Estudo das Enzimas Amilolíticas

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTO
TRANSFORMAÇÕES BIOQUÍMICAS – TA 610 
Estudo do Modo de Ação e Aplicações das Enzimas Amilolíticas
Introdução
	O amido é um polissacarídeo composto de unidades de D-glicose unidas por ligações -1,4 e -1,6 glicosídicas. O amido usualmente é composto de cerca de 75% de amilopectina (um polímero altamente ramificado) e 25% de amilose (um polímero essencialmente linear). É encontrado em tubérculos, raízes, caules e frutas, na forma de grânulos. Variedades de amido ceroso (milho, arroz e sorgo) contem alto teor de amilopectina (98%) e algumas variedades de amido de milho contem alto teor de amilose (cerca de 50-70%). 
	Cada tipo de amido apresenta uma faixa de temperatura de gelificação característica que corresponde viscosidade máxima quando a suspensão de amido em água submetida a aquecimento. 
Nesta aula serão estudadas as enzimas amilolíticas -amilase fúngica, -amilase bacteriana e glucoamilase fúngica.
A -amilase (-1,4-glucano-4-glucanohidrolase) é encontrada em plantas, tecidos de mamíferos e micro-organismos. A -amilase atua como uma endoenzima, de forma aleatória diminuindo rapidamente a viscosidade da suspensão de amido e o poder de coloração com solução de iodo. 
A -amilase fúngica é termossensível, sendo inativada em temperaturas superiores a 70ºC, sendo adequada para hidrólise parcial do amido em produtos de panificação. A -amilase bacteriana de Bacillus licheniformis é termorresistente, sendo estável a temperaturas de 103ºC por 100 minutos em pH 6,5 e na presença de 70 ppm de Ca+2. Esta última é utilizada para liquefação do amido e produção de maltodextrina.
A glicoamilase hidrolisa as ligações -1,4, -1,6 glicosídicas do amido e derivados, a partir da extremidade não redutora, liberando unidades de glicose. Em alta concentração de glicose a glicoamilase catalisa a síntese de isomaltose e panose. A glicoamilase é utilizada na produção de glicose a partir de amido liquefeito.
Material: 
· Amido de mandioca, batata ou milho ( Cada grupo testará 1 amido.)
· -amilase bacteriana Termamyl 2X (Solicitar a -amilase para as técnicas ou monitoras do laboratório )
· Solução de iodo diluída (2mL de solução de Iodo-KI estoque e 20g KI completar o volume em 500 com água destilada) 
· Amostras de alimentos contendo derivados de amido
Objetivos: 
· Identificar o tipo de amido através da observação dos grânulos em microscópio e determinar a temperatura de gelificação do amido (batata, milho ou mandioca) (Item I). 
· Testar a liquefação do amido usando -amilase bacteriana (Item II).
· Analisar os açúcares redutores revelados no papel de Cromatografia das amostras de amido hidrolisado com enzimas amilolíticas (Será fornecida Cópia do Papel de Cromatografia) (Item III). 
· Anotar os produtos derivados de amido de alguns alimentos (Item IV).
Procedimento:
	
	Procedimento
	Grupos 1, 4, 7, 10, 13
	Utilizar amostra de amido I
	Grupos 2, 5, 8, 11, 14
	Utilizar amostra de amido II
	Grupos 3, 6, 9, 12
	Utilizar amostra de amido III
	
	
	Aluno 1
	Testar item I
	Aluno 2 
	Testar Item II
	Aluno 3
	Item IV
	Alunos 1, 2 e 3
	Analisar cromatograma de açúcares(Item III)
 (
I 
- 
Examinar a forma dos grânulos de amido em microscópio e determinar a temperatura de gelificação de suspensão de amido.
)
a) Pesar 30g de amido (cada grupo utilizará um tipo de amido) em uma panela pequena e adicionar 200 mL de água destilada.
b) Verificar a aparência microscópica dos grânulos de amido: colocar 1 gota da suspensão de amido + 1 gota de solução de Iodo-KI diluída em uma lâmina de vidro limpa e uma lamínula de vidro sobre a amostra. Utilizar objetiva com aumento de 40x. Desenhar. 
c) Se o amido for identificado como amido de milho, avisar o aluno que está realizando o item II que é necessário adicionar maior quantidade de -amilase bacteriana ( + 0,2 mL de enzima )
d) Aquecer a suspensão de amido em placa de aquecimento.
e) Anotar a temperatura em que ocorre a gelatinização do amido (aumento de viscosidade) e o aspecto do gel de amido.
f) Verificar a aparência microscópica dos grânulos de amido após gelatinização: colocar 1 gota de solução de Iodo-KI diluída + uma pequena quantidade de amostra de amido gelatinizado em uma lâmina de vidro limpa e uma lamínula de vidro sobre a amostra. 
Estrutura dos Grânulos de Amido 
 Amido de Batata Amido de Mandioca Amido de Milho 
 (
II
 - 
Liquefação do amido com 
-amilase bacteriana
.
)
a) Pesar em um béquer de 250 mL uma amostra de 15g de amido e adicionar 100 mL de tampão fosfato 0,05M pH 6,0.
b) Adicionar 1mL de solução 20mg/mL de CaCl2 e 0,2 mL de -amilase bacteriana Termamyl 2X.
c) Aquecer a suspensão de amido em banho-maria a 90-98oC até a obtenção de coloração marrom ou amarela com solução de I2-KI diluída. (Vide Teste de coloração de amido com Iodo, descrito a seguir). A temperatura da solução de amido deve atingir 70 – 80 C.
 (
Teste de coloração de amido com Iodo:
 
)
Distribuir 2mL de solução de I2-KI diluída em 5 ou mais tubos de ensaio..
Adicionar 0,1 mL da suspensão de amido + -amilase em tubos contendo 2mL de solução de I2-KI diluída.
					 0,1 mL de solução de amido + -amilase	
 (
Tubos de ensaio contendo 2 mL de solução diluída de Iodo-KI
)
 (
Azul violeta marrom amarelo
)
 (
Amido + α- amilase
)
					
	Nota: No caso de amido de milho adicionar mais 0,2 mL de -amilase bacteriana comercial
d) Após verificar que o amido foi liquefeito apresentou coloração amarela com solução de iodo, comparar o aspecto da amostra em relação à viscosidade e turvação com a amostra de amido gelatinizado obtida no item I.
e) Medir o volume da amostra em proveta de 250 mL.
Preparar diluição 1:25 em balão volumétrico de 25 mL e a partir desta diluição 1:25 preparar diluições ( 1: 2, 1:3 e 1: 4 ) e determinar o teor de açúcares redutores nas amostra de amido liquefeito diluídas (1:50, 1:75 e 1:100). Calcular o valor de DE (Dextrose equivalente) ( Método de DNS )
	
Amido Liquefeito
Volume final =
	Diluição
	Abs 540 nm
	mg/mL
	Dextrose Equivalente
	
	1:2
	
	
	
	
	1:3
	
	
	
	
	1:4
	
	
	
g) Se a concentração de açúcares não puder ser determinada devido a valores baixos ou altos de absorbância, escreva no relatório diluições que poderiam ser testadas para a determinação de açúcares na amostra redutores na amostra de amido liquefeito.
TESTE DNS
- Transferir 1 mL das soluções de diferentes concentrações em novos tubos de ensaio numerados [ Tubo 1 (diluição 1:2) ; Tubo 2 (diluição 1:3) e Tubo 3 (1:4)]. 
	No tubo “branco” adicionar 1 mL de água destilada.
- Colocar 1 mL de reagente de DNS . ( misturar )
- Colocar diretamente em banho ebulição por 10 minutos.
- Após 10 minutos retirar do banho em ebulição e colocar no banho de gelo.
- Após o resfriamento até temperatura ambiente, adicionar 4 mL de água destilada.
- Fazer a leitura a 540 nm ( zerar com água destilada e fazer a leitura do branco )
	Tabela 1 - CURVA PADRÃO GLICOSE
	Concentração de glicose mg/mL
	Abs – 540nm
Femto I
	Abs – 540nm
Femto II
	Abs – 540nm
Femto III
	0,5
	0,054
	0,063
	0,049
	0,75
	0,115
	0,120
	0,106
	1
	0,192
	0,193
	0,183
	1,25
	0,282
	0,273
	0,264
	1,5
	0,354
	0,340
	0,338
	1,75
	0,465
	0,439
	0,445
	2
	0,550
	0,538
	0,545
	Tabela 2- Determinação de Açúcares redutores em amido liquefeito
	Tubo
	Diluição
	Abs 540 nm
	Açúcares redutores
mg/mL (amostra diluída)
	Açúcares redutores mg/mL (amido liquefeito)
	Dextrose Equivalente (DE)
	1
	1:2
	
	
	
	
	2
	1:3
	
	
	
	
	3
	1:4
	
	
	
	
 (
III
 – Análise dos açúcares redutores revelados na cromatografia em papel das amostras de 1) 
Amido de farinha de trigo hidrolisado de amido com 
-amilase fúngica
, 2) 
Amido hidrolisado com 
-amilase bacteriana (produção de maltodextrina)
 e 3) 
Amido liquefeito e sacarificado com glicoamilase (produção de xarope de glicose)
 
(
Será fornecido Cópia do Cromatograma)
)
a) Hidrólise de amido de farinha de trigo com -amilase fúngica 
A misturade 2g de farinha de trigo e 30 mL de água destilada foi aquecida em banho–maria em ebulição por 20 minutos. A amostra foi resfriada até temperatura ambiente e 3 mL foi transferida para tubo de ensaio contendo 0,5 mL de -amilase fúngica. O tubo de ensaio foi incubado em banho-maria a 55oC durante 1 hora e uma alíquota de 10L foi aplicada no papel de cromatografia.
b) Hidrólise de amido de mandioca com -amilase bacteriana:-
A suspensão de 15g de amido de mandioca em 100 mL de tampão fosfato 0,05M pH 6,0, 1mL de solução 20mg/mL de CaCl2 e 1 mL de -amilase bacteriana Termamyl 120 L comercial foi aquecida em banho-maria a 90-98oC até a obtenção de coloração marrom ou amarela com solução de I2-KI diluída. 
O pH da solução de amido liquefeito foi ajustado para pH 4,0-4,5 com solução HCl 0,5M ou HCl 0,1M. Uma amostra de 10 L de amido liquefeito foi aplicada no papel de cromatografia.
b) Sacarificação do Amido liquefeito = Produção de xarope de glicose:- 
A mistura de 10mL do amido liquefeito ajustada a 4,5 e 0,1mL de glicoamilase comercial foi incubada em banho-maria a 60oC durante 72 horas. Uma amostra de 2 l de solução de açúcares (xarope de glicose) foi aplicada no papel de cromatografia.
Cromatografia dos açúcares em papel.
	
	Amostras Aplicadas no papel de Cromatografia
	Quantidade
	1 
	Solução padrão 1 (10 % glicose 10 % maltose)
	 1 L
	2 
	Solução padrão 2 ( 10% de mistura de glicose, maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, etc)
	10 L
	3
	Farinha de trigo amilase fúngica
	10 L
	4
	Amido liquefeito (amido amilase bacteriana) 
	10 L
	5
	Xarope de glicose (amido liquefeito glicoamilase)
	2 L
Para a cromatografia dos açúcares em papel foi utilizado o sistema de solventes: Butanol:Piridina:Água destilada, na proporção 6:4:3 (v/v). Após 20-25 horas de desenvolvimento da cromatografia, o papel da cuba foi retirado da cuba e deixado secar na capela. Os açúcares redutores do papel de cromatografia foram revelados com solução de AgNO3 em acetona. Após secagem, o papel de cromatografia foi tratado com solução de NaOH/alcoólico e lavado em água corrente. O cromatograma foi tratado com solução de tiossulfato de sódio 10% até clarear o papel, lavado em água corrente e deixado secar a temperatura ambiente.
 (
I
V - Anotar os ingredientes obtidos a partir de amido (maltodextrina, xarope de glicose, frutose, xarope de dextrina e maltose, maltitol, sorbitol) presentes nos alimentos.
 Descrever as aplicações e como podem ser obtidos. 
(Cada Grupo de alunos, anotar os ingredientes de 1 ou 2 produtos)
)
	Nº
Grupo
	Nº
	Produtos
	Ingrediente obtido a partir de amido 
	Métodos de Obtenção- Enzimas Amilolíticas Utilizadas
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
Resultados e Discussão
1) Verificar na literatura as aplicações das enzimas -amilase fúngica, -amilase maltogênica, -amilase bacteriana, glicoamilase e aplicações dos produtos que podem ser obtidos a partir de amido na indústria de alimentos. 
3
image2.emf
O
H
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H
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O
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2
CH
O
H
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2
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2
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O
CH
2
OH
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OH
H
H
H
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O
HO
Glicose
Maltose
CH
2
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OH
OH
H
H
H
H
O
O
O
CH
2
OH
OH
OH
H
H
H
H
O
CH
2
OH
OH
OH
H
H
H
O
OH
HO
Maltotriose
Maltotetraose ( 4 unidades de glicose )
Maltopentaose ( 5 unidades de glicose)
Maltohexaose ( 6 unidades de glicose)
 
a
-limite dextrina ( oligossacarídeos com ligações 
a
-1,4 e 
a
-1,6 glicosídicas ) 
a -
 -amilase
+
Amido
H
H
OH
+
H
O
H
H
H
OH
O
OH
OH
2
CH
O
H
H
H
H
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OH
OH
2
CH
OO
O
H
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2
CH
O
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O
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OH
2
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O
O
O
H
H
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H
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OH
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2
CH
CH
2
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OH
HO
OH
H
H
H
H
O
OH
CH
2
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OH
H
H
H
H
O
O
CH
2
OH
OH
OH
H
H
H
H
O
HO
Glicose
Maltose
CH
2
OH
OH
OH
H
H
H
H
O
O O
CH
2
OH
OH
OH
H
H
H
H
O
CH
2
OH
OH
OH
H
H
H
O
OH
HO
Maltotriose
Maltotetraose ( 4 unidades de glicose )
Maltopentaose ( 5 unidades de glicose)
Maltohexaose ( 6 unidades de glicose)
 -limite dextrina ( oligossacarídeos com ligações -1,4 e -1,6 glicosídicas ) 
 -amilase
+
Amido
H
H
OH
+
H
image3.emf
Amilose
Amilopectina
a -
amilase
Amido liquefeito
(
a-
 limite dextrina ou 
maltodextrina )
glicose
maltose
maltotriose
maltopentaose
maltotetraose
glicose
isomaltose
panose
Glicoamilase
Amilose
Amilopectina
amilase
Amido liquefeito
( limite dextrina ou maltodextrina )
glicose
maltose
maltotriose
maltopentaose
maltotetraose
glicose
isomaltose
panose
Glicoamilase
image4.png
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image6.png
image7.emf
7 cm
1 
2
3
4
5
Papel de cromatografia
2 cm
Turma 
Grupo
Nome
7 cm
1 
2
3
4
5
Papel de cromatografia
2 cm
Turma 
Grupo
Nome
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