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Aplicação do teste de tetrazólio em sementes de Gleditschia amorphoides Taub Caesalpinaceae

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TESTE DE TETRAZÓLIO EM SEMENTES DE SUCARÁ
Revista Brasileira de Sementes, vol. 28, nº 3, p.101-107, 2006
101
APLICAÇÃO DO TESTE DE TETRAZÓLIO EM SEMENTES DE Gleditschia amorphoides Taub.
CAESALPINACEAE1
CRISTIANE ALVES FOGAÇA2, MARLENE DE MATOS MALAVASI3, CLAUDEMIR ZUCARELI4, UBIRAJARA CONTRO MALAVASI3
RESUMO - Este trabalho teve como objetivos padronizar a metodologia do teste de tetrazólio e
avaliar a aplicabilidade deste para estimar a viabilidade de sementes de Gleditschia amorphoides.
Inicialmente, foram avaliados os seguintes tratamentos de pré-condicionamento: semente intacta,
escarificação mecânica, escarificação seguida de 24 ou 48 horas de embebição em água, com e sem
posterior retirada do tegumento. Em seguida, as sementes foram submetidas a 1, 3 ou 6 horas de
coloração em solução de 2, 3, 5 trifenil cloreto de tetrazólio às concentrações de 0,025; 0,050; 0,075
ou 0,10% a 35ºC, no escuro. Sementes escarificadas e embebidas por 48 horas, com retirada do
tegumento, imersas em solução de tetrazólio a 0,075% por 3 horas apresentaram coloração ideal,
possibilitando a identificação das sementes em viáveis e inviáveis. Utilizando o protocolo acima
descrito, avaliou-se a adequação do teste de tetrazólio em estimar a viabilidade de sementes de
Gleditschia amorphoides através da comparação com o teste de germinação. A comparação não
resultou em diferenças significativas entre eles. O teste de tetrazólio utilizando solução a 0,075%
por 3 horas pode ser utilizado na estimativa da viabilidade de sementes de Gleditschia amorphoides.
Termos para indexação: sementes florestais, viabilidade, sucará.
APPLICATION OF THE TETRAZOLIUM TEST IN Gleditschia amorphoides Taub. SEEDS –
CAESALPINACEAE
ABSTRACT - The objectives of the study were to standardize the tetrazolium test and to evaluate
its applicability to estimate viability of Gleditschia amorphoides seeds. Initially, different pre-
conditioning treatments were tested: intact seed, mechanical scarification, scarification followed
by 24 or 48 hours of imbibition, with and without seed coat removal. All the pre-treated seeds were
submitted to 1, 3 or 6 hours in tetrazolium solution at 0.025; 0.050; 0.075 and 0.10% at 35ºC, in the
dark. Seeds subjected to scarification and imbibed for 48 hours, with seed coat removal immersed
in 0.075 % solution for 3 hours presented ideal coloration making possible the distinction of viable
from unviable seeds. Using the above described protocol we evaluated it to estimate viability of
Gleditschia amorphoides seeds by comparing with germination tests. There were no significant
differences between results from either test. The protocol using 0.075% tetrazolium solution for 3
hours can estimate viability of Gleditschia amorphoides seeds.
Index terms: forest seeds, viability, sucará.
1 Submetido em 01/03/2005. Aceito para publicação em 08/06/2006;
2 Pós-graduanda Engenharia Florestal, UFPR, CEP: 80210-170, Curitiba –
PR, fogacac@zipmail.com.br;
3 Professor UNIOESTE - CCA, Marechal Cândido Rondon - PR. CEP:
85960-000, malavasi@unioeste.br;
4 Pós-graduando em Agricultura, FCA/UNESP, Botucatu – SP,
claudemir@fca.unesp.br.
INTRODUÇÃO
Gleditschia amorphoides Taub. (sucará), pertence à
família Caesalpinaceae sendo recomendada para
reflorestamentos heterogêneos com fins preservacionistas.
As sementes desta espécie quando escarificadas levam de
quatro a cinco semanas para germinarem (Lorenzi, 1998).
Fogaça et al. (1999) observaram que quando as sementes de
sucará foram submetidas à escarificação mecânica, a emissão
da raiz primária ocorreu sete dias após a semeadura. No
C.A. FOGAÇA et al.
Revista Brasileira de Sementes, vol. 28, nº 3, p.101-107, 2006
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entanto, para a completa germinação são necessárias quatro
semanas. O resultado do teste de germinação pode já não
mais representar a real capacidade de germinação do lote,
uma vez que alterações na qualidade da semente podem ocorrer
dependendo das condições ambientais.
Considerando que a maioria das espécies florestais exige
longo período para germinar, até um ano com sementes de
Bertholletia excelsa (castanha-do-pará) ou seis meses com
sementes de Joahnesia princeps (boleira), o desenvolvimento
de testes rápidos e eficientes para a avaliação da viabilidade
de sementes é necessário (Piña-Rodrigues e Santos, 1988).
Embora o teste de germinação seja o parâmetro oficial
mais utilizado para avaliar a qualidade fisiológica de lotes de
sementes, Vieira (1988), Arthur e Tonkin (1991),
Krzyzanowski et al. (1991) e Piana et al. (1992) atribuíram
sérias limitações àquele teste. Além da demora na execução, o
teste de germinação não permite precisão na identificação dos
fatores que afetam a qualidade das sementes e os resultados
podem ser alterados pela presença de fungos. Assim, a avaliação
da qualidade de sementes com testes rápidos que
proporcionem resultados reproduzíveis tem sido alvo
constante dos Tecnologistas de Sementes (Prete et al., 1993).
Entre os testes indiretos considerados rápidos, o teste
de tetrazólio destaca-se, pois além de avaliar a viabilidade e o
vigor, permite em alguns casos a identificação dos fatores
que influenciam a qualidade das sementes como danos
mecânicos e os causados pela secagem, por insetos e
deterioração por umidade (Bhéring et al., 1996; França Neto,
1999).
O teste de tetrazólio fundamenta-se na alteração da
coloração dos tecidos da semente em presença de uma solução
de sal de tetrazólio, o qual é reduzido pelas enzimas
desidrogenases dos tecidos vivos, resultando num composto
denominado de formazam, de coloração vermelha-carmim.
Tecidos mortos ou muito deteriorados apresentaram-se
descoloridos. O padrão de coloração dos tecidos pode ser
utilizado para identificar sementes viáveis, não viáveis e, dentro
da categoria viável, as de alto e baixo vigor (Vieira e Von-
Pinho, 1999). A coloração vermelha-brilhante ou rosa-brilhante
se desenvolve quando o hidrogênio resultante do processo de
respiração das células vivas combina-se com a solução de
tetrazólio absorvida. Os tecidos do embrião viável absorvem
a solução de tetrazólio lentamente e tendem a desenvolver
uma coloração mais leve que os embriões deteriorados que
adquirem uma cor vermelha-carmim forte. A presença de
tecidos não coloridos, firmes e sadios sugere maior resistência
à penetração da solução de tetrazólio do que a morte do tecido.
O tecido morto geralmente é caracterizado por cor branca ou
amarelada e textura flácida (Bhéring et al., 1996; França Neto,
1999).
O teste de tetrazólio apresenta várias vantagens: não é
afetado por diversas condições que podem alterar os resultados
do teste padrão de germinação, como a presença de fungos;
enfoca as condições físicas e fisiológicas do embrião de cada
semente individualmente; permite rápida avaliação da
viabilidade; permite em algumas espécies, como soja e feijão,
a identificação de diferentes níveis de viabilidade; pode
fornecer o diagnóstico da causa da perda da viabilidade das
sementes e requer equipamento simples e barato (Delouche
et al., 1976; França Neto et al., 1998; França Neto, 1999).
Conforme Piña-Rodrigues e Santos (1988), o teste de
tetrazólio não é muito difundido entre espécies perenes, como
florestais e frutíferas, embora apresente excelentes condições
para ser utilizado rotineiramente, uma vez que muitas dessas
espécies necessitam de longo período para germinarem. Em
vista dessa situação, pesquisas têm sido desenvolvidas
procurando abreviar o prazo requerido para obtenção dos
resultados do teste de tetrazólio, a partir da definição de
metodologia adequada e padronizada para cada espécie
(Nascimento e Carvalho, 1998).
Assim, a metodologia para o teste de tetrazólio vem sendo
estudada para diversas espécies florestais como canela preta
(Silva et al., 1997); jenipapo (Nascimento e Carvalho, 1998);
farinha seca (Zucareli et al., 1999); araucária (Sorol e Pérez,
2001); canafístula (Oliveira et al., 2001a); copaíba (Fogaça
et al., 2001); guapuruvu (Paula et al., 2001); ipê-amarelo
(Oliveira et al., 2001b); louropardo (Mendonça et al., 2001)
e pata-de-vaca (Krohn et al., 2001).
Diante do exposto, o presente trabalho teve por objetivos
padronizar a metodologia do teste de tetrazólio e avaliar a
aplicabilidade deste para a estimativa da viabilidade de sementes
de Gleditschia amorphoides Taub.
MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho foi conduzido no Laboratório de Tecnologia
de Sementes da Universidade Estadual do Oeste do Paraná,
Marechal Cândido Rondon, em duas fases. Na primeira, foram
utilizadas sementes de Gleditschia amorphoides recém-
coletadas na Área de Relevante Interesse Ecológico (ARIE),
município de Santa Helena - PR, testando-se diferentes
tratamentos de pré-condicionamento das sementes,
concentrações da solução de tetrazólio e períodos de
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Revista Brasileira de Sementes, vol. 28, nº 3, p.101-107, 2006
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embebição à solução de tetrazólio.
Antes do período de reação na solução de tetrazólio, as
sementes foram submetidas aos seguintes pré-tratamentos:
controle, sementes escarificadas manualmente (com lixa nº
80 na região oposta ao embrião), e sementes escarificadas
manualmente e submetidas a 24 ou 48 horas de embebição,
entre papel-toalha umedecido com água a 25ºC, com e sem
posterior retirada do tegumento. A retirada do tegumento foi
executada manualmente evitando-se danos ao embrião.
Após as preparações acima descritas, as sementes foram
submersas por 1, 3 ou 6 horas em solução de 2,3,5 trifenil
cloreto de tetrazólio (pH 6,5 a 7,0) nas concentrações de
0,025; 0,050; 0,075 ou 0,10%, em câmara regulada a 35ºC,
no escuro. Utilizaram-se quatro repetições de 25 sementes
para cada combinação de preparação da semente, concentração
da solução de tetrazólio, e período de coloração. As sementes
foram acondicionadas em recipientes plásticos de 200mL com
solução de tetrazólio em quantidade suficiente para cobri-las.
Ao término de cada período de coloração, a solução foi
drenada, as sementes lavadas em água corrente e mantidas
submersas em água em ambiente refrigerado até o momento
da avaliação.
As sementes foram avaliadas uma a uma, seccionando-
as longitudinalmente através do centro do eixo embrionário
com auxílio de bisturi. A visualização de todos os detalhes das
sementes contou com o auxílio de um microscópio
estereoscópico de quatro aumentos (4x). Para a caracterização
das classes de coloração, elaborou-se uma representação de
oito diagramas de coloração das sementes, observando-se a
presença e a localização de danos, além das condições físicas
das estruturas embrionárias. A escolha do procedimento de
preparação e das condições mais adequadas considerou o
aspecto dos tecidos, a intensidade e a uniformidade da
coloração.
Na segunda fase deste estudo, a eficácia do teste de
tetrazólio na estimativa da viabilidade de sementes de sucará
foi avaliada através da comparação dos resultados dos testes
de tetrazólio e germinação. Para a comparação foram utilizados
três lotes de sementes coletados no local anteriormente
descrito. O LOTE 1 foi armazenado por dois anos, sendo o
primeiro ano em câmara fria a 15ºC e o segundo ano em
câmara com temperatura entre 18-20ºC e 40% de umidade
relativa do ar (UR), em saco plástico. O LOTE 2 foi
armazenado por um ano, embalado em saco plástico, e
mantido em câmara com temperatura entre 18-20ºC e 40%
de UR. O LOTE 3 foi coletado e utilizado imediatamente.
De acordo com as recomendações de Delouche et al.
(1976), os lotes utilizados foram divididos em duas amostras;
uma utilizada para o teste de germinação e a outra para o teste
de tetrazólio. O grau de umidade foi determinado de acordo
com as Regras para Análise de Sementes (Brasil, 1992).
O teste de germinação foi realizado com quatro repetições
de 25 sementes, em rolos de papel, em câmara de germinação
à temperatura constante de 25ºC e fotoperíodo de 12 horas.
As avaliações foram realizadas diariamente, a partir do
momento em que as plântulas apresentaram todas as suas
estruturas desenvolvidas. Os resultados foram expressos em
porcentagem de plântulas normais.
Pelo fato do teste de tetrazólio não diferenciar sementes
dormentes daquelas não-dormentes (Grabe, 1976), evitou-se
discrepâncias entre os resultados dos testes de tetrazólio e de
germinação submetendo as sementes de sucará ao tratamento
indicado para superação da dormência (Fogaça et al., 1999)
antes da realização dos testes.
Para o teste de tetrazólio foram utilizadas quatro
repetições de 25 sementes escarificadas com lixa nº80,
submetidas a 48 horas de embebição entre papel toalha a 25ºC,
com posterior retirada manual do tegumento. As sementes
foram então submersas em solução de tetrazólio a 0,075%
por 3 horas. Durante o período de coloração as amostras
foram mantidas a 35ºC, no escuro. Após este período, as
sementes foram avaliadas individualmente, seccionando-as
longitudinalmente através do centro do eixo embrionário com
auxílio de bisturi. As estruturas e sua coloração foram
observadas com auxílio de microscópio estereoscópico de
quatro aumentos (4x). Para a caracterização dos níveis de
viabilidade foi elaborada uma representação de sementes viáveis
e inviáveis, observando a presença e a localização do dano,
além das condições físicas das estruturas embrionárias. A
diferenciação de cores dos tecidos foi observada de acordo
com os critérios estabelecidos para o teste de tetrazólio
(Delouche et al, 1976; Bhéring et al., 1996; França Neto, 1999):
vermelho brilhante ou rosa (tecido vivo e vigoroso), vermelho-
carmim forte (tecido em deterioração) e branco leitoso ou
amarelado (tecido morto).
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado.
Os resultados obtidos nos testes de germinação e tetrazólio,
para cada lote, foram submetidos à análise de variância e as
médias comparadas através do teste de Tukey a 5% de
probabilidade.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Independentemente das concentrações da solução de
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tetrazólio e do tempo de reação estabelecido, não houve
desenvolvimento de coloração nas sementes intactas
(controle). Este fato pode ser atribuído ao tegumento
impermeável desta espécie que impediu a penetração da
solução de tetrazólio. De acordo com Grabe (1976),
tegumentos espessos e duros devem ser removidos antes da
coloração, como é o caso das sementes de algodão.
Nas preparações com escarificação mecânica e
escarificação seguida de embebição por 24 horas sem retirada
do tegumento, as sementes apresentaram coloração original,
com exceção da região escarificada que se apresentou
levemente colorida. Esta ausência de coloração pode ser
atribuída a dois aspectos: presença do tegumento ou formação
de substância gelatinosa na região escarificada, impedindo ou
dificultando a penetração uniforme da solução do tetrazólio
para o interior da semente. A remoção do tegumento das
sementes, antes da imersão em solução de tetrazólio, embora
seja uma operação delicada e trabalhosa, possibilita reduzir o
tempo necessário para que estas adquiram a coloração
adequada (Bittencourt e Vieira, 1999).
A preparação envolvendo escarificação mecânica, seguida
de embebição em água por 24 horas e retirada manual do
tegumento apresentou coloração desuniforme. Muitas
sementes não apresentaram coloração na região central do
tecido de reserva e no eixo embrionário, colorindo apenas
nas extremidades das sementes, devido aos danos causados
pela retirada do tegumento, não permitindo a correta avaliação.
Os problemas com as observações do presente estudo são
similares àquelas de Delouche et al. (1976) com sementes de
rabanete escarificadas, submetidas à embebição em água por
uma noite, seguido da retirada do tegumento e submersas em
solução de tetrazólio 1,0% por 1 a 2 horas a 40ºC.
As sementes que durante a preparação foram submetidas
à escarificação mecânica seguidas de embebição por 48 horas,
sem retirada do tegumento, apresentaram coloração intensa
na região escarificada, com manchas rosadas dispersas no
tecido de reserva, sem contudo atingiro eixo embrionário.
Considerando que o embrião, localizado na parte interna da
semente, é a principal estrutura a ser analisada na determinação
da viabilidade e do vigor, a coloração da parte interna da
semente é fundamental.
As sementes escarificadas e embebidas em água por 48
horas, com retirada do tegumento, quando submersas em
tetrazólio a 0,050 ou 0,075% por 3 horas ou 6 horas ou em
solução a 0,10% por uma hora apresentaram coloração ideal,
permitindo a diferenciação e avaliação das condições em que
se encontravam os tecidos das sementes. Quando se utilizou
a concentração de 0,10% por períodos superiores a uma hora
houve desenvolvimento de coloração intensa, impossibilitando
a avaliação das condições dos tecidos das sementes.
O preparo das sementes, a concentração da solução de
tetrazólio e o tempo de coloração são específicos para cada
espécie. Utilizando sementes de guapuruvu, Paula et al. (2001)
obtiveram distinta coloração dos tecidos vivos com sementes
embebidas por 48 horas a 35ºC, com posterior retirada do
tegumento, utilizando solução de tetrazólio a 0,10% por 4
horas ou 0,20% por 3 horas, acondicionadas em câmara a
35ºC, no escuro. Krohn et al. (2001) reportaram resultados
consistentes do teste de tetrazólio em sementes de pata-de-
vaca com embebição por 16 horas a 35ºC e posterior retirada
do tegumento, submetidas à solução 0,050% por 3 ou 4 horas,
em câmara a 35ºC.
Na Figura 1 está representada, em diagrama, a
classificação dos níveis de viabilidade estabelecidos no teste
de tetrazólio para sementes de Gleditschia amorphoides
considerando as seguintes características como critério para
a classificação das sementes: 1. tecidos com coloração
vermelha brilhante uniforme ou rósea são típicos de tecido
sadio; 2. tecidos com coloração branca ou amarelada são
tecidos mortos; 3. tecidos com coloração vermelha intensa
são tecidos em deterioração. A descrição das classes de
viabilidade é a seguinte:
Classe 1 – Viável: semente com coloração rósea uniforme
e todos os tecidos com aspecto normal e firme;
Classe 2 – Viável: semente apresentando menos de 50%
dos cotilédones com coloração vermelha intensa, típico de
tecido em deterioração;
Classe 3 – Viável: extremidade da radícula com coloração
branca leitosa sem atingir o cilindro central, além de apresentar
manchas branca leitosa e vermelha intensa dispersas;
Classe 4 – Viável: semente apresentando menos de 50%
da região cotiledonar com coloração branca leitosa,
caracterizando tecido morto;
Classe 5 – Inviável: eixo embrionário e mais de 50% da
região cotiledonar apresentando coloração vermelha intensa
típica de tecidos em deterioração;
Classe 6 – Inviável: semente totalmente com coloração
vermelha intensa, indicando processo acentuado de
deterioração;
Classe 7 – Inviável: eixo embrionário com coloração
branca leitosa, apresentando o cilindro central com coloração
vermelha intensa. Região cotiledonar apresentando mais de
50% com coloração branca leitosa, com manchas vermelhas
intensas dispersas;
TESTE DE TETRAZÓLIO EM SEMENTES DE SUCARÁ
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Classe 8 – Inviável: semente totalmente branca leitosa
apresentando tecidos flácidos.
Não foi observada diferença estatisticamente significativa
entre as amostras retiradas dos três lotes de sementes de
Gleditschia amorphoides em relação ao grau de umidade cuja
média foi de 8%.
Conforme os resultados expressos na Tabela 1,
observou-se que a metodologia empregada para o teste de
tetrazólio não proporcionaram estimativas de viabilidade das
sementes de Gleditschia amorphoides diferentes dos resultados
obtidos no teste de germinação. Amaral e Alcalay (1997)
indicaram que o teste de tetrazólio é uma alternativa rápida e
precisa para a avaliação da qualidade fisiológica de sementes
das espécies florestais Aleurites fordii (tungue), Cedrela fissilis
(cedro), Jacaranda micrantha (caroba), Leuhea divaricata
(açoita-cavalo), e Hovenia dulcis (uva-do-Japão).
O teste de tetrazólio por se tratar de um teste rápido e
confiável na análise de sementes, fornecendo informações
mais rapidamente que o teste de germinação, é recomendado
para avaliação de várias espécies florestais, tais como,
Kielmeyera coriacea - pau-de-santo (Davide et al., 1997),
Magonia pubescens - tingui (Malavasi et al., 1997), Albizia
hasslerii - farinha seca (Malavasi et al., 1999), Tapirira
guianensis - gurucaia (Ramos et al., 1999), Aspidosperma
subincanum - peroba-de-gomo, Aspidosperma discolor -
guatambu vermelho e Tabebuia alba - ipê-amarelo (Matteucci
et al., 1997).
Conforme discutidas e justificadas, as condições
empregadas para a avaliação da eficiência do teste de tetrazólio
foram definidas levando em consideração à facilidade de
Classe 1 Classe 2 Classe 3 Classe 4
Classe 5 Classe 6 Classe 7 Classe 8
Legenda: Róseo Branco leitosoVermelho intenso
FIGURA 1. Representação diagramática das classes de sementes estabelecidas no teste de tetrazólio para a espécie florestal
Gleditschia amorphoides.
Lotes Amostras Germinação % Tetrazólio %
1 91 Aa
(1)
86 Aa
1
2 89 Aa 87 Aa
1 87 Aa 91 Aa
2
2 90 Aa 91 Aa
1 96 Aa 98 Aa
3
2 95 Aa 98 Aa
TABELA 1. Resultados do teste de germinação e do teste de
tetrazólio para avaliação da viabilidade de sementes
de Gleditschia amorphoides.
(1) Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas na coluna e minúsculas na
linha, não diferem estatisticamente pelo Teste de Tukey, a 5% de
probabilidade.
C.A. FOGAÇA et al.
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exposição dos tecidos, à economicidade, à rapidez para a
obtenção dos resultados e à comparação com o teste de
germinação. A interpretação dos resultados obtidos neste
trabalho permite inferir que o teste de tetrazólio pode ser
utilizado na determinação da viabilidade das sementes de
Gleditschia amorphoides.
CONCLUSÃO
 O procedimento com sementes escarificadas
mecanicamente, embebidas em água por 48 horas, com
posterior retirada do tegumento e expostas à solução de
tetrazólio 0,075% por 3 horas a 35ºC no escuro é adequado
para avaliação da viabilidade de sementes de Gleditschia
amorphoides.
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