cada tubo. 
Em seguida, 200​μ​L de cada solução foram transferidos para uma placa de 96 
poços e esta foi levada ao leitor de ELISA. Neste aparelho foi realizada a leitura da 
absorbância a 405 nm de cada um dos tubos, utilizando cada tubo branco (B) como 
referência de calibração. 
Obs: Vale ressaltar que para o tubo branco (B), o meio reacional para que a 
enzima seja introduzida no tubo já deve conter a solução de NaOH 2M. Ou seja, a 
solução da enzima já foi introduzida em um meio onde não ocorreria reação alguma. 
 
Já para verificar a influência do inibidor, com o auxílio de pipeta e pró-pipete 
foram transferidas alíquotas das soluções indicadas para tubos de ensaio devidamente 
rotulados segundo a tabela abaixo: 
 
Tabela 5 - Relação dos tubos e suas alíquotas de tampão, PNPP, inibidor, enzima e solução de 
NaOH 
Tubo 
nº 
Tampão 
Tris-HCl pH 
9,5 
(​μ​L) 
PNPP 1mM 
(​μ​L) 
Inibidor 
(​μ​L) 
Enzima 
(​μ​L) 
Solução de 
NaOH 
(​μ ​L) 
 
B 650 25 75 50 200 
1 650 25 75 50 200 
2 625 50 75 50 200 
3 600 75 75 50 200 
4 575 100 75 50 200 
5 525 150 75 50 200 
6 475 200 75 50 200 
7 425 250 75 50 200 
8 375 300 75 50 200 
9 300 375 75 50 200 
10 225 450 75 50 200 
11 150 525 75 50 200 
12 75 600 75 50 200 
13 0 675 75 50 200 
Fonte: Protocolo da prática de cinética enzimática 
Após o preparo do meio reacional com a presença do inibidor, foram 
transferidas alíquotas da solução de enzima para cada um dos tubos indicados, com 
exceção do tubo branco (B), em intervalos de 1 minuto. Quando o cronômetro atingiu 
os 15 minutos, as reações foram paralisadas com a adição de NaOH 2M também com 
intervalos de 1 minuto de adição a cada tubo. 
Em seguida, 200​μ​L de cada solução foram transferidos para uma placa de 96 
poços e esta foi levada ao leitor de ELISA. Neste aparelho foi realizada a leitura da 
absorbância a 405 nm de cada um dos tubos, utilizando cada tubo branco (B) como 
referência de calibração. 
Obs: Vale ressaltar que para o tubo branco (B), o meio reacional para que a 
enzima seja introduzida no tubo já deve conter a solução de NaOH 2M. Ou seja, a 
solução da enzima já foi introduzida em um meio onde não ocorreria reação alguma. 
 
4. Resultados 
4.1. Curva Padrão de PNP 
A tabela abaixo indica a concentração final das soluções presentes em cada tubo e 
suas respectivas absorbâncias medidas no leitor de ELISA. 
Tabela 6 - Relação dos tubos e suas concentrações de PNP e absorbância 
Tubo nº Concentração de PNP 
(nM) 
Absorbância (450nm) 
1 7500 0,0629 
2 15000 0,1384 
3 22500 0,2184 
4 30000 0,2666 
5 37500 0,3642 
6 45000 0,3977 
7 52500 0,4815 
Fonte: Elaborada pelo autor 
O valor concentrações foi calculado aplicando o fator de correção determinar a 
concentração final das soluções após o experimento, para isso, foi aplicado a seguinte 
equação: 
0,1.V1=C2.1000 
Onde: 
0,1 = concentração inicial da solução em mM; 
V1 = volume inicial da solução de PNP em cada tubo em μL; 
C2 = concentração final a ser descoberta em mM; 
1000 = volume final em μL. 
Descoberta a concentração final de cada solução, a mesma foi multiplicada por 10​6 ​e 
então convertida em nM. 
A partir desses valores, a seguinte curva padrão foi gerada: 
Gráfico 7 - curva padrão de PNP 
 
Fonte: Elaborado pelo autor 
O cálculo de R​2 foi mostrado no mesmo para que se informe o quanto o modelo 
(gráfico) se adequa a amostra (experimento). Um valor de 0,9933 indica que o modelo 
consegue explicar a amostra em 99,33%. 
Gerada a equação da reta ​y = 9,1438.106x + 0,0014​, a mesma foi utilizada para os 
cálculos das práticas seguintes. 
 
4.2. Curso Temporal 
O procedimento feito para a confecção do curso temporal gerou os seguintes 
resultados: 
Tabela 7- Tabela da relação entre o tempo, o valor do branco, absorbância, absorbância corrigida e concentração 
de PNP 
Tempo 
(min) 
Branco Absorbância 
(405 nm) 
Absorbância 
Corrigida (405 nm) 
Concentração de PNP 
(nM) 
0 0,063 0,0750,012 1476 
3 0,080 0,122 0,042 4735 
6 0,079 0,153 0,074 8268 
9 0,079 0,190 0,111 12303 
12 0,091 0,226 0,135 14950 
15 0,106 0,263 0,157 17356 
18 0,086 0,298 0,212 23327 
21 0,083 0,331 0,247 27199 
24 0,091 0,357 0,266 29266 
27 0,091 0,391 0,299 32897 
30 0,102 0,413 0,311 34209 
33 0,097 0,444 0,347 38113 
36 0,101 0,471 0,370 40618 
39 0,091 0,490 0,399 43735 
42 0,109 0,515 0,406 44533 
45 0,116 0,540 0,425 46578 
48 0,114 0,563 0,448 49192 
51 0,108 0,585 0,477 52320 
54 0,101 0,623 0,522 57241 
57 0,098 0,638 0,540 59199 
60 0,108 0,647 0,540 59188 
 Fonte: Elaborada pelo autor 
A absorbância foi corrigida subtraindo a medida do branco correspondente à cada 
valor. Esse procedimento é necessário pois como o PNPP é muito fotossensível e uma 
quantidade considerável é hidrolisada pela luz e não reage na solução. Portanto, essa 
subtração de valores desconta a porção de substrato que sofre hidrólise. 
Os valores de concentração de produto formado (PNP) foram calculados através da 
equação da reta determinada na prática anterior, em que foi gerada a curva padrão. O cálculo 
foi feito da seguinte forma: 
Dada a equação da reta ​y = 9,1438.106x + 0,0014; 
Onde ​y = absorbância medida em cada minuto; 
O valor da concentração de PNP respectiva equivale a ​x​. 
A partir desses valores, o seguinte gráfico de [PNP] por tempo foi gerado: 
Gráfico 8 - curso temporal por concentração de PNP 
 
Fonte: Elaborado pelo autor 
A tangente que inicia no ponto (0,0) e abrange a maior quantidade de pontos em linha 
reta possíveis indica o intervalo de V​0​, que é de aproximadamente 30 minutos. 
Com a determinação de V​0​ foi escolhido metade desse valor, ou seja, 15 minutos, para 
que se pudesse ter a garantia de que a realização das práticas seguintes de cinética enzimática 
fosse feita dentro do intervalo da velocidade inicial. 
 
4.3. Influência da temperatura 
A prática da influência da temperatura gerou os seguintes resultados: 
Tabela 8 - Relação dos tubos, temperatura, absorbância, absorbância corrigida, concentração de PNP e V0 
Tubo nº Temperatura 
(°C) 
Absorbância 
(405nM) 
Abs. 
Corrigida 
(405nm) 
Concentração de 
PNP (nM) 
V0 
(nM/min) 
1B 4 0,125 
1 4 0,149 0,024 2778 185 
2B 30 (ambiente) 0,134 
2 30 (ambiente) 0,234 0,1 11089 739 
3B 37 0,136 
3 37 0,283 0,147 16230 1082 
4B 68 0,147 
4 68 0,211 0,064 7152 477 
Fonte: Elaborada pelo autor 
A absorbância corrigida foi calculada subtraindo o valor do branco da absorbância 
medida das soluções de cada um dos tubos para que concentrações de PNPP hidrolisadas pela 
luz fossem descartadas. 
Da mesma forma que a prática do curso temporal, a concentração de produto (PNP) 
foi encontrada a partir da equação da reta gerada na curva padrão, substituindo os valores de ​y 
pela absorbância corrigida e encontrando a concentração desejada no valor de ​x​. 
Como cada procedimento foi realizado em 15 minutos, o valor da velocidade das 
reações (V​0​) foi calculado dividindo os valores encontrados da concentração de PNP de cada 
tubo por 15. 
A partir desses valores, têm-se o seguinte gráfico de V ​0​ pela temperatura: 
Gráfico 9 - V​0​ pela temperatura 
 
Fonte: Elaborado pelo autor 
4.4. Curva de substrato e influência do inibidor 
Neste procedimento, os meios reacionais foram preparados da mesma forma, porém, 
em um deles foi inserido um inibidor. Foram geradas as seguintes tabelas para cada um dos 
experimentos: 
Meio sem inibidor: 
Tabela 9 - relação dos tubos, volume de PNPP e concentração corrigida de PNPP 
Tubo Volume PNPP (μL) Concentração Corrigida PNPP 
(mM) 
B 25 0,025 
1 25 0,025 
2 50 0,05 
3 75 0,075 
4 100 0,1 
5 150 0,15 
6 200 0,2 
7 250 0,25 
8 300 0,3 
9 375 0,375 
10 450 0,45 
11 525 0,525 
12 600 0,6 
13 675 0,675 
Fonte: Elaborada pelo autor 
Tabela 10 - Relação dos tubos sem inibidor, absorbância, absorbância corrigida, concentração de PNP e V0 
Tubo 
nº 
Absorbância 
(405nm) 
Abs. 
Corrigida 
(405nm) 
Concentração de 
PNP (nM) 
V0 (nM/min) 
B 0,064 
1 0,118 0,054 13058 871 
2 0,153 0,089 16886 1126 
3 0,19 0,126 20932 1395 
4 0,207 0,143 22791 1519 
5 0,228 0,164 25088 1673 
6 0,251 0,187 27603 1840 
7 0,267 0,203 29353 1957 
8 0,293 0,229 32197 2146 
9 0,307 0,243 33728 2249 
10 0,372 0,308 40836 2722 
11 0,338 0,274 37118 2475 
12 0,367 0,303 40290 2686 
13 0,375 0,311 41165 2744 
Fonte: Elaborada pelo autor 
Meio com inibidor 
Tabela 11 - Relação dos tubos com inibido, volume de PNPP e concentração corrigida de PNPP 
Tubo Volume PNPP (μM) Concentração Corrigida PNPP 
(mM) 
B 25 0,025 
1 25 0,025 
2 50 0,05 
3 75 0,075 
4 100 0,1 
5 150 0,15 
6 200 0,2 
7 250 0,25 
8 300 0,3 
9 375 0,375 
10 450 0,45 
11 525 0,525 
12 600 0,6 
13 675 0,675 
Fonte: Elaborada pelo autor 
Tabela 12 - Relação dos tubos com inibidor, absorbância, absorbância corrigida, concentração de PNP e V0 
Tubo 
nº 
Absorbância 
(405nm) 
Abs. 
Corrigida 
(405nm) 
Concentração de 
PNP (nM) 
V0 (nM/min) 
B 0,054 
1 0,075 0,021 2450 163 
2 0,091 0,037 4200 280 
3 0,108 0,054 6059 404 
4 0,115 0,061 6824 455 
5 0,143 0,089 9886 659 
6 0,159 0,105 11636 776 
7 0,188 0,134 14808 987 
8 0,189 0,135 14917 994 
9 0,219 0,165 18198 1213 
10 0,235 0,181 19948 1330 
11 0,252 0,198 21807 1454 
12 0,269 0,215 23666 1578 
13 0,281 0,227 24979 1665 
Fonte: Elaborada pelo autor 
Em ambos os experimentos, a concentração de substrato precisou ser corrigida e para 
isso foi aplicada a seguinte equação: 
1,0.V1 = C2.1000 
Onde: 
1,0 = concentração inicial da solução em mM; 
V1 = volume inicial da solução de PNPP em cada tubo em μL; 
C2 = concentração final a ser descoberta em mM; 
1000 = volume final em μL. 
 
Após a aferição das absorbâncias respectivas de cada tubo, também foi necessária a 
correção das mesmas subtraindo o branco de cada um dos valores. E, além disso, novamente 
a equação da reta da curva padrão foi usada para determinar os valores de PNP de cada 
solução, onde o valor de ​y foi substituído pela absorbância corrigida para que se pudesse 
encontrar a concentração de PNP formado no valor de ​x​. 
Com esses valores em mãos, a velocidade de reação de cada tubo foi calculada 
dividindo [PNP] de cada um deles por 15. A partir disso, foram criadas as curvas de 
Michaelis de V​0 pela concentração de substrato para cada um dos dois experimentos e 
colocadas no gráfico que segue: 
Gráfico 10 - Curva de Michaelis para substrato e substrato + inibidor 
 
Fonte: Elaborado pelo autor 
 
4.5. Gráfico de Lineweaver-Burk (duplo-recíproco) 
A partir dos valores de V​0​ e [S] da prática anterior, foi feita uma inversão dos mesmos 
a fim de criar um gráfico duplo-recíproco para as duas reações enzimáticas. Segue na tabela 
abaixo o resultado desses valores inversos. 
Tabela 13 - Relação dos resultados dos valores inversos 
1/[S] 
(1/mM) 
1/V0 sem 
inibidor 
(1/nM.min​-1​) 
1/V0 com 
inibidor 
(1/nM.min​-1​) 
40,00 0,001149 0,00612 
20,00 0,000888 0,00357 
13,33 0,000717 0,00248 
10,00 0,000658 0,00220 
6,67 0,000598 0,00152 
5,00 0,000543 0,00129 
4,00 0,000511 0,00101 
3,33 0,000466 0,00101 
2,67 0,000445 0,00082 
2,22 0,000367 0,00075 
1,90 0,000404 0,00069 
1,67 0,000372 0,00063 
1,48 0,000364 0,00060 
Fonte: Elaborada pelo autor 
Para que o gráfico pudesse ser melhor observado, alguns valores foram eliminados de 
modo que compreendesse uma área com maior quantidade de pontos, gerando a seguintetabela reduzida: 
Tabela 14 - tabela reduzida 
1/[S] 
(1/mM) 
1/V0 sem 
inibidor 
(1/nM.min​-1​) 
1/V0 com 
inibidor 
(1/nM.min​-1​) 
5,00 0,0005434 0,001289 
4,00 0,0005110 0,001013 
3,33 0,0004659 0,001006 
2,67 0,0004447 0,000824 
2,22 0,0003673 0,000752 
1,90 0,0004041 0,000688 
1,67 0,0003723 0,000634 
1,48 0,0003644 0,000601 
Fonte: Elaborada pelo autor 
A partir dessa tabela, foi criado o seguinte gráfico: 
Gráfico 11 - Duplo recíproco reduzido 
 
Fonte: Elaborado pelo autor 
Com a utilização da equação da reta de ambas as reações, calculou-se -1/K​m e 1/V ​máx 
para determinar em que pontos as retas cortam os eixos ​x e ​y​, respectivamente. Esses cálculos 
foram feitos da seguinte forma: 
Dada uma equação da reta ​y = ax + b 
Para ​x​ = 0, então ​y​ = ​b ​; 
Para ​y​ = 0, então ​x​ = ​-b/a​. 
Logo, 
para a reação sem inibidor: -1/K​m​ = -6 (1/mM) e 1/V​máx​ = 0,0003 (1/nM.min​-1​); 
para a reação com inibidor: -1/K​m​ = -1,5 (1/mM) e 1/V​máx​ = 0,0003 (1/nM.min​-1​). 
 
Com esses valores em mãos, foi construído o seguinte gráfico duplo-recíproco em 
papel milimetrado: 
[O gráfico segue em anexo ao fim do relatório.] 
A partir dos resultados de 1/K​m​ e 1/V​máx​, pôde ser calculado seus valores reversos (K​m 
e V​máx​) a partir dos seguintes cálculos: 
Para a reação sem inibidor: 
V​máx​ = 1/0,0003 = 3333,3 nM.min​-1 
K​m​ = -1/-6 = 0,1667 mM 
Para a reação com inibidor: 
V​máx​ = 1/0,0003 = 3333,3 nM.min​-1 
K​m ​= -1/-1,5 = 0,667 mM 
 
 
 
5. Discussão 
5.1. Curva padrão de PNP 
Para todo ensaio enzimológico é necessária uma curva padrão a partir da qual se pode 
extrair os dados básicos para qualquer ensaio que se faça com a enzima escolhida. A curva 
padrão de PNP foi construída com auxílio do software Microsoft Excel, com o objetivo de se 
estabelecer uma relação entre a absorbância e a concentração de produto formado pela 
atividade enzimática. 
A partir da equação dessa curva é possível medir a concentração de PNP formado 
para cada uma das absorbâncias dos ensaios realizados. O PNP utilizado já havia sido 
produzido por reação enzimática previamente aos ensaios. Como esperado de uma curva 
padrão, quanto maior o volume de PNP padrão utilizado, mais forte era a coloração amarela 
da reação e maior era a absorbância. A fotossensibilidade do PNP pode explicar possíveis 
erros na curva padrão. 
5.2. Curso temporal 
Além da construção de uma curva padrão, é necessária a construção de uma curva que 
relacione a quantidade de produto formado em relação ao tempo de reação. Nessa curva é 
possível verificar até que ponto tem-se um total de produto formado baixo o suficiente a fim 
de evitar que a formação excessiva de produtos no meio agisse de maneira antagônica à ação 
da enzima, revertendo a reação (produto retornando ao estado de substrato) ou até mesmo 
causando uma possível inibição; é nesse ponto que obtém-se V​0​, ou seja, a velocidade na qual 
a reação chega a esse ponto. 
Ao observar o gráfico, é possível perceber que a reação mantém uma linearidade 
significamente estável até os 30 minutos. A partir desse valor, estabeleceu-se que 15 minutos 
seria o tempo ideal para a realização dos diferentes experimentos seguintes, de forma que 
esse intervalo de tempo atenderia às condições de linearidade das reações seguintes. 
5.3. Influência da temperatura 
A atividade enzimática à temperatura ambiente não foi muito diferente do que a 37ºC, 
como mostram os valores próximos de absorbância (0,1 e 0,147, respectivamente). No 
entanto a temperatura de 37º se mostrou a melhor. Isso possivelmente se dá por ser próxima à 
temperatura fisiológica, sendo a fosfatase alcalina utilizada em diversas reações metabólicas 
do organismo. 
As temperaturas extremas de 4ºC e 69ºC apresentaram baixos valores de absorbância 
(0,024 e 0,064, respectivamente), evidenciando baixa atividade enzimática por pouco produto 
formado. A temperatura de uma solução afeta a energia cinética interna da solução. Na 
temperatura de 4ºC, a reação torna-se extremamente lenta devido à baixa energia cinética, 
porém ainda ocorre. 
O maior grupo de enzimas são proteínas, ou seja, ainda estão sujeitas à desnaturação. 
Portanto, a temperatura de 68°C é alta suficiente para que haja alguma mudança 
conformacional principalmente do sítio catalítico enzimático, proporcionando a diminuição 
da sua atividade. 
5.4. Curva de substrato e influência do inibidor 
A curva de substrato, conhecida como curva de Michaelis Menten, é importante para 
que se possa inferir algumas características sobre qualquer enzima em um ensaio 
enzimológico. A partir dela, é possível construir um gráfico duplo-recíproco (gráfico de 
Lineweaver-Burk) e dele tirar informações essenciais para a realização de uma análise mais 
específica sobre as enzimas: os valores de V​máx​ e de K ​m​. 
Na prática realizada, a enzima fosfatase alcalina foi introduzida em um meio onde não 
havia presença de inibidor e em um outro meio onde foi introduzido o inibidor. Nos dois 
meios, a partir da análise do gráfico e realizando os cálculos necessários, obteve-se o mesmo 
valor de V​máx (aproximadamente 3333,3 µM/min), porém os valores de K ​m apresentaram 
alteração. 
No primeiro meio, sem inibidor, K ​m foi equivalente a aproximadamente 0,167mM 
enquanto que no segundo meio, com inibidor, esse valor foi equivalente a aproximadamente 
0,67mM. Tais valores indicam o tipo de inibição causado pelo inibidor utilizado, que se 
caracteriza por ser do tipo competitiva. O aumento de K​m indica a necessidade de uma maior 
concentração de substrato para atingir a mesma velocidade máxima do meio sem inibidor. O 
valor de V​máx​ inalterado indica uma saturação enzimática idêntica nas duas ocasiões. 
 
6. Referências Bibliográficas 
1. KAMP, Fernanda. ​Enzimas​. 2019. 27 slides. 
2. KAMP, Fernanda. ​Cinética Enzimática​. 2019. 65 slides. 
3. NELSON, David L.; COX, Michael M. ​Princípios de Bioquímica de Lehninger. 
São Paulo: ARTMED EDITORA LTDA, 2014. 
4. BERG, Jeremy M.; STRYER, Lubert; TYMOCZKO, John L. ​Bioquímica.​ 7. ed. Rio 
de Janeiro: Guanabara Koogan, 2014 
5. Atividade Enzimática​. Disponível em: < 
http://www.ufrgs.br/alimentus1/pao/ingredientes/ing_enzimas_atividade.htm​>. Acesso em: 
18 mai. 2019 
6. Reversible Inhibition ​. Disponível em: < 
https://biochemanics.wordpress.com/2013/04/07/reversible-inhibition/​>. Acesso em: 18 
mai. 2019 
7. Fosfatase Alcalina​. Disponível em: 
<​https://www.infoescola.com/bioquimica/fosfatase-alcalina/​>. Acesso em: 18 mai. 2019