meio de cultura

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Prática 2: Cultura de Microrganismos 
 
Introdução 
Os microrganismos tal como outros organismos vivos necessitam de obter os 
nutrientes apropriados do seu meio ambiente. Assim se queremos cultivar e 
manter microrganismos vivos em laboratório, necessitamos de os colocar em 
meios de cultura, contendo os nutrientes apropriados para o seu crescimento. 
Para além de nutrientes é igualmente necessário que as condições de oxigénio 
(presença ou ausência), pH e pressão osmótica sejam adequadas ao 
crescimento desses microrganismos. 
Na preparação dos meios e na manutenção das culturas de microrganismos é 
importante observar as necessárias condições de assépsia, de modo a se 
evitarem contaminações com outros microrganismos. 
Os meios de cultura dividem-se primeiramente em meios sólidos, aqueles que 
contêm agar, e meios liquidos, sem agar. Ambos os meios são preparados com 
água destilada, aquecidos até que se dissolvam completamente e 
posteriormente esterilizados por autoclavagem a 121oC. 
Nos meios sólidos o crescimento pára por exaustão de nutrientes, devendo 
realizar-se a transferência de colónias para novo meio. No entanto estes meios 
permitem a individualização das colónias. Os meios liquidos permitem 
melhor difusão de metabólitos, mas não o isolamento de colónias. 
Após autoclavagem, os meios sólidos vertem-se em caixas de petri de forma a 
cobrir uniformemente o fundo da caixa e após solidificação guardam-se por 
24h na estufa a 37oC para testar a sua esterilidade e em seguida no frigorifico 
até à altura das sementeiras. Os meios sólidos podem também ser vertidos em 
tubos de ensaio de vidro. Os meios liquidos são mantidos em tubos de ensaio 
de vidro (os meios ditos sólidos estão liquidos quando saiem do autoclave e 
solidificam após o arrefecimento). 
Quanto ao grau nutritivo dos meios de cultura consideram-se: 
meios nutritivos gerais: contendo elementos minerais e metabólitos 
orgânicos. Ex. Agar Nutriente, Caldo Nutriente 
meios enriquecidos: contendo produtos biológicos (sangue, soro), vitaminas. 
Ex: Agar Sangue, meio geral não selectivo. 
meios complexos: contêm todos os ingredientes necessários para o 
crescimento de um determinado microrganismo, mas não se conhecem as 
quantidades exactas de todos os componentes. 
meios definidos: aqueles em que se sabe a concentração exacta dos seus 
componentes. A composição destes meios varia consoante os requisitos dos 
organismos a cultivar. 
Classificam-se ainda os meios em: 
Selectivos, meios para selecção de determinados grupos de bactérias, os quais 
contêm substâncias que inibem o crescimento de outras bactérias distintas 
daquelas que nos interessam (meios sólidos). Ex: Agar Pseudomonas, 
Tiossulfato-citrato-bilis-sacarose (TCBS) para Vibrio, Agar MacConkey para 
coliformes. 
Diferenciais, para identificação de microrganismos, meios sólidos com a 
composição quimica adequada para evidenciar uma caracteristica bioquimica 
(meios sólidos). Ex: MacConkey Agar pª isolamento de coliformes, patogénios 
intestinais na água produtos derivados do leite, e espécimens biológicos. 
Neste agar após 24h a 35oC as colónias de Escherichia coli são vermelhas e 
mucóides, enquanto que as colónias de Salmonella e Shigella são brancas. 
Indicadores, meios liquidos, com a mesma função dos diferenciais, servem 
para evidenciar uma caracteristica bioquímica, mas não para separar as 
colónias positivas e as negativas. O pH do meio é ajustado antes de 
autoclavar. 
A cultura de báctérias é iniciada num meio estéril por transferência de inoculo 
para o meio estéril através de uma ansa. Essa ansa é esterilizada à chama 
antes e depois desta operação. 
Após a inoculação de um meio com bactérias, é necessário incubar o meio 
num ambiente adequado aos requisitos de crescimento dos microrganismos. 
O crescimento de bactérias num meio liquido identifica-se por turvação do 
meio, formação de uma pelicula na sua superficie, ou aparecimento de 
sedimento, enquanto que num meio sólido por aparecimento de colónias. Os 
meios liquidos são designados de caldos (broth). 
Os meios sólidos podem ainda ser vertidos em tubos de ensaio de vidro, os 
quais são inclinados, de modo a que, durante a solidificação do meio, se forme 
um slope ou slant (Fig.1). Este slant oferece uma superficie adequada ao 
cultivo de microrganismos aeróbios e anaeróbios facultativos. 
Para inoculação de microrganismos nestes slants, utiliza-se uma ansa recta e o 
tipo de sementeira chama-se por picada (agar stab) (Fig.1). A sementeira por 
picada faz-se também em meios sólidos mantidos em tubos de vidro sem 
slant. Este tipo de cultura utiliza-se para a manutenção de cultura stocks, em 
meios designados de conservação (3g de Tryptose Soy Broth, TSB; 3g de 
BactoAgar em 100 ml de água destilada, acrescentar 1.5g de NaCl para Vibrio). 
Estas culturas stock são mantidas em laboratório, podendo ser utilizadas para 
experiências. 
As culturas em meio sólido são convenientes para isolamento de colónias de 
bactérias. As colónias de diferentes espécies de bactérias diferem no tamanho, 
forma, textura e cor. A cultura de bactérias em meio sólido faz-se por 
sementeira por "streak" (esgotamento) ou por "pour plate" (incorporação). 
No tipo de cultura por streak, utilizam-se placas de petri com meio sólido e 
faz-se a sementeira com uma ansa esterilizada arrastando a ansa levemente 
sobre o meio (Fig. 2). O objectivo é a obtenção de cólonias isoladas para se 
poderem posteriormente identificar. Após a incubação e havendo crescimento 
devemos observar a forma da colónia, os seus bordos, a cor, se houve 
hémolise (caso de cultura em meios com sangue). 
Na técnica de pour plate, a inoculação do agar é feita antes da sua 
solidificação (no entanto após retirada do meio do autoclave é necessário 
deixá-lo arrefecer até 45oC). Nesta técnica o meio de cultura arrefecido mas 
ainda liquido é misturado com inóculo de bactérias, posteriormente vertido 
em caixas de petri e incubado. Assim as colónias podem desenvolver-se por 
todo o meio (Fig. 3) 
Material e Métodos 
-Balões de fundo chato e pescoço curto 
-Tubos de ensaio de vidro 
-Algodão cardado, gaze, papel de embrulho e fio 
-Caixas petri esterilizadas 
-Balança 
-Placa de aquecimento 
-Goblets e provetas 
-Agar nutriente e caldo nutriente desidratados 
-Água destilada. 
 
Para a preparação dos meios Agar e Caldo Nutriente proceder do seguinte 
modo: 
 
1- Pesar as quantidades dos meios desidratados de acordo com as 
instruções do seu orientador. Diluir o meio desidratado em água 
destilada, mexer bem até dissolver todo o pó. 
2- Cozinhar os meios tendo o cuidado de agitar os balões de quando em 
quando, de modo a que permanecem com aspecto homogéneo e não se 
formem grânulos. 
3- Após o cozimento rolhar os balões de Agar Nutriente com rolha 
confeccionada com algodão cardado e gaze. Envolver a rolha após 
colocada com papel de embrulho e amarrar bem com o fio de 
embrulho. 
4- Dispender o Caldo Nutriente por tubos de ensaio até metade do tubo e 
igualmente rolhar os tubos com algodão cardado. 
5- Leve os balões de Agar Nutriente e os tubos do Caldo Nutriente a 
autoclavar por 15 minutos à temperatura de 1210C. 
6- Após a esterilização retire os meios da autoclave. Deixe arrefecer o 
Agar Nutriente até cerca de 450C. Em seguida dispense o meio em 
caixas de petri esterilizadas, cerca de 20ml em cada uma delas. O 
procedimento será o seguinte: abra a tampa ligeiramente, verta a 
quantidade necessária de meio, feche a tampa e movimente a caixa de 
modo a espalhar o meio homogéneamente por todo o seu fundo. Deixe 
o meio solidificar . 
7- Inverta as caixas, identifique-as com data e tipo de meio e incube por 
48h a 370C para a prova de esterilidade. Incube também os tubos de 
Caldo Nutriente. 
8- Guarde todos os meios após a prova de esterilidade no frigorífico,até a 
próxima aula prática. 
9- Trabalhe sempre junto da chama da lamparina ou Bunsen 
 
Na aula seguinte poderá analisar os meios e verificar se efectivamente estão 
estéreis. Será então possivel elaborar o seu relatório sobre preparação de 
meios de cultura e esterilização. 
 
Bibliografia de apoio: 
 
Seeley, H.W. Jr., VanDemark, P.J., Lee, J.J. (1991). Microbes in action. W.H. 
Freeman & Company, New York: chapter 8 & 9. 
 
DIFCO Manual: pp. 4-16 
Anexos: 
 
 
 
Figura 1 & 2: (1) “Slope” ou “Slant de Agar”; (2) Sementeira por esgotamento 
(Streak Plate) (a). Retirado de Black, 2002. 
 
 
Figura 3: Sementeira por incorporação (Pour-Plate) e por espalhamento 
(Spread-Plate). Retirado de Black, 2002.