Dialnet-MolecularAnalysisAndBiodiversityOfMetazoanParasite-4435932

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Neotrop. Helminthol., 7(1), 2013
2013 Asociación Peruana de Helmintología e Invertebrados Afines (APHIA)
ISSN: 2218-6425 impreso / ISSN: 1995-1043 on line
ORIGINAL ARTICLE / ARTÍCULO ORIGINAL
MOLECULAR ANALYSIS AND BIODIVERSITY OF METAZOAN PARASITES OF THE 
YELLOW TAIL LAMBARI, ASTYANAX AFF. BIMACULATUS (TELEOSTEI, CHARACIDAE), IN 
LOWER SAN FRANCISCO, NORTHEASTERN BRAZIL
ANÁLISE MOLECULAR E BIODIVERSIDADE DE METAZOÁRIOS PARASITAS DO 
LAMBARI-DE-RABO-AMARELO, ASTYANAX AFF. BIMACULATUS (TELEOSTEI; 
CHARACIDAE), NO BAIXO SÃO FRANCISCO, NORDESTE DO BRASIL
ANÁLISIS MOLECULAR Y DE BIODIVERSIDAD DE PARÁSITOS METAZOOS DE 
LAMBARI-DE-COLA-AMARILLO, ASTYANAX AFF. BIMACULATUS (TELEOSTEI, 
CHARACIDAE), EN BAJO SAN FRANCISCO, NORESTE DE BRASIL
Abstract
The difficulty in identifying some species of Lambaris comes from very similar phenotypic feature 
that often result from hybridization. The parasites can be indicative of various aspects of the biology 
of their hosts, including phylogeny, because some groups of parasites may have host specificity. The 
objective was to evaluate the genetic diversity and parasitology of the fish Astyanax aff. 
bimaculatus. in ponds and streams adjacent to fish farms located in the Lower São Francisco, 
Sergipe, Brazil. The specimens were collected in the municipalities of Propriá and Neópolis and 
necropsied in the search for metazoan parasites. Sections of muscle tissue were taken for DNA 
extraction. The samples were subjected to PCR and electrophoresis with the products of the 
reactions. Subsequent cluster analysis was performed. A total of 102 fish were infected with Lernaea 
cyprinacea and Dolops sp. on the body surface, Urocleidoides sp. and metacercariae of 
Echinostomatidae in gills, Prosthenhystera obesa in the gallbladder, Diplostomidae type Neascus in 
the swim bladder and the nematodes Procamallanus hilarii and Rabdochona sp. in the gut. The 
genomic material of Astyanax aff. bimaculatus were evaluated with by origin: 34.3% from Propriá 
and 65.7% from Neopolis. Approximately 41% of the fish collected showed a homogeneous 
electrophoretic profile by using the primer CCCGTAGCAC. Among the specimens from Propriá, 
the genomic material presented electrophoretic profile with bands 800pb and >800pb. The last 
profile was more prevalent in hosts with Echinostomatidae in gills. Cluster analysis yielded a 
phylogenetic tree with two branches / groups, independent of the place of origin. However, it was 
homogeneous with respect to the expression of the character susceptibility / resistance to parasitic 
infection. These strategies can help in molecular taxonomic identification of Astyanax aff. 
bimaculatus, which is difficult because of the great similarity in external morphology.
Keywords: Astyanax aff. bimaculatus - Brazil - Genetic diversity - Ichthyoparasitology - Natural environment.
 Suggested citation: Vasconcelos, ACP, Lopes, ACM, Santos, JMS, Jeraldo VLS, Melo, CM & Madi, RR. 2013. Molecular 
analysis and biodiversity of metazoan parasites of the yellow tail lambari, Astyanax aff. bimaculatus (Teleostei, Characidae), in 
lower San Francisco, northeastern Brazil. Neotropical Helminthology, vol. 7, N°1, jan-jun, pp. 41 - 49.
 1 Programa de Mestrado em Saúde e Ambiente, Universidade Tiradentes, Aracaju, SE, Brasil.
1Laboratório de Biologia Molecular, Instituto de Tecnologia e Pesquisa, Aracaju, SE, Brasil
 1Curso de Ciências Biológicas, Universidade Tiradentes, Aracaju, SE, Brasil.
 1 Laboratório de Doenças Infecciosas e Parasitárias, Instituto de Tecnologia e Pesquisa, Aracaju, SE, Brasil.
 1 Laboratório de Biologia Tropical, Instituto de Tecnologia e Pesquisa, Aracaju, SE, Brasil. rrmadi@gmail.com
1 1 1Alessa Caroline Pedroza de Vasconcelos ; Anna Carolina Mota Lopes ; Joane Marília Santana dos Santos ; Verónica de 
1 2 1Lourdes Sierpe Jeraldo ; Cláudia Moura de Melo & Rubens Riscala Madi * 
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Resumo
Palavras-chave: Ambiente natural - Astyanax aff. bimaculatus - Brasil - Diversidade genética - Ictioparasitologia.
A dificuldade na identificação em algumas espécies de lambaris provém da grande semelhança 
fenotípica que apresentam muitas vezes aliada à hibridização. Os parasitas podem ser indicativos de 
vários aspectos da biologia de seus hospedeiros, incluindo a filogenia, pois alguns grupos parasitas 
podem apresentar especificidade de hospedeiro. Desta forma, objetivou-se avaliar a diversidade 
genética e parasitológica de peixes Astyanax aff. bimaculatus. em lagoas e riachos adjacentes à 
pisciculturas localizadas no baixo São Francisco, Sergipe, Brasil. Os espécimes foram coletados nos 
municípios de Propriá e Neópolis e submetidos à necropsia na busca por metazoários parasitas e secção 
dos tecidos musculares para extração de DNA. As amostras foram submetidas à PCR e eletroforese com 
os produtos das reações e posteriormente realizou-se análise de cluster. A avaliação parasitológica de 
102 peixes revelou a presença de Lernaea cyprinacea e Dolops sp. (superfície do corpo), Urocleidoides 
sp. e metacercárias de Echinostomatidae nas brânquias, Prosthenhystera obesa na vesícula biliar, 
Diplostomidae tipo Neascus na bexiga natatória e os nematódeos Procamallanus hilarii e Rabdochona 
sp. no intestino. Avaliou-se material genômico de Astyanax aff. bimaculatus com a seguinte 
distribuição segundo a origem: 34,3% oriundos de Propriá e 65,7% de Neópolis. Aproximadamente 
41% dos peixes coletados apresentaram perfil eletroforético homogêneo, ao utilizar-se o primer 
CCCGTAGCAC. Entre os espécimes oriundos de Propriá, o material genômico apresentou perfil 
eletroforético com bandas 800pb e 800pb, sendo o último padrão mais prevalente nos hospedeiros com 
Echinostomatidae nas brânquias. A análise de cluster originou uma árvore filogenética com dois 
ramos/grupos distintos, independentes do local de origem, entretanto homogênea com relação à 
expressão do caráter suscetibilidade/resistência à infecção parasitária. Estas estratégias moleculares 
podem auxiliar na identificação taxonômica de Astyanax aff. bimaculatus, que é difícil devido a grande 
semelhança na morfologia externa. 
Resumen
Palabras clave: Ambiente natural - Astyanax aff. bimaculatus - Brasil - Diversidad genética - Ictioparasitologia.
La dificultad en la identificación de algunas especies de lambaris provienen de las semejanzas 
fenotípicas muchas veces aliadas a la hibridación. Los parásitos pueden ser indicativos de varios 
aspectos de la biología de sus huéspedes, incluyendo filogenia, porque algunos grupos de parásitos 
pueden tener especificidad de hospedador. Así, el objetivo fue evaluar la diversidad genética y 
parasitológica del pez Astyanax aff. bimaculatus provenientes de estanques y arroyos adyacentes a las 
explotaciones piscícolas situadas en el Bajo São Francisco, Sergipe, Brasil. Las muestras fueron 
recolectadas en los municipios de Propriá y Neopolis y sometidas a autopsia para la búsqueda de 
parásitos metazoos y en sección de tejido muscular para la extracción de DNA. Las muestras fueron 
sometidas a PCR y posterior electroforesis con los productos de las reacciones, para realizar análisis de 
cluster. La evaluación parasitológica de 102 peces mostró la presencia de Lernaea cyprinacea y Dolops 
sp. en la superficie del cuerpo, Urocleidoides sp. y metacercarias de Echinostomatidae en las branquias, 
Prosthenhystera obesa en la vesícula biliar, Diplostomidae tipo Neascus en la vejiga natatoria y 
nemátodos Procamallanus hilarii y Rabdochona sp. en el intestino. La evaluación del material 
genómico de Astyanax aff. bimaculatus mostró la siguiente distribución por origen: 34,3% de Propriá y 
65,7% de Neopolis. Aproximadamente el 41% de los peces recolectados mostró perfil electroforético 
homogénea mediante el uso del primer CCCGTAGCAC. Entre las muestras de Propriá, el material 
genómico presentó perfil electroforético con bandas 800pb y >800pb, siendo esta última más frecuente 
en los hospedadores con Echinostomatidae en las branquias. El análisis decluster produjo un árbol 
filogenético con dos ramas / grupos distintos, independientemente del lugar de origen, no obstante 
homogéneas con respecto a la expresión del carácter susceptibilidad / resistencia a la infección 
parasitaria. Estas estrategias moleculares pueden ayudar en la identificación taxonómica de Astyanax 
aff. bimaculatus, que es difícil debido a la gran similitud en la morfología externa.
Molecular analysis and parasites of Astyanax Vasconcelos et al. 
conhecimento da estrutura populacional da cada 
espécie, e pode ser utilizado como estratégia 
para fins de repovoamento de estoques naturais e 
melhoramento de espécies de cultivo. Em 
função do exposto, o objetivo deste estudo foi 
avaliar a diversidade genética e parasitária em 
peixes Astyanax aff. bimaculatus coletados em 
corpos d´água adjacentes às pisciculturas de 
Sergipe, Brasil.
Exemplares de Astyanax aff. bimaculatus foram 
coletados em lagoas e canais próximos e 
adjacentes às pisciculturas localizadas nos 
municípios de Propriá (10º 10' 17” S e 36º 52' 
90” O) e Neópolis (10º 24' 26” S e 36º 34' 28” O), 
estado de Sergipe, Brasil, no período de agosto 
de 2011 à abril de 2012. Foram registrados os 
comprimentos total e padrão, assim como o peso 
dos peixes coletados e posteriormente 
submetidos à necropsia na busca por 
metazoários parasitas. 
Amostras de tecidos musculares foram retiradas 
para extração de DNA com tampão de digestão 
(Tris-base 50mM, EDTA 100mM + SDS 0,5%/ 
®
pH 8,0), proteinase-K 20mg/mL (QIAGEN ) e 
mercaptoetanol. O DNA foi isolado em 
fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1). 
As condições para PCR foram as seguintes: 35 
ciclos de desnaturação a 94ºC, anelamento a 
42,1ºC e extensão a 72ºC, com primers de 10 
mers. Os produtos de PCR foram submetidos à 
eletroforese em gel de agarose 1,5%. 
Foram realizados cálculos de prevalência e de 
intensidade de infecção a partir das definições 
apresentadas por Bush et al. (1997). Procedeu-se 
a análise de cluster para a obtenção de 
agrupamentos filogenéticos (UPGMA - 
Unweighted Pair-Group Method Using an 
Arithmetic Average) e em seguida aplicado o 
teste de Tukey entre os grupos obtidos, 
utilizando-se as intensidades de infecção dos 
parasitas de mais alta prevalência e grande risco 
à saúde do animal. Todas as análises foram 
realizadas utilizando-se o programa Statistica 
®7.0 , com intervalo de confiança igual a 5%. 
O Brasil possui a biota mais rica dentre os 17 
países mais biodiversos do planeta e os peixes 
são os organismos vertebrados mais 
diversificados e os mais distintos geneticamente 
conhecidos (Brasil, 2013). No entanto mesmo 
sendo muito conhecidos, acredita-se que 30 a 
40% de toda a ictiofauna Neotropical ainda não 
foi identificada até o momento (Gallio et al., 
2006).
Através da análise de estrutura populacional é 
permitida a interpretação de vários aspectos de 
vida das espécies, fornecendo subsídios ao 
d imens ionamen to dos e s toques da s 
comunidades e das eficientes medidas na 
administração e proteção dos recursos 
pesqueiros (Pinese et al., 2007).
Os peixes do gênero Astyanax pertencentes ao 
grupo bimaculatus, conhecidos como lambari-
d e - r a b o - a m a r e l o s ã o e n c o n t r a d o s 
principalmente nas bacias Amazônicas e do São 
Franc i sco (Froese & Pau ly, 2012) . 
Caracterizam-se por apresentarem uma mancha 
preta horizontal e duas listras marrons na região 
umeral, além de uma mancha preta no pedúnculo 
caudal que se extende até aos raios medianos da 
nadadeira caudal de cor amarela (Garutti & 
Britski, 2000). Neste grupo estão incluídas cerca 
de vinte espécies todos apresentando o mesmo 
padrão de coloração e com pequenas variações 
de peso e comprimento (Peres et al., 2012).
O gênero Astyanax, por apresentar hábito 
alimentar onívoro e por se localizar em posição 
intermediária na cadeia alimentar, pode servir 
como hospedeiro intermediário e definitivo de 
várias espécies de parasitas distribuídos em 
diversos grupos (Lizama et al., 2008). 
No baixo rio São Francisco inexistem 
publicações de levantamento dos parasitas dos 
peixes da região, sendo premente a identificação 
e o conhecimento da fauna parasitária piscícola, 
uma vez que muitas espécies nativas são 
utilizadas em pisciculturas locais. Atualmente os 
programas de aquicultura vêm se atentando às 
avaliações genéticas de peixes, pois possibilita o 
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INTRODUÇÃO
MATERIAL E MÉTODOS
Nematoda Procamallanus hilarii Vaz & 
Pereira, 1934 e Rabdochona sp. no intestino. A 
distribuição da prevalência e da intensidade de 
infecção está exposta na tabela 1.
Avaliou-se material genômico dos peixes 
coletados com a seguinte distribuição segundo a 
origem: 34,3% oriundos de Propriá e 65,7% de 
Neópolis. Foram submetidos à extração de DNA 
genômico 91 amostras de tecido muscular dos 
peixes, sendo que destes, apenas 40% 
apresentaram integridade adequada.
Aproximadamente 41% dos Astyanax aff. 
bimaculatus coletados apresentaram perfil 
eletroforético homogêneo ao utilizar-se o primer 
CCCGTAGCAC (Fig. 1). Entre os espécimes 
oriundos de Propriá, o material genômico 
apresentou perfil eletroforético com bandas 
800pb (n=11) e 800pb (n=4), sendo este último o 
padrão mais prevalente nos hospedeiros de 
Echinostomatidae nas brânquias. A análise de 
cluster originou uma árvore filogenética com 
Foram analisados 35 peixes do município de 
Propriá, sendo vinte três machos e doze fêmeas, 
com peso médio de 5,23g (±3,38), comprimento 
total médio de 6,84cm (±0,99) e comprimento 
padrão médio de 5,52cm (±0,79). Para as coletas 
do município de Neópolis foram analisados 67 
peixes, sendo trinta machos, trinta e cinco 
fêmeas e dois não identificados, com peso médio 
de 1,49g (±0,99), comprimento total médio de 
4,88cm (±0,80) e comprimento padrão médio de 
3,87cm (±0,69).
A avaliação parasitária dos peixes foi positiva 
para Lernaea cyprinacea Linnaeus, 1758 
(Copepoda) e Dolops sp. (Branchiura) na 
superfície do corpo, Urocleidoides sp. 
(Monogenea) nas brânquias, Prosthenhystera 
obesa (Diesing, 1850) (Trematoda) na vesícula 
biliar, metacercárias de Echinostomatidae 
(Trematoda) nas brânquias e Diplostomidae tipo 
Neascus (Trematoda) na bexiga natatória e os 
RESULTADOS
Tabela 1. Média da prevalência (P) e da intensidade de infecção (II) dos metazoários parasitas encontrados no 
Astyanax aff. bimaculatus da região do baixo São Francisco, municípios de Propriá e Neópolis, Sergipe, Brasil.
 
Propriá (n=35)
 
Neópolis (n=67)
 
Órgão Parasitado
 
P (%)
 
II
 
P (%)
 
II
Lernaea
 
cyprinacea.
 
(Copepoda)
 
Tegumento
 
14,29
 
1,20
 
2,99
 
4,00
Urocleidoides sp.
 
(Monogenea)
 
Brânquias
 
28,57
 
2,00
 
34,33
 
3,22
Rabdochona
 
sp. 
(Nematoda)
 
Intestino
 
8,57
 
3,00
 
5,97
 
2,50
Procamallanus
 
hilarii
 
(Nematoda)
 
Intestino
 
20,00
 
7,00
 
11,94
 
1,13
Echinostomatidae
 
(Trematoda)
 
Brânquias
 
57,14
 
47,65
 
74,63
 
19,98
Diplostomidae
 
(Trematoda)
 
Bexiga natatória
 
-
 
-
 
2,99
 
9,00
Prosthenhystera obesa
 
(Trematoda)
 
Vesícula biliar
 
-
 
-
 
1,49
 
1,00
Dolops sp.
 
(Branchiura)
Tegumento - - 1,49 1,00
Molecular analysis and parasites of Astyanax Vasconcelos et al. 
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Figura 1. Perfil eletroforético das amostras de DNA de Astyanax aff bimaculatus coletados nos municípios de Propriá e 
Neópolis, SE, submetidos à amplificação via PCR-RAPD, utilizando o iniciador OPR-4 (CCCGTAGCAC). 
45
Figura 2. Árvore filogenética de Astyanax aff bimaculatus coletados nos municípios de Propriá e Neópolis, SE, com dois 
ramos/grupos distintos, independentes do local de origem.
Molecular analysis and parasites of Astyanax Vasconcelos et al. 
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As metacercárias, como são chamadas as formas 
larvais de trematódeos, são mais prejudiciais ao 
hospedeiro do que as formas adultas. Ao 
migrarempelos tecidos com o propósito de 
alcançar o sítio de infecção, podem causar lesões 
e, ao se encistar, causam também alterações 
teciduais. As larvas provocam patogenias e 
debilitam os hospedeiros, tais características são 
ecologicamente importantes, pois um peixe 
debilitado é mais facilmente predado podendo o 
ciclo se completar no predador, hospedeiro 
definitivo (Pavanelli et al., 2002).
Monogêneas apresentam ciclo de vida direto, 
p o d e n d o c o m p l e t a r o s e s t á g i o s d e 
desenvolvimento em um único hospedeiro. São 
encontrados principalmente nas brânquias 
podendo ser observados também na superfície 
do corpo, narinas e cavidades. Este grupo de 
parasitas possuem limitações na capacidade de 
dispersão migrando diretamente de um 
hospedeiro a outro, através da larva natante 
denominada oncomiracídio, sem a necessidade 
de um hospedeiro intermediário (Buchmann & 
Bresciani, 2006). Apresentam, geralmente, uma 
grande especificidade ao hospedeiro, 
desenvolvendo-se em uma única espécie ou em 
espécies próximas filogeneticamente (Poulin, 
2002; Almeida & Cohen, 2011).
Entre as monogêneas, Llewellyn (1982) 
descreve dois tipos de especificidade: a 
filogenética, que ocorre em espécies 
relacionadas evolutivamente e parasitam 
h o s p e d e i r o s t a m b é m r e l a c i o n a d o s 
evolutivamente, e a ecológica, em que os 
parasitos relacionados ocorrem em hospedeiros 
não relacionados filogeneticamente, mas que 
cohabitam no mesmo local. Poulin (1992) 
afirma que espécies distintas de hospedeiros 
podem compartilhar parasitas, através de 
eventos de colonização, troca de hospedeiro, ou 
por herança de um ancestral comum. A dispersão 
de parasitas entre várias espécies de hospedeiros 
pode levar a um aumento da abundância das 
espécies parasitas entre os hospedeiros, 
suportando a hipótese da especificidade 
ecológica (Simková et al., 2006).
Os grupos filogenéticos obtidos na análise de 
dois grupos distintos (Fig. 2), independentes do 
local de origem, entretanto homogênea com 
r e l a ç ã o à e x p r e s s ã o d o c a r á t e r 
suscetibil idade/resistência à infecção 
parasitária.
De acordo com as análises estatísticas, os grupos 
filogenéticos não apresentaram diferenças 
significativas entre as intensidade de infecção 
por Urocleidoides sp. (p=0,26), e por 
Echinostomatidae (p=0,84).
Os copépodos são os crustáceos mais comuns 
parasitando peixes, tendo Lernaea o gênero 
mais patogênico deste grupo. Os copépodes 
lemeídeos são encontrados parasitando 
tegumento, brânquias, olhos, nadadeiras e até 
mesmo dentro do aparelho bucal, junto ao palato 
e narinas dos peixes. Permanecem aderidos a 
estas regiões por órgãos de fixação, resultantes 
das adaptações morfológicas da região cefálica 
destes parasitos (Eiras, 1994). As lesões 
causadas pelo parasita provocam desde 
hemorragias nos peixes evoluindo a anêmicos 
(Noga, 1995) e alterações na contagem geral de 
leucócitos (Silva-Souza et al., 2000). Nos casos 
das infecções por L. cyprinacea e por Dolops sp., 
ambos ectoparasitas que não apresentam 
especificidade de hospedeiros, os Astyanax aff. 
bimaculatus coletados podem estar atuando 
como disseminadores de parasitoses devido ao 
fácil acesso desses peixes aos tanques de criação 
que se encontram nas proximidades do seu 
habitat.
Os nematódeos são parasitas encontrados 
comumente em peixes de água doce. Infecções 
geradas por esses parasitas podem afetar o 
crescimento, comprometer a saúde e provocar a 
morte dos peixes parasitados, causando impacto 
na pesca esportiva, comercial e na aquicultura 
(Choudhury & Cole, 2008). Procamallanus é 
um dos nematódeos mais comuns encontrados 
em peixes de água doce no Brasil, não apresenta 
especificidade de hospedeiro e já foi descrita em 
várias espécies de peixes na maioria das bacias 
hidrográficas brasileiras (Eiras et al., 2010).
DISCUSSÃO
47
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento 
Científico e Tecnológico do Brasil (CNPq) pelas 
bolsas de estudo concedidas (ACPV, JMSS), à 
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de 
Nível Superior (CAPES/PROCAD NF 2009) 
pelo auxilio financeiro e à Camila Pereira de 
Almeida pelo auxílio em laboratório.
cluster não exibiram diferenças entre as 
intensidades de infecção por Urocleidoides sp., 
demonstrando que esse parasita permeia entre os 
Astyanax estudados no baixo São Francisco, 
apresentando dessa maneira uma especificidade 
filogenética aos indivíduos pertencentes ao 
grupo bimaculatus.
Segundo Torres et al. (2004), para analisar as 
populações de Astyanax sp. provenientes das 
Furnas do Parque Estadual de Vila Velha, PR, 
foram empregados marcadores RAPD com a 
intenção de verificar níveis de variação e 
diferenciação genética entre as mesmas espécies 
inferindo assim possível isolamento geográfico 
e endemismo para a população. Kantek et al. 
(2008) utilizaram a técnica do bandeamento-C 
para análise populacional e variantes 
cromossômicas de várias espécies endêmicas de 
Astyanax coletadas no rio Iguaçu.
Pamponet et al. (2008) realizaram análises 
morfológicas, citogenéticas (cariótipo e Ag-
RONs) e moleculares (RAPD e SPAR) em 
espécimes de Astyanax aff. bimaculatus 
coletados em três localidades diferentes nas 
bacias do rio das Contas e na bacia adjacente no 
Recôncavo Sul, localizadas na Bahia. Apesar de 
não apresentarem grandes var iações 
morfológicas os autores diferenciaram três 
populações geneticamente distintas revelando 
freqüências alélicas significativamente 
diferentes entre as localidades amostradas e 
índices significativos de estruturação 
populacional.
Estratégias moleculares podem auxiliar na 
identificação taxonômica de Astyanax do grupo 
bimaculatus, que é difícil devido a grande 
semelhança na morfologia externa entre as 
e s p é c i e s d e s t e g ê n e r o . O 
aprofundamento/ampliação de estudos sobre a 
variabilidade genética em populações de 
Astyanax, associado às características das 
infecções parasitárias presentes, auxiliará para 
um melhor conhecimento sobre a dinâmica da 
relação parasita-hospedeiro nestes animais.
AGRADECIMENTOS
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Correspondence to author/ Autor para 
correspondencia:
Rubens Riscala Madi 
Instituto de Tecnologia e Pesquisa, Aracaju, SE, 
Brasil.
Av. Murilo Dantas, 300 - Farolândia - Aracaju - 
Sergipe - CEP: 49032-490 - Brasil – Tel: +55 (79) 
3218-2190.
E-mail / Correo electrónico: 
rrmadi@gmail.com
Received December 2, 2012.
Accepted February 5, 2013.
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