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REVISTA BRASILEIRA DE TOXICOLOGIA BRAZILIAN JOURNAL OF TOXICOLOGY Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008) 15 - 19 © 2008 Sociedade Brasileira de Toxicologia direitos reservados Incidência de alatoxinas em amostras de amendoim e paçoca comercializadas na cidade de Alfenas-MG, Brasil Miguel Divino da Rocha, Patrícia Penido Maia, Maria Augusta Carvalho Rodrigues, Isarita Martins* Universidade Federal de Alfenas, Laboratório de Análises Toxicológicas, Alfenas, MG, Brasil Abstract Incidence of alatoxins in samples of peanuts and paçoca marketed in the city of Alfenas-MG, Brazil Foods are subject to contamination by chemical substances, including alatoxins, which are potentially carcinogens. The presence of these substances in food is important risk in human population and animals. The aim of this study was to determine the occurrence of alatoxins B 1 , B 2 , G 1 and G 2 in samples of peanuts and paçoca ramdomly acquired in shops and food market in the city of Alfenas-MG, Brazil, from June 2006 to February 2007. The technique used for the separation, identiication and quantiication of the substances was a liquid-liquid extraction with subsequent thin layer chromatography (TLC). Results showed that 38% of peanuts samples and 13% of paçoca samples were contaminated with alatoxins and the concentrations ranged from 21 to 138 µg kg-1. All positive samples exceeded the maximum level established by Brazilian Legislation (20 µg kg-1). The results obtained in this work conirm the need for frequent monitoring of the presence of alatoxins in food. Keywords: thin layer chromatography, contamination, peanuts, paçoca *Autor Correspondente. Endereço para correspondência: Universidade Federal de Alfenas, Laboratório de Análises Toxicológicas. Rua Gabriel Monteiro da Silva, 714, Centro. 37130- 000, Alfenas, MG, Brasil. Tel.: +55 35 3299 1342; Fax: +55 35 3299 1063. E-mail: isarita@unifal-mg.edu.br INTRODUçãO Denomina-se contaminante químico de alimento toda substância que não seja um de seus componentes naturais, que pode se tornar parte do alimento durante sua produção, processamento e/ou armazenamento devido a fatores naturais ou artiiciais e que apresente risco de provocar dano à saúde de quem o consome (1). Os alimentos, de maneira geral, estão sujeitos à contaminação por estas substâncias e, uma vez que muitas delas são tóxicas, a sua ingestão é capaz de causar sérios transtornos aos organismos, tanto humanos quanto animais (2,3). Dentre estas substâncias estão as alatoxinas, as quais são micotoxinas produzidas durante o metabolismo secundário dos fungos Aspergillus lavus, A. parasiticus e A. nomius. As quatro alatoxinas naturalmente encontradas são: B 1 (AFB 1 ), B 2 (AFB 2 ), G 1 (AFG 1 ) e G 2 (AFG 2 ). A alatoxina B 1 é classiicada como potencialmente carcinogênica (4). As alatoxinas são furocumarinas complexas que apresentam intensa luorescência quando expostas à luz ultravioleta em ondas longas. São classiicadas de acordo com a cor da luorescência, em B (blue-azul) ou G (green-verde), sendo esta propriedade importante para sua identiicação em diversos tipos de alimentos. São substâncias instáveis à luz, porém estáveis a temperaturas acima de 100ºC (5). Atualmente, as técnicas rotineiramente usadas para determinação de micotoxinas são principalmente por cromatograia líquida de alta eiciência (CLAE), cromatograia em camada delgada (CCD) e enzima imunoensaio (ELISA). Todavia, qualquer que seja a técnica de escolha, esta deve ser reprodutível e apresentar baixo limite de detecção, uma vez que os limites máximos permitidos para tais compostos são baixos (6,7). A presença de micotoxinas em alimentos é um sério problema para a saúde pública e para a qualidade dos alimentos. Por muitos anos, os fungos foram conhecidos pela sua capacidade de produzir metabólitos tóxicos, porém os seus efeitos foram largamente ignorados, tornando as micotoxicoses negligenciadas. Esta situação foi drasticamente mudada a partir da década de 60, sendo que a rapidez na identiicação e caracterização das alatoxinas e a caracterização da alatoxina B1 como um carcinógeno, Martins I./Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008)16 impulsionaram esta mudança (8) citado por Amaral et al. (7). A exposição às alatoxinas pode levar a efeitos tóxicos que variam substancialmente de acordo com a espécie animal, o tempo de exposição, a dose, a dieta, o estado nutricional, o gênero e a idade (4). Estas substâncias apresentam como principal órgão alvo o fígado, sendo para este órgão o binômio causa/efeito bem deinido. Sabe-se que a ingestão de alimentos com baixos teores destas micotoxinas (da ordem de ppb), com uma dada freqüência e por tempo prolongado pode levar ao aparecimento de carcinomas hepáticos. Por outro lado, a ingestão de alimentos com alto grau de contaminação (ppm) à curto prazo pode produzir efeitos agudos hepatotóxicos (necrose e degeneração lipídica) recebendo a denominação de alatoxicose (1). Ao cair na circulação sistêmica, as alatoxinas são distribuídas para o organismo ligadas a componentes sangüíneos, tais como proteínas e eritrócitos plasmáticos (9). A ação biológica das alatoxinas B 1 , quer seja citotóxica ou genotóxica, está ligada à formação do 8,9 epóxido através dos processos de biotransformação que são extremamente complexos. As principais vias de biotransformação, consideradas por Neil (10), são o processo reversível de destoxiicação com a formação do alatoxicol, bem como o processo de ativação, através da formação do 8,9 epóxido, ou seja, oxidação da dupla ligação nesta posição da molécula. Em 2002, a legislação brasileira aprovou o regulamento técnico sobre limites máximos de alatoxinas admissíveis no leite, no amendoim e milho, de acordo com as normas do MERCOSUL/GMC/RES. no. 25/02, que são comuns a todos os integrantes. Esta resolução estabelece o limite máximo admissível de 20,0 μg kg-1 de alatoxinas (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ) para milho em grão, farinhas ou sêmolas de milho, amendoim em casca e descascado, cru ou tostado, pastas e manteiga de amendoim. Este valor não protege a população, mas serve como guia no controle de qualidade dos alimentos. Em outros alimentos para consumo humano o limite máximo para alatoxinas totais é de 30 μg kg-1 (B 1 +G 1 ), de acordo com a Resolução no. 34/76, da Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos (CNNPA) (11,12). A legislação atualmente em vigor na União Européia (13) preconiza os seguintes níveis máximos aceitáveis destes toxicantes em amendoim para consumo direto: 2,0 μg kg-1 (B 1 ) e 4,0 μg kg-1 (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ) ou como ingrediente de alimentos: 8,0 μg kg-1 (B 1 ) e 15,0 μg kg-1 (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ). Visto que as alatoxinas são altamente tóxicas e que, os produtos alimentícios, como amendoim e derivados, constituem matéria prima (substrato) ideal para o crescimento de fungos e conseqüente produção das micotoxinas, o presente trabalho teve como objetivo analisar amostras de amendoim e paçoca comercializadas na cidade de Alfenas-MG, Brasil para determinar a ocorrência de alatoxinas B 1 , B 2 , G 1 e G 2 por cromatograia em camada delgada (CCD). MAterIAl e Métodos Os reagentes, com grau de pureza analítica, utilizados na extração foram: metanol e clorofórmio (Proquímios®), KCl (Reagen®), CuSO4 (Merck®). Na eluição utilizou-se ácido fórmico (Micro Bioquímica®), acetato de etila (CAAL®) e tolueno (Isofar®) e placas cromatográicas de sílica gel 60 0,2 mm espessura (Merck®). O estudo foi realizado em 36 amostras alimentícias, sendo 21 de amendoim e 15 de paçoca, adquiridas em supermercados e bancas do mercado municipal de Alfenas, sul de Minas Gerais, Brasil, de junho de 2006 a fevereiro de 2007. Foram analisadas amostras de amendoim in natura, de diferentes marcas, adquiridas ao acaso em embalagens de 500 g sem apresentar indício de deterioração e armazenadosna prateleira à temperatura ambiente. O amendoim estava exposto em local seco, como recomendado pelo fabricante, exceto as adquiridas no mercado municipal, que icavam expostas ao ar livre. As amostras de paçoca, de diferentes marcas, foram adquiridas ao acaso em embalagens de 22 g, não apresentavam sinais de contaminação e estavam armazenadas à temperatura ambiente. Soluções padrão de alatoxinas a 1 mg/mL foram obtidas a partir da diluição de padrão primário de alatoxinas B 1 , B 2 , G 1 e G 2 (10 mg) da Sigma® em clorofórmio. A partir de diluições, foram obtidas as seguintes concentrações: B 1 (1,05 μg.mL-1), B 2 (0,76 μg.mL-1), G 1 (0,80 μg.mL-1) e G 2 (1,12 μg.mL-1). As concentrações das soluções padrão foram determinadas pelo procedimento descrito pela International Oficial Methods of Analysis (14). Foram aplicados os volumes de 1,0, 2,0, 3,5, 5,0 e 6,0 µL de cada solução padrão na cromatoplaca, juntamente com 10 µL de cada extrato. O limite de detecção, a precisão do método e a recuperação dos analitos nestas matrizes foram obtidos por adição de quantidades conhecidas das soluções-padrão a amostras previamente analisadas, livres de contaminação. Cada amostra foi triturada e misturada, para evitar que possíveis contaminações, que não estivessem bem distribuídas, icassem homogeneizadas e assim obter uma amostragem signiicativa. Desta amostra tratada, foram amostrados 50 g para análise. Todo o método foi realizado com base no método da AOAC (14), conforme descrito na Figura 1. Martins I./Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008) 17 12 Figura 1. Fluxograma da técnica de separação, extração e purificação para a determinação de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 em amostras de amendoim e paçoca. - banho de H2O a 80ºC até a secura - ressuspender em 500L de clorofórmio 50 g de amostra 150 mL do filtrado 150 mL do filtrado 5 mL da fase clorofórmica CCD + 270 mL de metanol + 30 mL de KCl 4% -liquidificador por 5 minutos -filtrar + 150 mL de CuSO4 + 5 g de celite -agitar -filtrar Funil de separação + 150 mL de H2O + 10mL de clorofórmio -agitar por 3 minutos + 10mL de clorofórmio -agitar por 3 minutos 5 mL fase clorofórmica 140 mL da fase aquosa Figura 1. Fluxograma da técnica de separação, extração e puriicação para a determinação de alatoxinas B1, B2, G1 A cromatograia em camada delgada, com eluição visual da luorescência, frente à luz UV, da amostra de alatoxinas foi conirmada pela realização de nova A quantiicação foi dada pela seguinte fórmula: S x Y x V S= µL da alatoxina padrão de luorescência e hRf Y= concentração da alatoxina padrão, em µg/mL usada na cromatograia inal W= gramas da amostra contida no extrato inal concentrações das alatoxinas determinadas nas amostras pelas alatoxinas, os teores variaram de 23 a 137 µg kg apresentaram simultaneamente as alatoxinas B Incidência (%) e concentração das alatoxinas, em µg kg-1, quantiicada em amostras positivas de amendoim limite de detecção do método (5μg kg-1) alatoxinas em amostras de amendoim e paçoca com , para as alatoxinas estudadas e, a recuperação alatoxinas nas amostras, foi 93%, com coeiciente de Figura 1. Fluxograma da técnica de separação, extração e puriicação para a determinação de alatoxinas B 1 , B 2 , G 1 e G 2 em amostras de amendoim e paçoca. A cromatograia em camada delgada, com eluição no sistema solvente constituído de tolueno: acetato de etila: ácido fórmico (60:30:10), foi utilizada para separar os compostos e a detecção foi por comparação visual da luorescência, frente à luz UV, da amostra com o correspondente padrão de referência. A presença de alatoxinas foi conirmada pela realização de nova análise na amostra e, aplicação de ácido sulfúrico 25% na cromatoplaca. A quantiicação foi dada pela seguinte fórmula: µg kg-1 (ppb) = S x Y x V Z x W Em que: S= µL da alatoxina padrão de luorescência e hRf igual ao da amostra Y= concentração da alatoxina padrão, em µg/mL-1, usada na cromatograia V= µL do solvente requerido para diluir o extrato inal Z= µL do extrato da amostra aplicado na cromatoplaca W= gramas da amostra contida no extrato inal RESULTADOS A incidência de contaminação (38% das amostras de amendoim e 13% das amostras de paçoca) e também as concentrações das alatoxinas determinadas nas amostras positivas de amendoim e de paçoca são apresentadas na Tabela 1. Nas amostras que apresentaram contaminação pelas alatoxinas, os teores variaram de 23 a 137 µg kg-1, dado como somatório de B 1 + B 2 + G 1 + G 2 . Somente 9,5% das amostras de amendoim apresentaram simultaneamente as alatoxinas B 1 , B 2 , G 1 e G 2 , todavia, em todas as amostras positivas, de amendoim e de paçoca, os níveis encontrados excederam o limite máximo permitido de 20 µg kg-1. tabela 1. Incidência (%) e concentração das alatoxinas, em μg kg-1, quantiicada em amostras positivas de amendoim e paçoca, comercializadas na cidade de Alfenas-MG, no período de junho de 2006 a fevereiro de 2007. 12 Figura 1. Fluxograma da técnica de separação, extração e purificação para a determinação de aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 em amostras de amendoim e paçoca. - banho de H2O a 80ºC até a secura - ressuspender em 500L de clorofórmio 50 g de amostra 150 mL do filtrado 150 mL do filtrado 5 mL da fase clorofórmica CCD + 270 mL de metanol + 30 mL de KCl 4% -liquidificador por 5 minutos -filtrar + 150 mL de CuSO4 + 5 g de celite -agitar -filtrar Funil de separação + 150 mL de H2O + 10mL de clorofórmio -agitar por 3 minutos + 10mL de clorofórmio -agitar por 3 minutos 5 mL fase clorofórmica 140 mL da fase aquosa puriicação para a determinação de alatoxinas B1, B2, G1 A cromatograia em camada delgada, com eluição visual da luorescência, frente à luz UV, da amostra de alatoxinas foi conirmada pela realização de nova A quantiicação foi dada pela seguinte fórmula: S x Y x V S= µL da alatoxina padrão de luorescência e hRf Y= concentração da alatoxina padrão, em µg/mL usada na cromatograia inal W= gramas da amostra contida no extrato inal concentrações das alatoxinas determinadas nas amostras pelas alatoxinas, os teores variaram de 23 a 137 µg kg apresentaram simultaneamente as alatoxinas B Incidência (%) e concentração das alatoxinas, em µg kg-1, quantiicada em amostras positivas de amendoim Tipo de produto Total de amostras analisadas Amostras positivas Incidência (%) 1B 1 1B 2 1G 1 1G 2 2B 1 +B 2 + G 1 +G 2 Amendoim 21 8 38 nd-47 nd-14 nd-44 nd-33 64 Paçoca 15 2 13 18-29 nd-5 nd nd 26 1Valores mínimos e máximos; 2Valor Médio n.d.: abaixo do limite de detecção do método (5μg kg-1) alatoxinas em amostras de amendoim e paçoca com , para as alatoxinas estudadas e, a recuperação alatoxinas nas amostras, foi 93%, com coeiciente de 1Valores mínimos e máximos; 2Valor médio n.d.: Abaixo do limite de detecção do método (5 µg kg-1) DISCUSSãO Os métodos de estimativa de populações a micotoxinas relatados na literatura têm variado quanto aos meios utilizados. As pesquisas têm empregado: a) a estimativa de ingestão de alimentos que apresentam risco de contaminação através de dados retirados de levantamentos de dieta nacional dos países; b) aplicação de questionários de freqüência de consumo; c) o acompanhamento de duplicatas das dietas de um grupo reduzido de indivíduos e d) a mensuração do nível de contaminação das micotoxinas em produtos alimentícios (15). O presente trabalho realizou a mensuração de alatoxinas em amostras de amendoim e paçoca com detecção através de CCD com prévia extração líquido- líquido do analito. Embora Ali et al. (16), tenham utilizado a extração em fase sólida, a extração líquido-liquido pode ser utilizada rotineiramente nos laboratórios, uma vez que apresenta recuperação satisfatória. O limite de detecçãoobtido para este método foi 5 µg kg-1, para as alatoxinas estudadas e, a recuperação média obtida, após adição de 10, 30 e 50 µg kg-1 de alatoxinas nas amostras, foi 93%, com coeiciente de variação de 4,0%, quando as amostras foram analisadas em triplicata. Estes valores foram considerados satisfatórios e bem correlacionados àqueles obtidos por Maia e Siqueira (17), quando a amostra analisada foi ração para animais domésticos. No presente estudo, as amostras analisadas foram coletadas na cidade de Alfenas, sul de Minas Gerais, Brasil, de junho de 2006 a fevereiro de 2007. Neste período a temperatura e a umidade podem favorecer o crescimento de fungos, uma vez que a temperatura em torno de 27oC e a umidade do substrato em torno de 18% constitui um Martins I./Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008)18 ambiente favorável ao crescimento de tais microorganismos (18). Eizendeher et al. (19) analisaram 44 amostras, sendo 38 de doces de amendoim e seis de amendoim in natura, para a presença das alatoxinas B 1 , B 2 , G 1 e G 2 . A quantiicação foi por cromatograia em camada delgada, através de comparação visual com padrões de concentrações conhecidas. Os resultados revelaram que 73,68% das amostras de doces de amendoim estavam contaminadas com alatoxinas numa faixa de 25,95 a 350,02 μg kg-1 para soma de B 1 , B 2 , G 1 e G 2 . Das amostras de doce de amendoim analisadas, 26,31% apresentaram contaminação por alatoxina G 1 com valores variando de 15,98 a 127,87 μg kg-1. Das seis amostras de amendoim in natura, 16,67% estavam contaminadas com 3421 μg kg-1, calculadas pela soma das alatoxinas B 1 , B 2 , G 1 e G 2 . Caldas et al. (20) analisaram 366 amostras de alimentos consumidos no Distrito Federal, no período de julho de 1998 a dezembro de 2001, como amendoim e derivados, castanhas, milho, produtos de trigo e/ou aveia, arroz e feijão. As amostras foram processadas, as micotoxinas extraídas, detectadas e quantiicadas por luorescência, após separação em cromatograia camada delgada. Foram detectadas alatoxinas em 19,6% das amostras, em amendoim cru e derivados, milho de pipoca, milho em grão e castanha-do-pará. Amendoim e derivados apresentaram maior incidência de contaminação por alatoxinas (34,7%) com amostras contendo até 1280 μg kg-1 dada como somatório de B 1 e G 1 e 1706 μg kg-1 de alatoxinas totais. Das amostras positivas, B 1 estava presente em 98,5%, B 2 em 93%, G 1 em 66,7% e G 2 em 65,4%. Sabino et al. (21) analisaram 137 amostras de amendoim e derivados (amendoim cru, doces de amendoim: “paçoca” e “pé-de-moleque”, pasta de amendoim, amendoins salgados frito e torrado, “torrone” e amendoins com cobertura de chocolate ou cobertura salgada (“amendoim japonês”)), obtidas no período de janeiro de 1995 a dezembro de 1997. As amostras foram analisadas por cromatograia em camada delgada. Sessenta e duas amostras (45,3%) foram positivas para alatoxinas e 37 amostras (27,0%) apresentaram valores de alatoxinas acima do limite máximo da legislação brasileira. A concentração de alatoxinas nas amostras de amendoim cru variou de 5,0 a 356,0 µg kg-1. Quanto à contaminação por alatoxinas nas amostras de doces de amendoim 32,8% delas estavam acima do limite e as concentrações variaram de 6,0 a 536,0 µg kg-1. Um estudo realizado no amendoim e seus produtos comercializados na região de Campinas, mostrou elevados índices de alatoxinas. Cerca de 51% das amostras apresentou contaminação entre 43 e 1099 μg kg-1 para a soma das concentrações de B 1 , B 2 , G 1 e G 2 . Os resultados também demonstraram que a alatoxina B 1 teve maior incidência e chegou a limites mais elevados comparados com as demais (22). Ricciardi e Ferreira (23) analisaram por cromatograia em camada delgada amendoim e doces de amendoim, procedentes da região de Ribeirão Preto, SP, no período de janeiro de 1983 a dezembro de 1985. Foi caracterizada a presença de alatoxina B 1 em 67,2% das amostras analisadas. Comparando com os dados de incidência de alatoxinas em amendoim e produtos de amendoim descritos na literatura, os resultados deste trabalho mostraram que a contaminação por estas micotoxinas continua num patamar elevado, em relação aos níveis permitidos tanto no Brasil (12), quanto na Comunidade Européia (13). Nesse estudo foram encontradas, em 3 das 8 amostras de amendoim analisadas, concentrações de alatoxina B 1 em torno de 47 µg/kg. Estimando-se que o consumo interno para esse alimento no Brasil é cerca de 1,39 g/ per capita por dia (24) e considerando-se que o peso médio da população adulta é 70 kg, a Ingestão Diária Provável Média (IDPM) de AFB1 foi de 0,93 ng/Kg p.c./ dia. Amaral et al. (7) em 2006, encontraram valores em torno de 0,34 ng/Kg p.c./dia em produtos alimentícios à base de milho, cuja ingestão diária é de 42 g/pessoa. Isto demonstra que apesar do consumo de amendoim ser menor, a contaminação observada por alatoxina B 1 nesse alimento foi maior, constituindo um risco para o consumidor. Esse nível elevado pode ser devido às condições climáticas (umidade e altas temperaturas), mas também às práticas inadequadas de agricultura e condições de estocagem. O amendoim é um alimento que favorece o crescimento de fungos, já que possui uma composição ideal de nutrientes e a ocorrência de alatoxinas é maior no amendoim porque muitas vezes há chuvas no período de secagem, bem como períodos prolongados de armazenamento. Entretanto, sua maior incidência se dá quando o amendoim é batido, ensacado e armazenado com umidade elevada e quando reumedece depois de estar seco (25). O método analítico constituído pela cromatograia em camada delgada, com prévia extração líquido-líquido, mostrou-se satisfatório para a determinação de alatoxinas em amendoim e paçocas. Os resultados obtidos no presente estudo corroboram com os reportados na literatura e conirmam a necessidade do freqüente monitoramento das micotoxinas, especialmente as alatoxinas, visto que estas são substâncias potencialmente carcinogênicas. resuMo Os alimentos estão sujeitos à contaminação por substâncias químicas, dentre elas as alatoxinas, as quais são potencialmente carcinogênicas. A presença de tais substâncias nos alimentos constitui importante risco para a população tanto humana quanto animal. O objetivo deste estudo foi determinar a ocorrência de alatoxinas B 1 , B 2 , G 1 e G 2 em amostras de amendoim e paçoca adquiridas aleatoriamente no comércio da cidade de Alfenas- MG, Brasil, no período de junho de 2006 a fevereiro de 2007. Martins I./Revista Brasileira de Toxicologia 21, n.1 (2008) 19 A técnica utilizada para a separação, identiicação e quantiicação das substâncias foi a cromatograia em camada delgada com prévia extração, líquido-líquido, dos analitos. Os resultados demonstraram que 38% das amostras de amendoim e 13% das amostras de paçoca estavam contaminadas com alatoxinas, sendo que as concentrações variaram de 21 a 138 µg kg-1. Todas as amostras positivas excederam o limite máximo permitido, preconizado pela legislação brasileira de 20 µg kg-1. Os achados do presente estudo corroboram com os relatados na literatura e conirmam a necessidade do freqüente monitoramento da presença de alatoxinas em alimentos. unitermos: cromatograia em camada delgada, contaminação, amendoim, paçoca REFERêNCIAS BIBLIOGRáFICAS Midio AF, Martins DI. Toxicologia de Alimentos. São 1. Paulo: Livraria Varela, São Paulo, 2000. Amdur MO, Doull J, Klaassen CD. (eds.)2. 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