Análise da presença de vírus em alho semente da segunda e quarta gerações, produzidos por termoterapia e cultura de tecido.

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Universidade Federal do Ceará
Departamento de Fitotecnia
AC0496 – Fitopatologia II
Profa. Dra. Carmen Dolores Gonzaga Santos
Danilo Domingos Fonseca Teófilo
Luiza Letícia Mendonça Maciel
Análise da presença de vírus em alho semente da segunda e quarta gerações, produzidos por termoterapia e cultura de tecido.
Autores: Milena Leite de Oliveira, João Paulo Calore Nardini, Bruno Rossito De Marchi, Tatiana Mituti, Daiana Bampi, Marcelo Agenor Pavan, Renate Krause-Sakate.
ALHO (Allium sativum L.)
 Família Alliaceae;
 Origem Asiática;
 Condições ideiais;
 Reprodução assexuada;
 Importância da cultura.
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 Cenário mundial: 
 CHINA: 90% da produção
 Brasil é o 10º maior produtor (FAO 2013) e o 3º maior importador;
 Importações: China e Argentina
 Cenário brasileiro: 
ALHO (Allium sativum L.)
IBGE 2015
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AS VIROSES
 
 No Brasil, 7 espécies relatadas pertencentes aos gêneros: Allexivirus, Potyvirus e Carlavirus (FAJARDO et al., 2001; MELO FILHO et al., 2006; MITUTI et al., 2011)
 Degenerescência do alho-semente, causando a queda gradativa do vigor vegetativo, do potencial produtivo e da qualidade dos bulbos ao longo das gerações de cultivo (FERNANDES et. al, 2013)
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OS VÍRUS
 Família Potyviridae;
 Partícula alongada flexível;
 RNA fita simples;
 Causam reduções na massa e no perímetro de bulbos, que se acentuam quando associados a outras espécies virais (Takaichi et al., 2001)
 
POTYVIRUS
- Onion yellow dwarf virus (OYDV)
- Leek yellow stripe virus (LYSV)
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OS VÍRUS
 Família Betaflexiviridae;
 Partícula alongada flexível;
 RNA fita simples;
 Isoladamente, são considerados de pouca importância econômica. (Dovas et al., 2001)
CARLAVIRUS
- Garlic common latent virus (GarCLV) 
- Shallot latent virus (SLV)
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OS VÍRUS
 Família Alphaflexiviridae;
 Partícula alongada flexível;
 RNA fita simples;
 Hospedeiros naturais restritos às espécies do gênero Allium;
 Causam danos maiores à produção do alho quando infectam em combinação com Potyvirus (Takaichi et al., 2001).
ALLEXIVIRUS
- Garlic miteborne filamentous virus (GarMbFV)
- Garlic virus C (GarV-C)
- Garlic virus D (GarV-D)
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MOSAICO
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Disseminação virótica
Propagação vegetativa dos bulbilhos
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DISSEMINAÇÃO VIRÓTICA
Pulgões
Carlavirus e Potyvirus – Aphis gossypii, Myzus persicae e Neotoxoptera formosana
Ácaro
Allexivirus – Aceria tulipae;
Relação vírus-vetor do tipo não circulativa semi-persistente
Relação vírus-vetor do tipo não circulativo não persistente
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CONTROLE
 Obter material propagativo sadio;
 Termoterapia e cultura in vitro;
 Imergir bulbilhos em acaricida (para A. tulipae);
 Armadilhas adesivas para monitoramento de pulgões;
 Armazenamento em boas condições.
NÃO HÁ MEDIDAS EFETIVAS DE CONTROLE DE DOENÇAS VIRÓTICAS EM ALHO, SENDO NECESSÁRIAS MEDIDAS PREVENTIVAS E GERAIS DE MANEJO DA CULTURA. (MURASHIGE, T; SKOOG, F., 1962)
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objetivo
 Realizar um levantamento criterioso da sanidade vegetal dos alhos produzidos na FCA-UNESP de Botucatu, através da associação de termoterapia e cultura de tecido. 
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Materiais e métodos - OBTENÇÃO DE ALHO LIVRE DE VÍRUS (LV) 
1. Termoterapia de bulbilhos 
48º a 50ºC/30min;
2. Cultivo in vitro de ápices caulinares em meio sólido Murashige e Skoog + fitorregulador BA 2 mg/L; 
3. Microbulbilhos multiplicados em casa de vegetação por 3 anos;
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Materiais e métodos - OBTENÇÃO DE ALHO LIVRE DE VÍRUS (LV) 
4. Folhas de cada planta coletadas para indexação por análises moleculares;
5. Alho-semente LV multiplicado sucessivamente por 2 gerações em condições de telado e campo.
Altitude > 1000 m e ausência de plantio comercial próximo;
6. 175 plantas mantidas em CV foram coletadas para extração total de RNA e análise de RT-PCR. 
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Materiais e métodos - OBTENÇÃO DE ALHO LIVRE DE VÍRUS (LV) 
 RT-PCR 
 Reação da Transcriptase Reversa, seguida da Reação em Cadeia da Polimerase.
 A partir do RNA viral, a enzima RT sintetiza uma cadeia de DNA complementar (cDNA). 
 PCR - Reação enzimática in vitro que amplifica milhares de vezes uma sequência específica de DNA; 
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Materiais e métodos - OBTENÇÃO DE ALHO LIVRE DE VÍRUS (LV)
Etapas PCR
ALLEXIVIRUS
POTYVIRUS
CARLAVIRUS
CICLOS
Desnaturação
Anelamento
Extensão
40 ciclos
94ºC/40 s
50ºC/50 s
72ºC/40 s
35 ciclos
94ºC/30 s
54ºC/45 s
72ºC/55 s
40 ciclos
94ºC /60 s
50ºC/60 s
72ªC/60 s
ELETROFORESE
250bp
800 a 1000bp
360bp
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Resultados e discussão ano 2010
 Bulbos da 2ª geração analisados para a presença dos 3 gêneros estudados:
 75 amostras 
 Allexivirus – 6,6% das plantas
33 em telado anti-afídico
42 em casa de vegetação 
5 + para Allexivirus
0 para Potyvirus
0 para Carlavirus
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Resultados e discussão ano 2012
 Bulbos da 4ª geração analisados para a presença dos 3 gêneros estudados:
 100 amostras 
60% para Allexivirus
35% para Potyvirus
0 para Carlavirus
Por que houve alta taxa de infecção por Allexivirus e Potyvirus? 
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Bulbilhos após aclimatização não foram selecionados para multiplicação comercial.
Seleção para tamanhos do bulbo auxilia na obtenção de bulbos com menores taxas de infecção por vírus.
Transmissão e disseminação por A. tulipae  armazenamento
Condições inadequadas de armazenamento de bulbos: favorecem a proliferação de ácaros, que se desenvolvem sob as escamas dos bulbos e possibilitam a disseminação do vírus.
Resultados e discussão ano 2012
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Resultados e discussão ano 2012
TXi por Potyvirus 4ª geração
Escape do processo de limpeza por TT e CT
Seleção de bulbos maiores e mais vigorosos  menor TXi
Utilização de clones assintomáticos selecionados no campo de produção
Maior capacidade de aclimatização, maior produtividade e melhor qualidade dos bulbos
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Resultados e discussão ano 2012
EFICIÊNCIA DE ELIMINAÇÃO
VERBEEK et. al., 1995
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CONCLUSÃO
 Método satisfatório na eliminação de vírus.
Possibilita escape de Allexivirus e Potyvirus, então é necessária a realização sistemática de testes para a presença dos vírus durante a propagação do alho-semente  Termoterapia + seleção positiva para os bulbilhos de maior tamanho;
Métodos de armazenamento adequados e uso de fumigantes no alho-semente armazenado  evitar transmissão de Allexivirus por A. tulipae;
Utilização de inibidores virais para reduzir transmissão viral durante a cultura de tecidos.
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Dúvidas?
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extra
 Tratamento de Termoterapia e Cultura de tecidos vs. Testemunha;
 110 dias.
 https://www.youtube.com/watch?v=yZTN-e4EA3M
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