Biomedicina

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33Biomedicina na prática: 
da teoria à bancada SUMÁRIO
Analisando o resultado: 
A relação entre a quantidade de DNA e de proteína é usada como parâmetro para 
avaliação da qualidade do DNA/RNA extraído → grau de pureza = OD 260nm / OD280nm 
Razão = 1,7 – 2,0 (ideal). 
4. PRÁTICA: Duplicação de DNA in vitro: reação de polimerização em cadeia 
(PCR)
A técnica de PCR foi descoberta por Kary Mullis na década de 80, servindo para amplificar 
exponencialmente o número de cópias de fragmentos de DNA. A PCR tornou-se um divisor 
de águas nas análises moleculares, pois devido à sua descoberta é possível a análise de 
mutações, produção de bibliotecas de DNA, análise de expressão gênica, detecção de doenças 
infectocontagiosas etc. Durante a PCR, alta temperatura é usada para separar as moléculas de 
DNA em fitas simples e sequências sintéticas de DNA fita simples (20-30 nucleotídeos) servem 
como primers. Duas sequências diferentes de primers são usadas e delimitam a região-alvo. 
Para realizar uma reação de PCR, uma pequena quantidade do DNA alvo é adicionada em 
um tubo teste com um tampão contendo a DNA polimerase termoestável, sequencias de 
oligonucleotídeos como primers, os 4 desoxirribonucleotídeos trifosfatados (unidades do 
DNA) e o cofator MgCl2. A mistura de reagentes da PCR é colocada em ciclos de replicação 
que consistem de: 
- desnaturação: um a muitos minutos em 94 a 96ºC, durante o qual o DNA é desnaturado 
em fitas simples; 
- pareamento ou hibridização, chamado de anelamento: um a muitos minutos, a 
temperatura deverá ser calculada baseada na sequência de nucleotídeos dos primers 
(em geral é entre 50 a 65ºC). Nesta etapa os primers pareiam com a sequência 
complementar em ambos lados das sequências do DNA alvo; 
- extensão, polimerização: um a muitos minutos a 72ºC durante o qual a DNA polimerase 
se liga e inicia a extensão (polimerização) da fita complementar a partir da hidroxila 
(OH-) na extremidade 3´de cada primer. 
PCR para amplificação do gene VEGF (fator de crescimento vasoendotelial):
VEGF Sequência
Tamanho 
do produto
Referência
Sense 5’ AAGGAAGAGGAGACTCTGCGCAGAGC 3’
208 pb Barreiro, 2009
Antisense 5’ TAAATGTATGTATGTGGGTGGGTGTGTCTAGAG 3’
Materiais:
- Pipetadores de todos os volumes;
- Caixas de ponteiras azuis, amarelas e cristal;
- Microtubos eppendorf de 2,0 mL e de 0,2 mL;
- Estante para microtubos;
- Água ultrapura tratada com DEPC (dietilpirocarbonato);
- Frasco para descarte;
- Isopor com gelo; 
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da teoria à bancada SUMÁRIO
- Agitador de tubos do tipo vórtex;
- EPIs (Luvas de látex, máscara, avental);
- Termociclador;
- Enzima taq DNA polimerase;
- Primers para o gene VEFG na concentração de 1 nmol;
- Desoxirribonucleotídeos trifosfatados na concentração de 10 mM;
- Cloreto de magnésio na concentração de 50 mM;
- PCR buffer 10X (acompanha a enzima);
- DNA;
- Microcentrífuga de bancada
Procedimentos:
1. Preparar tubos eppendorfs (0,2 ml) numerados ou identificados segundo as amostras;
2. Colocar as amostras de DNA no gelo e os componentes da Mix; 
3. Calcular os volumes dos reagentes conforme tabela abaixo: 
Observação: Preparar a Mix sempre para tubos a mais, por exemplo, para 8 tubos, 
calcular os reagentes para 10 tubos. 
Mix inicial (µL) Pós Hot- Start (µL)
Água DEPC 32, 8 5,3
PCR Buffer 10X 4 1
MgCl2 50 mM 1,2 0,3
DNTP Mix 10 mM -- 1
Primer Sense -- 1
Primer Antisense -- 1
DNA - pipetar em cada tubo 2 µL --
Taq DNA polim 0,4
VOLUME TOTAL 50 µl 10 µl
Dica: Os valores dos volumes acima são para um tubo, lembrar de multiplicar os valores 
pelo número de tubos para preparar a mix e a pós.
4. Dar um spin em todos os reagentes e no DNA;
5. Preparar a Mix Inicial no tubo de 2,0 mL
6. Adicionar a cada tubo 38 µl da Mix Inicial em cada tubo de 0,2 mL;
7. Preparar a Pós, sem adicionar a enzima Taq Polimerase;
8. Adicionar a cada tubo 2 µl do DNA de cada amostra;
Dica: Se pipetar várias amostras, sempre trocar a ponteira. 
Observe: Cuidado com a contaminação, caso a ponteira encoste fora do tubo troque!
9. Colocar na máquina de PCR localizando o Programa VEGF e pressione: RUN;