CommiphoraleptophloeosMart-Medeiros-2019

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Humanas / Sociais

Estude com artigos

07/05/2023

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

RENATO DANTAS DE MEDEIROS

Commiphora leptophloeos (MART.) J.B. GILLETT (BURSERACEAE): ESTUDO
FITOQUÍMICO, TOXICIDADE E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-
INFLAMATÓRIO E ANTIMICROBIANO

NATAL/RN
2019
RENATO DANTAS DE MEDEIROS

Commiphora leptophloeos (MART.) J.B. GILLETT (BURSERACEAE): ESTUDO
FITOQUÍMICO, TOXICIDADE E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTI-
INFLAMATÓRIO E ANTIMICROBIANO

Dissertação de Mestrado apresentada à Coordenação
do Programa de Pós-graduação em Ciências
Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.

Orientadora: Profa. Dra. Silvana Maria Zucolotto Langassner.

NATAL/RN
2019
Medeiros, Renato Dantas de.
Commiphora leptophloeos (Mart.) J.B. Gillett (Burseraceae):
estudo fitoquímico, toxicidade e avaliação do potencial anti-
inflamatório e antimicrobiano / Renato Dantas de Medeiros. -
2019.
123f.: il.
Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) -
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências
da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
Natal, RN, 2019.
Orientadora: Silvana Maria Zucolotto Langassner.
1. Burseraceae - Dissertação. 2. Inflamação - Dissertação. 3.
Infecção - Dissertação. 4. Flavonoides - Dissertação. 5.
Procianidinas - Dissertação. I. Langassner, Silvana Maria
Zucolotto. II. Título.
RN/UF/BS-CCS CDU 582.746.36
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263
AGRADECIMENTOS

De um modo especial e sentido quero agradecer à Profa. Silvana Maria Zucolotto
Langassner, que durante a realização deste trabalho tem sido simplesmente incansável,
demonstrando sempre disponibilidade para me auxiliar e orientar. Não deixando em
esquecimento, uma infindável gratidão por toda amizade, confiança, atenção, compreensão e
incentivo. Obrigado pela oportunidade e por me aceitar como orientando por mais 4 anos do
doutorado.
Ao Prof. Raphäel Grougnet, por todo o ensinamento e receptividade dada durante o
estágio de mestrado na Université Paris Descartes.
A doutoranda Júlia Morais, por todo ensinamento, amizade e confiança. Também,
agradeço de coração pela disponibilidade de me ajudar durante todo esse trabalho e
principalmente durante o estágio na Université Paris Descartes.
Ao Prof. Matheus Fernandes Pedrosa, pela colaboração que foi fundamental para a
realização da avaliação da atividade anti-inflamátoria in vivo.
As doutorandas Allanny Furtado e Manoela Torres, pela ajuda incansável na
realização dos experimentos de atividade anti-inflamatória in vivo e durante a escrita do
artigo.
À Profa. Gerlane Coelho Bernardo Guerra e ao doutorando Anderson Wilbur pela
colaboração e auxílio durante os experimentos ex vivo da atividade anti-inflamatória e de
estresse oxidativo
Ao Prof. Wagner Vilegas e a sua doutoranda Ana Zanatta, pelo auxílio durante as
análises por espectrometria de massas e de validação.
Ao Prof. Guilherme Chaves e a doutoranda Luanda Souza, pela colaboração nos
experimentos da atividade antifúngica.
À Dra. Marylin Lecsö-Borne e ao doutorando Sergio Aguierre, pela realização dos
experimentos da atividade antibacteriana.
Ao Prof. Euzébio Guimarães e a mestranda Estela Mariana, pela realização do estudo
in sílico.
À Profa. Marcela Ururahy e aos doutorandos Samara Ferreira e Ivan Marques, pela
colaboração e auxílio durante o estudo de toxicidade aguda.
Ao prof. Leandro de Santis Ferreira, pela participação na minha banca de
qualificação e por todas as conseiderações e correções deste trabalho.
Aos meus colegas de mestrado, Estela Mariana, Luana Carvalho, Paulo Henrique e
Valéria Costa que durante a realização deste trabalho sempre me ouviram, me auxiliaram nas
disciplinas e me cederam à mão amiga nos dias mais difíceis. A vocês o meu muito obrigado.
Aos meus colegas do laboratório, Barbara Cabral, Emerson Siqueira, Fernanda
Santos, Letícia Gondim, Raquel Barbosa e Larissa Marina pela recepção, atenção, carinho e
apoio. Na partida levarei saudades, deixando aqui o meu agradecimento a todos pela ajuda e
amizade.
À Pro-Reitoria de Pós-Graduação da UFRN, pelos auxílios financeiros concedidos
para a realização dos estágios na Université Paris Descartes e na UNESP.
À CAPES pelo auxílio financeiro a essa pesquisa.

RESUMO

A espécie Commiphora leptophloeos (Mart.) J.B. Gillett (Burseraceae) é uma planta nativa do
Brasil, pertence ao bioma caatinga e é conhecida popularmente como “imburana-de-espinho”
ou “imburana-de-cambão”. Os estudos etnofarmacológicos citam o uso da espécie no
tratamento de inflamações e infecções. Dentro deste contexto, o presente estudo objetivou
avaliar a toxicidade, a atividade anti-inflamatória e antimicrobiana em ensaios não clínicos in
vitro e in vivo dos extratos das folhas e das cascas do caule e isolar, identificar e quantificar os
marcadores químicos. No estudo fitoquímico, o extrato hidroetanólico foi preparado por
maceração e as frações foram obtidas por particição líquido-líquido (fração diclorometano,
acetato de etila-AcOEt e n-butanol-BuOH). O isolamento, a elucidação estrutural e a
caracterização das substâncias nos extratos foram realizadas por CPC, CL-EM, FIA-ESI-IT-
MS/MS e RMN de
1
H e a quantificação dos marcadores nos extratos por CLAE-DAD-ELSD.
A toxicidade dos extratos foi avaliada in vitro pelo ensaio de MTT e citometria de fluxo e in
vivo pelo teste de toxicidade aguda, via oral. A atividade anti-inflamatória in vitro foi avaliada
pelo ensaio de óxido nítrico induzido por LPS e in vivo nos modelos de edema de pata
induzido por carragenina e de bolsa de ar induzida por zimosam. A atividade antimicrobiana
foi avaliada pela determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e triagem virtual
dos compostos isolados foi realizada por estudos in sílico. Do extrato das folhas, foram
isolados 2 flavonoides por CPC e caracterizadas 16 substâncias por espectrometria de massas
como ácidos fenólicos, flavonoides glicosilados derivados de quercetina, luteolina, apigenina
e taninos condensados derivados de catequina. Do extrato das cascas do caule foram isolados
2 taninos por CPC e caracterizadas 8 substâncias como ácidos fenólicos e procianidinas. O
extrato das folhas a 200 µg/mL e o extrato das cascas do caule nas concentrações de 1, 10,
100 e 200 µg/mL demonstraram efeito anti-inflamatório in vitro no ensaio de óxido nítrico
induzido por LPS. No modelo de edema de pata induzido por carragenina, o extrato das folhas
e das cascas do caule nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg, via oral, reduziu significativamente
(p<0,001) o edema seguido da redução da mieloperoxidase (MPO) e no modelo de bolsa de ar
induzido por zimosam, nas mesmas doses testadas, reduziram significativamente (p<0,001) a
migração celular, a concentração de proteínas totais, a mieloperoxidase (MPO), os níveis de
malondialdeído (MDA) e da citocina pró-inflamatória TNF-α e aumentou a produção da
citocina anti-inflamatória IL-10. Na avaliação da atividade antimicrobiana, o extrato das
cascas do caule e as frações AcOET e BuOH demostraram efeito fungistático e bactericida. O
estudo in sílico indicou possíveis ligantes da procianidina dimérica do tipo B e isovitexina
relacionados à atividade anti-inflamatória e antimicrobiana. Os resultados obtidos são inéditos
para a espécie, justificam seu uso na medicina popular e revelam que os extratos das folhas e
das cascasdo caule da espécie apresentam um potencial terapêutico para o desenvolvimento
de fitoterápicos com propriedades anti-inflamatórias e antimicrobianas.

Palavras chaves: Burcereceae. Inflamação. Infecção. Flavonoides. Procianidinas.

ABSTRACT

The specie Commiphora leptophloeos (Burseraceae) is a native plant from Brazil, belongs to
caatinga biome and is known popularly as “imburana-de-espinho” and “imburana-de-
cambão”. The ethnopharmacology studies mention the use of this specie in the treatment of
inflammations and infections. In this context, the present study aimed to evaluate the toxicity,
anti-inflammatory and antimicrobial activity in non-clinical in vitro and in vivo assays of leaf
and stem bark extracts, and to isolate, identify and quantify chemical markers. In the
phytochemical study, the hydroethanolic extract was prepared by maceration and the
fractionation was performaded by liquid-liquid partition (dichloromethane, ethyl acetate-
AcOEt and n-buthanol-BuOH fractions). Isolation, structural elucidation and characterization
of the extracts were performed by CPC, LC-MS, FIA-ESI-IT-MS/MS and
1
H NMR and
quantification of the content of markers in the extracts was made by HPLC-DAD and HPLC-
ELSD. The toxicity of both extracts was evaluated by MTT and flow cytometry assays and in
vivo by the acute toxicity test. The in vitro anti-inflammatory activity was evaluated using
LPS-induced nitric oxide assay and in viv by carrageenan-induced paw edema and oral
zymosan induced air pocket models. The antimicrobial activity was measured by the
determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and virtual screening of the
isolated compounds was performed by in silico studies. From leaves extract, 2 flavonoids
were isolated by CPC and 16 compounds were characterized by Mass spectrometry such as
phenolic acids, glycosylated flavonoids derivatives of quercetin, luteolin and apigenin, and
condensed tannins derivatives of catechin. From the stem bark extract, 2 tannins were isolated
by CPC and 8 compounds were characterized as phenolic acids and procyanidins. The leaves
extract at 200 µg/mL and stem bark extract at concentrations of 1, 10, 100 and 200 µg/mL
demonstrated in vitro anti-inflammatory effect in the LPS-induced nitric oxide assay. In the
carrageenan-induced paw edema of model, the extracts of leaves and stem bark at the doses of
100, 200 and 400 mg/kg, by oral route, significantly reduced the edema followed by reduction
of myeloperoxidase (MPO) and in the zymosan-induced model of pouch-air, at doses tested,
significantly reducing (p < 0.001), cell migration, total protein concentration,
myeloperoxidase (MPO), and malondialdehyde (MDA) and the proinflammatory cytokine
TNF-α and increased the production of the anti-inflammatory cytokine IL-10. In the
evaluation of the antimicrobial activity, the extracts of the barks and the AcOET and BuOH
fractions at concentrations of 20 to 100 μg/mL demonstrated a fungistatic and bactericidal
effect. The in silico study indicated possible ligands of type B dimeric procyanidin and
isovitexin related to anti-inflammatory and antimicrobial activity. The results obtained are
unprecedent for the specie, justify its use in folk medicine and reveals that extracts of leaves
and stem bark have a therapeutic potential for the development of herbal products with anti-
inflammatory and antimicrobial properties.
Key-words: Burcereceae. Inflammation. Infection. Flavonoids. Procyanidins.
LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Commiphora leptophloeos. ..................................................................................... 21
Figura 2 – Perfil fitoquímico por CCD dos extratos hidroetanólico (EH) e aquosos das folhas
e das cascas do caule de C. leptophloeos.................................................................................. 47
Figura 3 – Cromatograma do EH das folhas de C. leptophloeos por CLAE-DAD. ................. 49
Figura 4 – Espectros de UV do EH das folhas de C. leptophloeos. ......................................... 49
Figura 5 – Cromatograma do EH das cascas do caule de C. leptophloeos por CLAE-DAD. .. 50
Figura 6 – Espectro de UV do EH das cascas do caule de C. leptophloeos. ............................ 50
Figura 7 – Espectro de massas de primeira-ordem, em full-scan, no modo negativo, do EH das
folhas de C. leptophloeos. ........................................................................................................ 51
Figura 8 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 191, em modo negativo com energia
de colisão 30 eV. ...................................................................................................................... 52
Figura 9 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 191, em modo negativo com energia
de colisão 30 eV. ...................................................................................................................... 53
Figura 10 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 447, em modo negativo com energia
de colisão 30 eV. ...................................................................................................................... 54
Figura 11 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 483, em modo negativo com energia
de colisão 30 eV. ...................................................................................................................... 55
Figura 12 – Íons de produtos formados pelas eliminações na EHxose ligada as posições 6-C
ou 8-C da aglicona. ................................................................................................................... 56
Figura 13 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 431, em modo negativo com energia
de colisão 30 eV. ...................................................................................................................... 56
Figura 14 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 551, em modo negativo com energia
de colisão 30 eV. ...................................................................................................................... 57
Figura 15 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 615, em modo negativo com energia
de colisão 30 eV. ...................................................................................................................... 58
Figura 16 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 623, em modo negativo com energia
de colisão 30 eV. ...................................................................................................................... 59
Figura 17 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 639, em modo negativo com energia
de colisão 30 eV. ...................................................................................................................... 60
Figura 18 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 289, em modo negativo com energia
de colisão 30 eV. ...................................................................................................................... 60
Figura 19 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 577, em modo negativo com energia
de colisão 30 eV. ...................................................................................................................... 61
Figura 20 – Proposta de fragmentação para a procianidina dimérica do tipo B. ...................... 62
Figura 21 – Espectro de massas do íon precursor de m/z 865, em modo negativo com energia
de colisão 30 eV. ...................................................................................................................... 63
Figura 22 Espectro de massas do íon precursor de m/z 1153, em modo negativo com energia
de colisão 30 eV. ...................................................................................................................... 64
Figura 23 – Espectro de massas de primeira-ordem, em full-scan, no modo negativo, do EH
das cascasdo caule de C. leptophloeos. ................................................................................... 65
Figura 24 – Espectro de massas de primeira-ordem, em full-scan, no modo negativo, da fração
BuOH das cascas do caule de C. leptophloeos. ........................................................................ 66
Figura 25 – Cromatograma do EH das folhas de C. leptophloeos por LC-MS/MS. ................ 67
Figura 26 – Cromatograma do EH das cascas do caule de C. leptophloeos por LC-MS/MS. . 68
Figura 27 – Esquema representativo do fracionamento e isolamento guiado pelo efeito
antimicrobiano do EH das cascas do caule. .............................................................................. 71
Figura 28 – Espectro de RMN de
1
H de quercitrina (MeOD, 400 MHz). ................................ 73
Figura 29 – Espectro de RMN de
1
H de isovitexina (MeOD, 400 MHz)................................. 74
Figura 30 – Cromatograma por CLAE-DAD do EH das folhas e padrão isovitexina de C.
leptophloeos. UV= 340 nm. ...................................................................................................... 78
Figura 31 – Curva analítica da linearidade para isovitexina .................................................... 79
Figura 32 – Cromatograma por CLAE-ELSD do EH das folhas e do padrão procianidina
dimérica do tipo B de C. leptophloeos. .................................................................................... 82
Figura 33 – Curva analítica da linearidade para procianidina dimérica do tipo B. .................. 83
Figura 34 – Potencial inibitório de óxido nítrico (NO) estimulado por LPS dos EH das folhas
e das cascas do caule de C. leptophloeos.................................................................................. 85
Figura 35 – Avaliação dos EH das folhas Cl(L) e das cascas do caule Cl(B) de C. leptophloeos
no modelo edema de pata induzida por carragenina................................................................. 86
Figura 36 – Efeito dos EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos na atividade da
MPO no modelo edema de pata induzido por carragenina. ...................................................... 88
Figura 37 – Efeito dos EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos na migração
leucocitária a partir do modelo de bolsa de ar induzido por zimosam. .................................... 89
Figura 38 – Efeito dos EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos nos níveis de
proteínas a partir do modelo de bolsa de ar induzido por zimosam. ........................................ 90
Figura 39 – Efeito dos EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos nos níveis de
malondialdeído (MDA) a partir do modelo de bolsa de ar induzido por zimosam. ................. 91
Figura 40 – Efeito dos EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos na atividade da
MPO dos exsudatos da bolsa de ar. .......................................................................................... 92
Figura 41 – Ensaio de MTT realizado com macrófagos (RAW264.7). ................................. 106
LISTA DE QUADROS

Quadro 1 – Estudos etnobotânicos de Commiphora leptophloeos..........................................24
Quadro 2 – Composição química de Commiphora leptophloeos.............................................26
Quadro 3 – Atividades farmacológicas de Commiphora leptophloeos....................................28

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Triagem fitoquímica qualitativa por reações químicas para detecção de metabólitos
secundários presentes nos extratos das folhas e das cascas de C. leptophloeos. ...................... 47
Tabela 2 – Substâncias identificadas no EH das folhas de C. leptophloeos por LC-MS/MS. . 67
Tabela 3 – Substâncias identificadas no extrato das cascas do caule de C. leptophloeos por
LC-MS/MS. .............................................................................................................................. 68
Tabela 4 – Substâncias identificadas no EH das folhas de C. leptophloeos por LC-MS/MS e
FIA-ESI-IT-MS/MS. ................................................................................................................ 69
Tabela 5 – Substâncias identificadas no EH das cascas do caule de C. leptophloeos por LC-
MS/MS e FIA-ESI-IT-MS/MS. ................................................................................................ 69
Tabela 6 – Sistemas de solventes de duas fases por CPC para o EH das folhas. ..................... 70
Tabela 7 – Sistemas de solventes de duas fases por CPC para o EH das folhas. ..................... 71
Tabela 8 – Índices de similaridade espectral entre os espectros de UV de isovitexina e dos
picos 7 e 8 do EH das folhas obtidos por HPLC-DAD ............................................................ 79
Tabela 9 – Parâmetros de validação do método analítico para isovitexina. ............................. 79
Tabela 10 – Concentração das substâncias presentes no EH das folhas de C. leptophloeos.... 80
Tabela 11 – Precisão do método analítico. ............................................................................... 80
Tabela 12 – Parâmetros de validação do método da procianidina dimérica do tipo B............. 83
Tabela 13 – Concentração de procianidina dimérica do tipo B no EH das cascas do caule de
C. leptophloeos. ......................................................................... Erro! Indicador não definido.
Tabela 14 – Concentração inibitória mínima (CIM) dos extratos e frações das folhas e das
cascas do caule de C. leptophloeos. .......................................................................................... 96
Tabela 15 – Concentração inibitória mínima (CIM) dos extratos, frações e isolado de C.
leptophloeos frente a cepas clínicas e de referência de fungos. ............................................. 102
Tabela 16 – Principais resultados da Triagem virtual baseada em ligante para procianidina
dimérica do tipo B. ................................................................................................................. 104
Tabela 17 – Principais resultados da Triagem virtual baseada em ligante isovitexina. ......... 105
Tabela 18 – Fases do ciclo celular em macrófagos (RAW 264.7) tratados com EH das folhas e
das cascas do caule de C. leptophloeos. ................................................................................. 107
Tabela 19 – Efeito dos EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos no peso
corporal e peso corporal relativo em camundongos tratados por via oral. ............................. 109
Tabela 20 – Efeito dos EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos nos parâmetros
bioquímicos em camundongos tratados por via oral. ............................................................. 109
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AcOET Acetato de Etila
ANOVA Análise de Variância
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ASD Ágar Sabourand Dextrose
ATCC American Type Culture Collection
ATP Adenosina Trifosfato
BSA Albumina Bovina
BuOH n-butanol
C-18 Fase Reversa Octadecilsilano
C3H6O Acetona
Car Carragenina
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CHCl3 Clorofórmio
CLAE-DAD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada ao Detector de
Arranjo de Diodos
CLAE-ELSD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada ao Detector
Evaporativo de Espalhamento de Luz
CL-EM Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência acoplada ao Espectrômetro
de Massas
CONCEA Conselho Nacional de Experimentação Animal
COX-1 Ciclo-oxigenase 1
COX-2 Ciclo-oxigenase 2
d Dubleto
dd Duplo dubleto
Dex Dexametasona
DMEM Meio de Eagle modificado por Dulbecco's
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
DMSO Dimetilsulfóxido
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
ELISA Ensaio de Imunoabsorção Enzimática
FDA Food Drug AdministrationFBS Soro Bovino Fetal
FIA-ESI-IT-MS Espectrometria de Massas com analisador do tipo Ion-Itrap com
interface de Ionização por Electrospray e Inserção Direta da Amostra
Fr.Aq Fração aquosa
Fr.BuOH Fração butanólica
Fr.EtOAc Fração acetato de etila
H2O Água
EH Extrato Hidroetanólico
ICH Conferência Internacional sobre Harmonização de Requisitos Técnicos
para o Registro de Produtos Farmacêuticos para Uso Humano
IL-1 β Interleucina-1β
IL-2 Interleucina-2
IL-6 Interleucina-6
IL-8 Interleucina-8
IL -10 Interleucina-10
LPS Lipopolissacarídeos
m Multipleto
m/z Relação Massa/Carga
MDA Malonaldeído
MeOH Metanol
MHC Caldo Mueller-Hinton
MMP-2 Metaloproteinase-2
MMP-9 Metaloproteinase-9
MPO Mieloperoxidase
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
NF-kB Fator Nuclear Kappa B
Nk Células Natural Killer
OECD Guideline For Testing of Chemicals
OMS Organização Mundial de Saúde
PBS tampão fosfato-salino
PGE-2 Prostaglandina 2
RMN
1
H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
s Singleto
Sal Solução salina
SISBIO Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade
SUS Sistema Único de Saúde
TNF-α Fator de Necrose Tumoral-α
UFC Unidades Formadoras de Colônia
UFPE Universidade Federal do Pernambuco
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
UNESP Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho"
UV Ultravioleta
v.o. Via oral
δ Deslocamento químico
SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 17
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................................................................................ 19
2.1 PLANTAS MEDICINAIS NO TRATAMENTO DE DOENÇAS INFLAMATÓRIAS
E INFECCIOSAS ................................................................................................................. 19
2.2 Commiphora leptophloeos (MART.) J.B. GILLETT (BURSERACEAE) .................... 21
2.2.1 Dados botânicos ....................................................................................................... 21
2.3 LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO ....................................................................... 22
2.3.1 Estudos etnobotânicos de Commiphora leptophloeos ............................................. 22
2.3.2 Constituintes químicos de Commiphora leptophloeos ............................................ 24
2.3.3 Atividades farmacológicas de Commiphora leptophloeos ...................................... 26
3 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 29
3.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................................... 29
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 29
4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 30
4.1 MATERIAL VEGETAL ................................................................................................ 30
4.2 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS DAS FOLHAS E DAS CASCAS DO CAULE DE
C. leptophloeos ..................................................................................................................... 30
4.3 ANÁLISES FITOQUÍMICA QUALITATIVA DOS EH DAS FOLHAS E DAS
CASCAS DO CAULE DE C. leptophloeos ......................................................................... 31
4.3.1. Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ...................................... 31
4.3.2 Análise para a detecção de compostos fenólicos ..................................................... 31
4.3.3 Análise para a detecção de taninos .......................................................................... 31
4.3.4 Análise para a detecção de flavonoides ................................................................... 32
4.3.5 Análise para a detecção de saponinas ...................................................................... 32
4.3.6 Análise para a detecção de alcaloides ..................................................................... 32
4.4 PARTIÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DO EXTRATO DAS FOLHAS E DAS CASCAS
DO CAULE DE C. leptophloeos .......................................................................................... 33
4.5 FRACIONAMENTO E ISOLAMENTO ....................................................................... 33
4.5.1 Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC) .......................................................... 33
4.6 IDENTIFICAÇÃO E ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DAS SUBSTÂNCIAS
iSOLADAS ........................................................................................................................... 34
4.6.1 Análise por Ressonância Magnética Nuclear (RMN) ............................................. 34
4.6.2 Análise por Espectroscopia de Massas (EM) .......................................................... 35
4.7 validação do método por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada ao detector
de arranjo de diodos (CLAE-DAD) e ao detector evaporativo de espalhamento de luz
(CLAE-ELSD) ...................................................................................................................... 36
4.7.1 Condições cromatográficas ...................................... Erro! Indicador não definido.
4.8.1 Animais de experimentação .................................................................................... 37
4.8.2 Modelo de edema de pata induzido por carragenina ............................................... 37
4.8.3 Modelo de bolsa de ar induzido por zimosam ......................................................... 38
4.9 ANÁLISE BIOQUÍMICA DA INFLAMAÇÃO E ESTRESSE OXIDATIVO ............ 39
4.9.1 Ensaio da enzima mieloperoxidase (MPO) a partir dos modelos de edema de pata
induzido por carragenina e bolsa de ar induzido por zimosam ........................................ 39
4.9.2 Ensaio de malondialdeído (MDA) dos exsudatos da bolsa de ar ............................ 40
4.9.3 Determinação de proteínas totais dos exsudatos da bolsa de ar .............................. 40
4.9.4 Quantificação das citocinas TNF-α e IL-10 dos exsudatos da bolsa de ar .............. 40
4.9.5 Ensaio de migração leucocitária total e diferencial dos exsudatos da bolsa de ar .. 41
4.9.6 Ensaio de inibição de óxido nítrico (NO) in vitro ................................................... 41
4.10 AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE in vitro E in vivo ......................................... 41
4.10.1 Ensaio de MTT ...................................................................................................... 41
4.10.2 Ciclo celular ........................................................................................................... 42
4.11 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ............................................ 43
4.11.1 Avaliação da atividade antibacteriana ................................................................... 43
4.11.2 Avaliação da atividade antifúngica ....................................................................... 43
4.12 ESTUDO in silico ......................................................................................................... 44
4.12.1 Triagem virtual invertida baseada em ligante ....................................................... 44
4.12.1.1 Procianidina dímero do tipo B ............................................................................ 44
4.12.1.2 Isovitexina .......................................................................................................... 44
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................... 46
5.1 ESTUDO FITOQUÍMICO .............................................................................................46
5.1.1 Análise fitoquímica dos extratos das folhas e das cascas do caule C. leptophloeos 46
5.2 Análise fitoquímica por CLAE-DAD dos EH das folhas e das cascas do caule de C.
leptophloeos .......................................................................................................................... 48
5.4 isolamento e elucidação estrutural dos compostos dos EH das folhas e das cascas do
caule de C. leptophloeos ....................................................................................................... 70
5.4.3 Identificação e elucidação estrutural dos compostos isolados ................................ 72
5.4.1 Desenvolvimento do método analítico por CLAE-DAD para análise do EH das
folhas de C. leptophloeos ................................................................................................. 77
5.4.2 Análise da seletividade do método e quantificação de isovitexina e das substâncias
majoritárias do EH das folhas de C. leptophloeos ............................................................ 78
5.15.5 Análise da seletividade do método e quantificação da substância majoritária no
EH das folhas de C. leptophloeos ..................................................................................... 82
5.5.1. Inibição da produção de Óxido Nítrico (NO) ......................................................... 84
5.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA in vivo............................. 85
5.6.1. Edema de pata induzida por carragenina ................................................................ 85
5.3.2 Bolsa de ar induzido por zimosam .......................................................................... 88
5.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA in vitro .................................. 94
5.3.1. Avaliação da atividade antibacteriana dos extratos EH das folhas e das cascas do
caule, das frações butanólicas e compostos isolados de C. leptophloeos ......................... 94
5.3.1. Avaliação da atividade antifúngica dos EH das folhas e das cascas do caule e das
frações butanólicas e composto isolado de C. leptophloeos ........................................... 100
5.4 ESTUDO in silico ......................................................................................................... 103
5.4.1 Triagem virtual baseada em ligante para o composto isolado procianidina dimérica
do tipo B ......................................................................................................................... 103
5.4.2 Triagem virtual baseada em ligante para o isolado isovitexina ............................. 105
5.4 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE in vitro E in vivo .................................................. 106
5.4.1 Ensaio de MTT em macrófagos (RAW 264.7) ..................................................... 106
5.4.2 Avaliação da Toxicidade Aguda ........................................................................... 108
6 CONCLUSÕES ................................................................................................................... 110
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................... 112
APÊNCIDE A – MANUSCRITO DA PUBLICAÇÃO ............ Erro! Indicador não definido.
ANEXO A ................................................................................. Erro! Indicador não definido.
17

1 INTRODUÇÃO
A medicina popular no Brasil é derivada de uma mistura de culturas indígenas
brasileiras, europeias e africanas e é caracterizada pelo conhecimento tradicional relacionado
ao uso popular de plantas medicinais que surgem como alternativa a terapias associadas ao
tratamento de doenças, através da percepção do seu poder curativo. No entanto, muitas
espécies são usadas de forma equivocada, sem respaldo científico quanto à eficácia e
segurança, o que demonstra que em um país como o Brasil, com enorme biodiversidade e uma
riqueza de conhecimentos tracionais, existe uma lacuna entre a oferta de plantas e as poucas
pesquisas (CARTAXO, 2010; GIRALDI; HANAZAKI, 2010).
Nos últimos anos, a pesquisa etnobotânica cresceu de forma significativa e vem
despertando cada vez mais o interesse de pesquisadores em estudos com Produtos Naturais de
origem vegetal, que possam ser utilizados tanto como farmacógenos no tratamento e cura de
patologias, como também, na descoberta de novas substâncias bioativas (OTIMENYIN,
2018). Nesse sentindo, o bioma caatinga se destaca devido à rica diversidade da sua flora que
ainda é pouco explorada quanto aos seus potenciais farmacológicos e como fonte de matéria
prima, permitindo assim, estudos que interliguem áreas multidisciplinares, como por exemplo,
farmacologia, fitoquímica e a biotecnologia, que juntas podem ser uma excelente ferramenta
para auxiliar na descoberta de novos fitoterápicos (MACIEL et al., 2002).
O desenvolvimento de novos fitoterápicos constitui uma importante fonte de
inovação em saúde com a inclusão de novas alternativas terapêuticas. A RDC Nº 26, de maio
de 2014 define fitoterápicos como medicamentos obtidos com emprego exclusivo de
matérias-primas ativas vegetais cuja segurança e eficácia sejam baseadas em evidências
clínicas e que sejam caracterizados pela constância de sua qualidade. Com o propósito da
inserção da fitoterapia no Sistema Único de Saúde (SUS), o Ministério da Saúde vem
desenvolvendo ações para implementar novas políticas públicas voltadas à introdução do uso
de plantas medicinais e da fitoterapia no SUS e que ocorra o desenvolvimento do setor, em
toda a cadeia produtiva (BRASIL, 2006).
A padronização de extratos vegetais é uma etapa primordial no desenvolvimento de
novos fitoterápicos e deve ser realizado com base no teor de uma substância marcadora
presente no extrato, indicando que se a mesma estiver presente em quantidade apropriada
também os demais componentes estarão igualmente representados (BRASIL, 2017; DAVID;
NASCIMENTO; DAVID, 2004). Nesse contexto, torna-se imprescindível a determinação das
substâncias marcadoras nos extratos da espécie. A RDC Nº 26/2014 define marcador como
composto ou classe de compostos químicos presentes na matéria-prima vegetal tendo
18

preferencialmente correlação com o efeito terapêutico. Logo, se faz necessário o isolamento e
a identificação dos constituintes ativos e o desenvolvimento de métodos analíticos que
garantam a segurança, qualidade e consequentemente a eficácia, colaborando assim com o
controle de qualidade da matéria-prima vegetal e da produção de fitoterápico (s) (BRASIL,
2014).
A espécie Commiphora leptophloeos (Mart.) J.B. Gillett (Burseraceae) é nativa do
Brasil, pertence ao bioma caatinga, é da família Burseraceae e do gênero Commiphora. A
família Burseraceae é encontrada principalmente na região Norte, Nordeste e Centro-Oeste do
Brasil e é formada por aproximadamente 600 espécies distribuídas entre 20 gêneros, de porte
arbóreo, raramente arbustos, que possuem óleos essenciais aromáticos e resina na casca. As
folhas são alternas, em espiral ou dística, compostas, pinadas, ternadas ou unifolioladas. É
uma família de distribuição pantropical, mas apresenta a maior riqueza de espécies na
América do Sul (DALY, 1987; WATSON; DALLWITZ, 1991). O gênero Commiphora
possui 208 espécies, distribuída por toda América do Sul, embora a maior parte das espécies
seja encontrada no Nordeste do Brasil (CARVALHO, 2009).
A espécie Commiphora leptophloeos é conhecida popularmente como “imburana-de-
espinho” ou “imburana de cambão” e as folhas, flores, frutos e o látex são utilizados no
tratamento de problemas renais, gripe, tosse, bronquite, disfonia, inflamações em geral,
odontalgia, cólica, diarreia, antiemético e como tônico (ALBUQUERQUE et al., 2007),
enquanto que as cascas do caule são utilizadas no tratamento de gripe, tosse, bronquite,
doenças urinárias e hepáticas, gastrite, úlceras vaginais,cicatrização de feridas, infecções e
inflamações em geral (AGRA et al., 2007a; CARVALHO, 2009).
Embora seja uma espécie amplamente utilizada na medicina popular, não há
evidência científica para apoiar o uso tradicional dessa espécie em relação a doenças
inflamatórias e infecciosas e a pesquisa nestas áreas é de grande importância, uma vez que
aumentaria as opções terapêuticas, fortalecendo a cadeia de produção de um possível
fitoterápico que possa ser desenvolvido com essa espécie.
Diante da relevância etnofarmacológica e da escassez de pesquisas com essa espécie
e considerando a importância das plantas medicinais como fonte para descoberta de novos
medicamentos, neste trabalho foi realizado o estudo fitoquímico com objetivo de isolar e
caracterizar os marcadores químicos, bem como avaliar a toxicidade e as atividades
antimicrobiana e anti-inflamatória in vitro e in vivo dos extratos hidroetanólicos das folhas e
das cascas do caule de Commiphora leptophloeos.
19

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 PLANTAS MEDICINAIS NO TRATAMENTO DE DOENÇAS INFLAMATÓRIAS E
INFECCIOSAS
Desde as primeiras civilizações, baseado no conhecimento empírico acumulado pelos
povos primitivos e indígenas, as plantas medicinais, certamente por possuírem uma matriz
complexa de moléculas biotivas, tem sido usadas para combater múltiplas doenças graves,
incluindo infecções microbianas e inflamações crônicas como a diabetes, obesidade,
osteoporose, artrite reumatoide, distúrbios do sistema nervoso central, doenças intestinais e o
câncer (JAN et al, 2017; KUNNUMAKKARA et al., 2018).
As infecções microbianas são caracterizadas pela presença de células vivas estranhas
(micro-organismos) nos órgãos ou partes do corpo. Dependendo dos órgãos, se a invasão
desses micro-organismos não for controlada, resultará na morte da célula hospedeira
(humana) e na perda de função do órgão envolvido. Como resposta a presença desses micro-
organismos, os tecidos recrutam macrófagos com o objetivo de combatê-los. No processo de
recrutamento ocorre a liberação de mediadores inflamatórios. Sendo assim, a inflamação pode
ser considerada como um processo primário no qual o sistema imunológico reage contra um
agente infeccioso (OTIMENYIN, 2018; SENGUPTA; GAURAV; TIWARI, 2018).
A ocorrência de múltiplos micro-organismos resistentes tem aumentado a taxa de
morbidade e mortalidade, consequentemente, elevando os custos de tratamentos.
Considerando também que os medicamentos sintéticos antimicrobianos apresentam uma série
de efeitos adversos e que muitas vezes os efeitos colaterais podem sobrepor os efeitos
terapêuticos, a busca por substâncias bioativas capazes de combater o agente agressor e
consequentemente interferir no processo inflamatório tem sido de grande importância na
pesquisa científica, incentivando cada vez mais pesquisadores na busca por novos fármacos
efetivos com o mínimo de efeitos colaterais (CAMPANIÇO; MOREIRA; LOPES, 2018;
VIEIRA, 2015).
Nesse contexto, as plantas medicinais se destacam por ser uma fonte de substâncias
bioativas com efeito antimicrobiano e/ou anti-inflamatório, atuando principalmente na
eliminação do agente infeccioso e/ou na inibição dos mediadores inflamatórios e
apresentarem menores efeitos adversos e menor custo quando comparadas com os
medicamentos sintéticos (SENGUPTA; GAURAV; TIWARI, 2018).
As plantas medicinais com efeitos antimicrobiano e/ou anti-inflamatório são
frequentemente usadas na medicina tradicional de forma equivocada. A redução da
inflamação em muitos casos não está associada à cura total da doença. Por exemplo, se a
20

causa da inflamação for uma infecção microbiana, será necessário uso de antimicrobianos
associados a anti-inflamatórios. Na medicina tradicional, é comum os pacientes terem a
sensação de cura devido à redução do processo inflamatório e por isso um diagnóstico prévio
é de grande importância. A incapacidade de algumas plantas de não terem um efeito anti-
inflamatório associado a um efeito antimicrobiano gera riscos para os pacientes, uma vez que
as infecções podem progredir tornando-se crônica e com manifestações sistêmicas, isto é,
comprometendo vários órgãos e levando o paciente em alguns casos até a morte
(OTIMENYIN, 2018).
Diante disso, o objeto de estudo deste trabalho é a espécie Commiphora
leptophloeos, cujas folhas e as cascas do caule são amplamente utilizadas na medicina popular
no tratamento de problemas inflamatórios e infecciosos. No entanto, não há evidência
científica que forneçam embasamento científico ao uso tradicional dessa espécie em relação a
doenças inflamatórias e infecciosas (ALBUQUERQUE et al., 2007; MACEDO et al., 2018).
Como base nessas informações, surgiram as hipóteses deste trabalho: a ação da planta pode
ser por mecanismos anti-inflamatórios e/ou antimicrobianos, ou, é possível que a espécie
tenha um efeito anti-inflamatório e não tenha efeito antimicrobiano, diminuindo assim a
inflamação, mas não sendo capaz de combater o agente agressor, no caso de uma infecção.
Portanto, estudos farmacológicos que comprovem a eficácia pré-clínica e que compare as
partes da planta utilizadas na medicina tradicional são de grande relevância clínica.

2.2 Commiphora leptophloeos (MART.) J.B. GILLETT (BURSERACEAE)
2.2.1 Dados botânicos
A espécie Commiphora leptophloeos, nativa do Brasil, pertencente ao bioma
caatinga, é conhecida popularmente como “imburana-de-espinho” ou “imburana de cambão”.
Seu nome popular é derivado das palavras em tupi y-mb-ú (árvore de água) e ra-na (falso),
que significa “falso imbu” (CARVALHO, 2009).
A espécie pertence ao grupo Angiospermae, classe Eurosídeas II, ordem Sapindales,
família Burseraceae e gênero Commiphora. Possui como sinonímias Bursera martiana Engl.,
Bursera orinocensis Engl. e Bursera leptophloeos Mart.. Tem ocorrência principalmente na
região Nordeste do Brasil (Rio Grande do Norte, Paraíba, Ceará, Pernambuco, Bahia,
Alagoas, Sergipe e Maranhão) como também em alguns outros estados como Goiás, Minas
Gerais, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul e na Bolívia. C. leptophloeos é uma árvore
espinhosa de grande porte, podendo atingir até 12 metros de altura na idade adulta. Possui o
tronco tortuoso com espinhos agudos e fortes, suas cascas são moderadamente espessas,
amareladas quando jovens e vermelhas quando adultas. As folhas são alternas, de coloração
verde clara-rosadas quando bem jovens, compostas, imparipinadas, com três a nove folíolos
ovais, medindo de 1,5 cm a 3,5 cm de comprimento. As flores são pequenas, de coloração
verde clara, medindo de 3 mm a 4 mm de comprimento. O fruto é um drupóide do tipo
filotrimídio, de cor verde, medindo cerca de 1,5 cm de diâmetro e a semente é rígida, rugosa,
de cor escura e com diâmetro maior que 1 cm (CARVALHO, 2009).
Figura 1 – Commiphora leptophloeos.

Fonte: Árvores do bioma cerrado, 2018.
https://pt.wikipedia.org/wiki/L%C3%ADngua_tupi
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22

2.3 ESTUDOS ETNOFARMACOLÓGICOS, FARMACOLÓGICOS E QUÍMICOS
Os estudos etnofarmacológicos destacam a relevância da espécie Commiphora
leptophloeos na medicina tradicional e chama atenção para a realização de estudos químicos e
farmacológicos que possam justificar o seu uso, uma vez que os estudos descritos na literatura
são escassos (AGRA et al., 2007a; ALBUQUERQUE et al., 2007; MACEDO et al, 2018).
Dessa forma, foi realizado um levantamento bibliográfico acerca dos estudos
etnofarmacológicos, químicos e farmacológicos da espécie.

2.3.1 Estudos etnofarmacológicos de Commiphora leptophloeos
Na medicina popular as partes da planta mais utilizadas são as cascas do caule e as
folhas. Entretanto, tambémé descrito o uso das raízes, flores, frutos, sementes e do látex. As
formas de preparo variam entre a maceração, decocção, infusão e xaropes e a forma de
administração é por via oral e/ou tópica (AGRA et al., 2007a; AGRA et al., 2007b;
ALBUQUERQUE et al., 2007; CARTAXO et al., 2010; MACEDO et al, 2018). As cascas do
caule, folhas e frutos são usadas para o tratamento de tosse, bronquite, inflamação, infecção,
cicatrização, edemas, mordida de cobra, lesões em diabéticos, sinusite, dor de barriga, ferida,
rins, rouquidão, gastrite, úlcera, dor de dente, asma, coriza, dor de garganta, dor generalizada
e como tônico (AGRA et al., 2007a; AGRA et al., 2007b; ALBUQUERQUE et al., 2007;
CARTAXO et al., 2010; RIBEIRO et al, 2017; MACEDO et al, 2018). As flores e o látex são
usados para o tratamento de problemas renais, gripe, tosse, bronquite, disfonia, inflamações
em geral, odontalgia, cólica, diarreia e como antiemético e tônico (ALBUQUERQUE et al.,
2007; OLIVEIRA et al., 2007) e as sementes para tratar a insônia (RODRIGUES et al, 2008).
O Quadro 1 resume o uso popular dessa espécie.

Quadro 1 – Estudos etnobotânicos de Commiphora leptophloeos.
Parte da
planta
Uso popular Preparação e via de
administração
Referências

Cascas do
caule
Utilizado no tratamento de gripe,
tosse, bronquite, tratamento de
doenças urinárias e hepáticas.
Além disso, uso externo contra
úlceras vaginais
Decocção de um punhado
em um 1 L de água e feito
com açúcar como xarope.
Beber uma colher de 5 a 6
vezes por dia
Agra et al.,
2007a.

Cascas do
caule
Tratamento de gripe, tosse e
bronquite
Decocção de um punhado
em um 1 L de água e feito
com açúcar como xarope.
Beber uma colher de 5 a 6
vezes por dia
Agra et al.,
2007b.
Folha, flor,
fruto, látex
e cascas
Problemas renais, gripe, tosse,
bronquite, disfonia, inflamações
em geral, odontalgia, cólica,
diarréia, antiemético, tônico e
cura

ND
Albuquerque
et al., 2007.
Cascas Tratamento de ferimentos Maceração. Banho Roque et al,
2010.
Sementes Tratamento de insônia Decocção e ingerir Rodrigues et
al, 2008.
Casca do
caule

Doenças do estômago, enjôo e
tosse, como tônico e cicatrizante
no tratamento de feridas, gastrite e
úlcera. Também é indicado contra
tosses, bronquites e inflamações
do trato urinário
Infusão, decocção, xarope e
garrafada
Carvalho,
2009.
Casca do
caule
Tratamento de influenza, dor de
estômago e cura
Decocção e maceração
(Beba ou lave o local
afetado)
Cartaxo et
al., 2010.

ND
Tratamento de inflamação de
garganta, dente e útero

ND
Ferreira-
Júnior;
Ládio;
Albuquerque,
2011.
Folhas Tratamento de tosse Infusão Ribeiro et al,
2017.

Casca do
caule, casca
interna do
caule, folha
e fruto
Tratamento de tosse, bronquite,
inflamação, infecção, cicatrização,
edemas, mordida de cobra, lesões
em diabéticos, sinusite, dor de
barriga, ferida, rins, rouquidão,
gastrite, úlcera, dor de dente,
asma, coriza, dor de garganta, dor
generalizada e tônico

Xarope, decocção,
maceração, infusão e banho

Macedo et al,
2018.
Legenda: ND: Não descrito. Fonte: Autoria própria
24

2.3.2 Constituintes químicos de Commiphora leptophloeos
Os estudos acerca dos constituintes químicos da espécie ainda são escassos na
literatura e a maior parte deles estão relacionados com a triagem fitoquímica qualitativa e são
limitados apenas para as cascas do caule e das folhas. Para as cascas, a partir de uma triagem
fitoquímica foi detectada a presença de compostos fenólicos, taninos, antocianina,
flavonoides, saponinas, alcaloides e albuminas (ARAÚJO et al., 2008; CLEMENTINO et al.,
2016; LIMA et al, 2017; VIEIRA et al., 2015). Também, a partir de uma análise por MALDI-
TOF-MS/MS do extrato aquoso das cascas do caule foram identificados taninos condensados
formado principalmente por séries poliméricas de prorobinetinidina do tipo B e profisetinidina
do tipo A (TRENTIN et al., 2013). Posteriormente, um único estudo de isolamento foi
encontrado, no qual foi isolado uma hinoquinina a partir do extrato clorofórmico das cascas
do caule e foi identificados por CLAE-DAD a presença de ácido gálico, ácido clorogênico e
ácido protocatequico (PEREIRA et al., 2017).
Para as folhas, foi realizado um doseamento de flavonoides e taninos totais do
extrato aquoso. Também, a partir do óleo essencial foi identificado por CG-MS a presença de
terpenos caracterizados como α-phellandrene, (E)-caryophyllene, β-phellandrene, α-himulene
e germacrene-D (LIMA et al, 2017; SILVA et al., 2015). Vale salientar que nenhum estudo de
isolamento e caracterização das folhas para a espécie é descrito na literatura. O Quadro 2
resume os constituintes químicos relatado para espécie.

Quadro 2 – Composição química de Commiphora leptophloeos.
Legenda: ND: Não descrito. Fonte: Autoria própria.

Parte
da
Planta

Classificação

Composto

Análise e tipo de
extrato

Referências

Cascas
Flavonoides e
taninos

ND
Doseamento de
flavonoides e
taninos totais

Araújo et al.,
2008.

Cascas
Polifenóis,
cumarinas,
esteroides e terpenos

Análise por
CLAE-DAD do
extrato aquoso

Trentin et al.,
2011.

Cascas

Taninos

proantocianidinas
Análise por
MALDI-TOF-
MS/MS do extrato
aquoso

Trentin et al.,
2013.

Cascas
Compostos
fenólicos, taninos,
antocianinas,
flavonoides,
saponinas, alcaloides
e albuminas

Triagem
fitoquímica
qualitativa do
extrato etanólico

Vieira et al.,
2015.

Folhas
Terpenos α-phellandrene, (E)-
caryophyllene, β-
phellandrene, α-
himulene e
germacrene-D
Análise por
CG/MS da
extração do óleo
por
hidrodestilação
Silva et al.,
2015.

Cascas Compostos
fenólicos, taninos,
antocianina,
flavonoides,
saponinas, alcaloides
e albuminas

ND
Triagem
fitoquímica
qualitativa
Clementino
et al., 2016.
Cascas Ácidos orgânicos e
lignana
Ácido gálico, ácido
clorogênico, ácido
protocatequico e
hinoquinina
Análise por HPLC-
DAD e RMN do
Extrato
clorofórmico
Pereira et al.,
2017.
Folhas Flavonoides e
taninos
ND Doseamento de
flavonoides e
taninos totais
Lima et al,
2017.
26

2.3.3 Atividades farmacológicas de Commiphora leptophloeos
Os trabalhos que avaliaram as atividades farmacológicas da espécie ainda são
escassos na literatura, e na sua maior parte, estão relacionados à atividade antimicrobiana.
Todos os estudos são ensaios não clínicos in vitro. Vale destacar que não há trabalhos na
literatura que avaliaram as atividades farmacológicas in vivo ou em ensaios clínicos com a
espécie. Quanto aos estudos encontrados, foi avaliada a atividade antimicrobiana do extrato
aquoso das cascas do caule contra S. epidermidis e P. aeruginosa que mostraram atividade
bactericida (4,0 mg/mL) e bacteriostática (1,0 mg/mL) e redução de 15,3% e 32,7% na
formação de biofilme, respectivamente (TRENTIN et al., 2011; TRENTIN et al., 2013). O
extrato etanólico das cascas do caule também apresentou atividade bactericida contra S.
aureus na concentração de 125 μg/mL. Posteriormente, avaliaram os extratos metanólico,
clorofórmico, ciclohexanico e acetato de etila das cascas do caule que mostrou efeito
bacteriostático contra S. aureus, S. faecalis, B. subtilis, E. faecalis, M. luteus P. aeruginosa,
E. coli, K. pneumoniae, M. smegmatis e M. tuberculosi e fungistático contra Aspergillus sp. e
C. albicans nas concentrações variando de 0,098 a 50 mg/mL. Ainda foi avaliado um
composto isolado, uma hinoquinina, obtido do extrato clorofórmico das cascas do caule, que
apresentou efeito bactericida e bacteriostático contra cepas clínicas deS. aureus nas
concentrações variando de 0,0485 a 3,125 mg/mL (PEREIRA et al., 2017). Vale salientar, que
não há estudos na literatura que avaliaram a atividade antimicrobiana dos extratos
hidroetanólicos das folhas e das cascas do caule, bem como suas frações e compostos isolados
contra cepas clínicas de uma variedade considerável de diferentes espécies de fungos e
bactérias.
A citotoxicidade dos extratos aquoso, metanólico, clorofórmico, hexanico e acetato
de etila das cascas do caule foi avaliada pela atividade hemolítica e os resultados mostraram
que os extratos não causaram hemólise (PEREIRA et al., 2017). Também, outro estudo
avaliou a toxicidade aguda sobre náuplios de Artemia salina do extrato etanólico das cascas
do caule que se mostrou moderadamente tóxico (CLEMENTINO et al., 2016).
Para as folhas, apenas um trabalho foi encontrado na literatura em que avaliou o
efeito de dissuasão para oviposição contra Aedes aegypti do óleo essencial e os resultados
mostraram uma boa atividade larvicida (LC50 = 99,4 ppm) (SILVA et al., 2015). O quadro 3
resume as atividades farmacológicas avaliadas para a espécie.
27

Quadro 3 – Atividades farmacológicas de Commiphora leptophloeos.
Parte da
planta
Extrato Modelo Resultados Referências
Atividade antimicrobiana
Cascas do
caule
Aquoso
Concentração Inibitória
Mínima (CIM) e formação
de biofilme
O extrato aquoso inibiu 100% o crescimento de
S. epidermidis e uma menor taxa de formação
de biofilme (15,3%) concentração 4,0 mg/mL,
Na dose 0,4 mg / mL, houve uma redução na
formação de biofilme (32,7%) e não houve
morte bacteriana.
Tretin et al., 2011.

Cascas do
caule

Aquoso
Concentração Inibitória
Mínima (CIM) e formação
de biofilme
O extrato aquoso apresentou uma atividade
bacteriostático para Pseudomonas aeruginosa
na concentração de 1,0 mg/mL e uma menor
taxa de formação de biofilme.
Tretin et al., 2013.

Cascas do
caule

Etanólico

Concentração Inibitória
Mínima (CIM)
O extrato etanólico da casca apresentou
atividade bactericida contra Staphylococcus
aureus na concentração de 125 μg/mL.

Clementino et al., 2016.

Cascas do
caule
Clorofórmico
Concentração Inibitória
Mínima (CIM) e
Concentração Microbicida
Mínima (CMM)
Os resultados mostraram que C. leptophloeos
apresenta potencial propriedade inibitória contra
espécies de resistência a múltiplos fármacos de
S. aureus, bem como vários Gram-positivos,
Gram-negativos e fungos (Aspergillus sp. e C.
albicans.
Pereira et al., 2017.

(Continuação)
Atividade Larvicida
Folhas Hidrodestilação
Utilização da larva do
mosquito Aedes aegypti
Os bioensaios mostraram que o óleo essencial
exibiu fortes efeitos de dissuasão de oviposição
contra A. aegypti em concentrações entre 25 e
100 ppm e possuía boa atividade larvicida
(LC50 = 99,4 ppm).
Silva et al., 2015.
Citotoxicidade e toxicidade
Cascas
Extrato
etanólico
Toxicidade aguda sobre
náuplios de Artemia salina
O extrato testado se mostrou moderadamente
tóxico.
Clementino et al., 2016.
Folhas
hexânico e
metanólico
Linhagem de células
tumorais Hep-2 e NCI-
H292
Os EH e Met frente a linhagem Hep-2 na
concentração de 50 µg inibiram 11,53% e
46,45% e na mesma concentração para a
linhagem NCI-H292 inibiram 26,1% e 13,23%,
respectivamente.
Melo et al., 2017.
Fonte: Autoria própria.

3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Isolar e caracterizar os compostos do extrato hidroetanólico das folhas e do extrato
hidroetanólico das cascas do caule de Commiphora leptophloeos e avaliar a toxicidade, a
atividade anti-inflamatória e antimicrobiana.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Isolar e elucidar a estrutura dos compostos majoritários dos extratos hidroetanólicos
das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos;
 Desenvolver e validar metodologia para quantificar os marcadores dos extratos
hidroetanólicos das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos por CLAE;
 Caracterizar o perfil fitoquímico dos extratos hidroeatanólicos das folhas e do caule
por espectrometria de massas;
 Avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos hidroetanólicos das folhas e das cascas
do caule de C. leptophloeos in vitro frente a cepas clínicas e de referência de fungos e
bactérias Gram-positivas e Gram-negativas;
 Avaliar o efeito anti-inflamatório dos extratos hidroetanólicos das folhas e das cascas
do caule de C. leptophloeos in vitro pelo ensaio de óxido nítrico induzido por LPS e in
vivo nos modelos de edema de pata induzido por carragenina e de bolsa de ar induzida
por zimosam;
 Avaliar a segurança dos extratos hidroetanólico das folhas e das cascas do caule de C.
leptophloeos por ensaios não clínicos in vitro e in vivo;
 Realizar uma triagem virtual in sílico dos compostos marjoritários dos extratos
hidroetanólicos das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos.

4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 MATERIAL VEGETAL
O material vegetal é constituído das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos.
O material vegetal foi coletado em abril de 2016 na comunidade do Carão, Município de
Altinho, no Pernambuco, Brasil, as seguintes coordenadas geográficas latitude: 8º 29’ 32” S e
longitude: 36º 03’ 03” W. A autorização da coleta foi obtida pelo Sistema de Autorização e
Informação em Biodiversidade (SISBIO), sob o número de processo 35017 e a Autorização
de acesso ao Patrimônio Genético foi obtida pelo Conselho de Gestão do Patrimônio Genético
do Ministério do Meio Ambiente (CGEN/MMA), sob o número de cadastro no SISGEN
A618873. Uma exsicata incluindo folhas e cascas do caule de C. leptophloeos foi depositada
no Herbário Geraldo Mariz (UFP) da Universidade Federal do Pernambuco (UFPE), com o
número de registro UFP: 46.191.

4.2 PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS DAS FOLHAS E DAS CASCAS DO CAULE DE C.
leptophloeos
As folhas foram secas em estufa de ar circulante (temperatura inferior a 45 ºC), e em
seguida foram trituradas em moinho de facas. O material obtido após trituração foi submetido
à produção do extrato, pelo método de maceração (48 h), utilizando como solvente etanol:
água (70: 30, v/v) na proporção de 1: 10 de solvente (g/v). Na sequência, o material vegetal
foi submetido a três remacerações seguidas de 48 horas, cada. Em seguida, o extrato foi
filtrado através de filtro de papel obtendo-se então os extratos hidroetanólicos (EH) 70% das
folhas. A fase orgânica foi evaporada sob pressão reduzida com o auxílio de um evaporador
rotatório (Büchi
®
) com temperatura ≤40ºC e por fim liofilizado e armazenado a -20°C.
Com o intuito de reproduzir o uso popular da espécie e selecionar o melhor método
de extração, também foram preparados extratos aquosos pelo método de decocção utilizando
como solvente água. O processo de decocção foi realizado durante 15 minutos após início da
ebulição. Em seguida, os extratos foram arrefecidos, filtrados a vácuo e liofilizados. No
processo de liofilização, as amostras foram previamente congeladas em freezer a - 80
o
C.

4.3 ANÁLISE FITOQUÍMICA QUALITATIVA DOS EH DAS FOLHAS E DAS CASCAS
DO CAULE DE C. leptophloeos
Inicialmente, foi realizada uma investigação do perfil químico com o objetivo de
detectar as principais classes de metabólitos secundários presentes nos extratos aquosos
obtido por decocção e nos extratos hidroetanólicos obtido por maceração das folhas e das
cascas do caule de C. leptophloeos.

4.3.1. Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
A análise do perfil químico dos extratos foi realizada por Cromatografia em Camada
Delgada (CCD) utilizando como adsorvente cromatoplacas de gel de sílica 60 em alumínio
F254 (Merck
®
) e como fase móvel a mistura de AcOET: AcOH: H2O (1,1:0,8:0,3 v/v/v) e
como reveladores, Reagente natural A 0,5% (difenilboriloxietilamina)com posterior
visualização em luz ultravioleta a 254 e 365 nm e vanilina sulfúrica (vanilina 2% e ácido
sulfúrico 10 % em etanol).

4.3.2 Análise para a detecção de compostos fenólicos
A análise para detectar a presença de compostos fenólicos nos extratos foi realizada
através da reação com cloreto férrico. Inicialmente, adicionou-se separadamente 2 mL dos
extratos em tubos de ensaios e em seguida foi adicionado 2 gotas de solução etanólica de
cloreto férrico a 2,5%. Posteriormente, foi observado se houve mudança ou não de coloração
para verde-escuro, violeta ou azul (SIMÕES, 2016).

4.3.3 Análise para a detecção de taninos
A análise para detectar a presença de taninos nos extratos foi realizada através da
reação de precipitação em gelatina. Inicialmente, adicionou-se separadamente 2 mL dos
extratos em tubos de ensaios e em seguida foi gotejada uma solução aquosa de gelatina a
2,5% até a visualização da formação de precipitado (SIMÕES, 2016).

4.3.4 Análise para a detecção de flavonoides
A análise para a detecção da presença de flavonoides foi realizada através da reação
de cianidina ou shinoda. Para o ensaio, 2 mL dos extratos foram colocados separadamente em
almofariz de porcelana e submetidos ao aquecimento em banhomaria a 50 °C até a
evaporação completa dos solventes. Em seguida, adicionou-se 0,2 mL de clorofórmio sobre os
extratos secos e posteriormente o clorofórmio retirado. Por fim, as amostras foram
suspendidas com 1 mL de etanol 70% e transferidas para tubos de ensaios, onde foi
adicionado vagarosamente pelas paredes dos tubos 1 mL de ácido clorídrico (HCl) 37% e 200
mg de magnésio em pó (SIMÕES, 2016).

4.3.5 Análise para a detecção de saponinas
A análise para detectar a presença de saponinas nos extratos foi realizada pelo teste
de formação de espuma. Para o teste, 2 mL dos extratos foram adicionados em tubos de
ensaios e suspendidos em 5 mL de água destilada. Em seguida, os tubos de ensaios foram
agitados bruscamente por 1 minuto e observado se havia formação de espuma persistente
(SIMÕES, 2016). Aos tubos de ensaios que foi verificado a formação de espuma, foi
adicionado 5 gotas de HCl e observado se a espuma formada era persistente. A presença de
espuma persistente após a adição de HCl confirmaria a presença de saponinas nos extratos.

4.3.6 Análise para a detecção de alcaloides
A análise para detectar a presença de alcaloides nos extratos foi realizada através da
reação de precipitação em reagente de Dragendorff, Mayer, Wagner e Bertrand. Inicialmente,
em um béque foram adicionados 2 mL dos extratos e 20 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) 10%.
Em seguida, as amostras foram aquecidas até a ebulição por 5 minutos e posteriormente foram
arrefecidas e filtradas. Em uma placa de vidro, foram adicionadas 5 gotas das amostras em
contato com os reagentes Dragendorff, Mayer, Wagner e Bertrand. A formação de um
precipitado laranja, branco ou amarelo confirmaria a presença de alcaloides nos extratos
(SIMÕES, 2016).

4.4 PARTIÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO DO EXTRATO DAS FOLHAS E DAS CASCAS DO
CAULE DE C. leptophloeos
Após a redução total da fase orgânica dos extratos com o auxílio de um evaporador
rotatório a temperatura não superior a 40 ºC, a fase aquosa dos extratos foi submetida a uma
partição líquido-líquido em funil de separação. Foram utilizados solventes de polaridade
crescente, para obtenção das frações diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila (AcOEt), n-
butanol (n-BuOH) e residual aquosa. O processo foi repetido 3 vezes utilizando uma alíquota
de 150 mL por vez para cada solvente. Todas as frações obtidas e a fração residual aquosa
foram analisadas preliminarmente por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e também
foram utilizadas para avaliação da atividade antimicrobiana in vitro.

4.5 FRACIONAMENTO E ISOLAMENTO
O isolamento e a elucidação estrutural foram realizados em parceria com o
Laboratoire de Pharmacognosie da Université Paris Descartes em supervisão do Prof. Dr.
Räphael Grougnet, durante a realização de um estágio no exterior (Stage de master 2).
O processo de fracionamento e isolamento foi realizado em uma única etapa através
da Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC).

4.5.1 Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC)
O EH das folhas (10 g) e a fração BuOH (6,0 g) das cascas do caule de C.
leptophloeos foram submetidos a fracionamento por CPC (Armen-Gilson
®
Instrument)
equipado com um rotor de capacidade de 1000 mL, contendo 2016 células gêmeas e a
velocidade de rotação foi ajustada para 1600 rpm. O aparelho CPC foi operado no modo
descendente e as frações foram coletadas por um coletor de frações (Büchi
®
). Os
experimentos foram realizados em temperatura ambiente. Os sistemas de solventes de duas
fases foram selecionados de acordo com uma avaliação do coeficiente de partição (K),
definido pela razão das concentrações dos compostos de interesse entre as duas fases não
miscíveis. As misturas de solventes foram preparadas e em seguida adicionadas em tubos de
ensaios. Os tubos foram agitados e mantidos em repouso até que as duas fases fossem
separadas. Posteriormente, em cada tudo de ensaio foi adicionado 3 mg do EH das folhas e da
fração BuOH das cascas do caule e os tubos foram agitados novamente e deixados em
repouso até a separação das duas fases. Passado isso, as fases superiores foram transferidas
para outros tubos de ensaios e finalmente as fases foram analisadas por CCD. Os sistemas de
solventes Hex: AcOEt: MeOH: H2O (1:3:1:3, v/v/v/v) e Hex: AcOEt: MeOH: C3H6O: H2O
34

(0,1:1,8:0,6:1,1:0,5, v/v/v/v) foram selecionados para o EH das folhas e fração BuOH das
cascas do caule, respectivamente. A partir do EH das folhas foi possível isolar diretamente os
compostos 1 e 2 e a partir do EH das cascas do caule, após o processo de fracionamento por
partição líquido-líquido, foi possível isolar os compostos 3 e 4. O esquema de fracionamento
e isolamento para o EH das cascas do caule é apresentado na Figura 2.

Figura 2 – Esquema representativo do fracionamento e isolamento guiado pelo efeito
antimicrobiano do EH das cascas do caule.

Fonte: Resultados Experimentais.

4.6 IDENTIFICAÇÃO E ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DAS SUBSTÂNCIAS
ISOLADAS
A identificação e a elucidação das substâncias isoladas foram obtidas por análises
espectroscópicas e espectrométricas.
As análises espectroscópicas e espectrométricas foram realizadas em colaboração
com o Prof. Dr. Wagner Vilegas do Laboratório de Bioprospecção de Produtos Naturais
(LBPN) da UNESP, com auxílio da doutoranda Ana Zanatta.

4.6.1 Análise por Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Os compostos isolados foram analisados por RMN de
1
H 1D e 2D em um
equipamento espectrômetro Bruker
®
(400 MHz). As amostras soram solubilizadas em MeOD
(Euriso-top
®
). Foram obtidos os espectros de RMN de
1
H e número de scans foi variável de 8
35

à 32 a depender da concentração da amostra. Os espectros obtidos foram analisados e
comparados com os dados da literatura.

4.6.2 Análise por Espectroscopia de Massas (EM)
Os EH das folhas e das cascas do caule e as substâncias isoladas foram analisados
FIA-ESI-IT-MS/MS. Para análise, foi utilizado um Espectrômetro de massas LCQ FLEET
(ESI-IT-MS
n
, Thermo Scientific
®
), equipado com um dispositivo de injeção direta da amostra
via análise por injeção em fluxo contínuo (FIA). Ionização por electrospray (ESI) e analisador
do tipo íon-trap (IT). Inicialmente, foi realizada uma varredura completa (full-scan) do
espectro de massas para adquirir os dados dos íons na faixa m/z estabelecida. Posteriormente
foram realizados experimentos de MS/MS a partir dos dados da primeira varredura para íons
precursores pré-selecionados, com energia de colisão de 30 V.
Para obtenção do perfil dos extratos por LC-MS/MS foi utilizado um espectrômetro
de massas LC-QTOF HR-ESI(Waters Synapt G2, Manchester, UK). Os espectros de massas
foram obtidos no modo positivo e negativo, sendo o modo negativo selecionado. A faixa de
trabalho dos íons variaram de m/z de 100−2000 Da. O software Xcalibur
TM
versão 1.3
(Thermo Scientific
®
) foi utilizado para tratamento dos dados.
Para a preparação das amostras, os extratos foram submetidos a um pré-tratamento
em extração de fase sólida por clean up em cartucho SPE C18. Para análise do EH das folhas
de C. leptophloeos, 10 mg do extrato foram dissolvidos em 1,5 mL de MeOH/H2O (85:15,
v/v). O cartucho SPE C18 (Chromabond
®
C18 ec, 500 mg, 3 mL cartucho) foi previamente
condicionado com 4,5 mL de MeOH e 4,5 mL de MeOH / água (85:15, v/v). Em seguida, 1
mL da amostra do extrato foi adicionada ao cartucho e eluída com 1,5 mL MeOH/ H2O
(85:15, v/v) seguido de MeOH para a limpeza do cartucho.
Para o EH das cascas do caule de C. leptophloeos, 10 mg do extrato foi dissolvido
em MeOH/ H2O (50:50, v/v). O cartucho SPE C18 (Chromabond
®
C18 ec, 500 mg, 3 mL
cartucho) foi previamente condicionado com 4,5 mL de MeOH e 4,5 mL de MeOH / H2O
(20:80, v/v). Em seguida, 1 mL da amostra do extrato foi adicionada ao cartucho e eluida com
1,5 mL de MeOH/ H2O (20:80, v/v) e 1,5 mL de MeOH/ H2O (50:50, v/v) seguido de MeOH
para limpeza do cartucho.

4.7 VALIDAÇÃO PARCIAL DO MÉTODO ANALÍTICO POR CROMATOGRAFIA
LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA ACOPLADA AO DETECTOR DE ARRANJO DE
DIODOS (CLAE-DAD) E AO DETECTOR EVAPORATIVO DE ESPALHAMENTO DE
LUZ (CLAE-ELSD)

As análises obedeceram ao disposto nas resoluções nacionais e internacionais
vigentes, abrangendo os parâmetros descritos pela RE Nº 166/2017 e o guia internacional ICH
(BRASIL, 2017; ICH, 1996). Pretendeu-se avaliar os parâmetros de seletividade, linearidade,
precisão, exatidão, limite de quantificação (LOQ) e detecção (LOD) e robustez (BRASIL,
2017).
A repetibilidade do método foi avaliada utilizando 3 concentrações do padrão
isovitexina, a saber: uma concentração baixa (31,25 µg/mL), uma média (125 µg/mL) e uma
alta (500 µg/mL). Cada uma das concentrações (em triplicata) foi analisada três vezes,
somando no total 9 análises cromatográficas. A avaliação da precisão intermediária foi
realizada no mesmo laboratório em 2 dias diferentes.
O EH das folhas foi analisado em um equipamento CLAE JASCO
®
constituído de
bomba quaternária, detector de arranjos de diodos (DAD) e injetor automático. Foi utilizada
uma coluna de fase reversa C18 modelo Thermo Scientific
®
(250 x 4,6 mm d.i.; 5 μm).
Inicialmente, foi desenvolvido o método para o EH das folhas e a partir desse método foi
realizado o teste de linearidade para o padrão isovitexina.
Foi preparada uma solução estoque do padrão isovitexina com concentração de 1
mg/mL, a partir da qual foi realizada diluição seriada para obtenção de seis soluções nas
concentrações de 7,81; 15,62; 31,25; 62,5; 125; 250 e 500 µg/mL. O volume de injeção foi de
10 µL. Para otimização do método, o gradiente de eluição foi constituído de água (solvente A)
e metanol (solvente B), ambos acidificados com 0,1% de ácido fórmico. O programa de
corrida foi de 30-75% de MeOH em 50 minutos. O fluxo foi mantido constante em 1,0
mL/min e a detecção realizada a 254 e 340 nm com a aquisição de espectros UV na faixa de
190 a 450 nm. As análises foram realizadas em triplicatas.
Para a análise do EH das cascas do caule foi utilizado o mesmo equipamento de
CLAE e a mesma coluna como descrito anteriormente. Para a detecção foi utilizado o detector
evaporativo de espalhamento de luz (ELSD) da JASCO
®
modelo ELS-2040/2041.
Inicialmente, foi desenvolvido o método para o EH das cascas do caule e a partir desse
método foi realizado o teste de linearidade para o padrão procianidina dimérica do tipo B.
37

Foi preparada uma solução estoque do padrão procianidina dimérica do tipo B com
concentração de 3 mg/mL, a partir da qual foi realizada diluição seriada para obtenção de
cinco soluções nas concentrações de 250; 500; 1000; 1250 e 1500 µg/mL.
O gradiente de fase móvel utilizado foi: água acidificada em ácido fórmico 0,1%
(solvente A) acetonitrila (solvente B), com 10-20%, de 0-7 min; 20%, de 7-25 min; 20-60 %,
de 25-45 min. O volume de injeção foi de 10 µL e o ELSD foi operado com temperatura do
drift tube em 40 °C e pressão do gás nebulizador de 3,5 bar. O fluxo foi mantido constante em
1,0 mL/min. As análises foram realizadas em triplicatas.
O software EZChrom Elite 3.1.7 foi utilizado para controle, coleta e processamento
dos dados para todas as análises.

4.8 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA
O protocolo experimental foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEUA/UFRN) pelo parecer de nº
019.026/2017 e está em conformidade com as diretrizes do Conselho Nacional de Controle de
Experimentação Animal (CONCEA).

4.8.1 Animais de experimentação
Foram utilizados para o estudo camundongos albinos Swiss machos e fêmeas, com
período de vida de 6 a 8 semanas, pesando em torno de 30 a 35 g, mantidos sob temperatura
controlada (22 ± 2 ° C), ciclo claro/escuro de 12/12 horas e com acesso livre a água e comida.
Cada grupo foi composto por cinco animais (n = 5). Os animais foram procedentes do
Biotério do Centro de Ciências da Saúde (CCS) da UFRN.
Os experimentos foram realizados em parceria com o Prof. Dr. Matheus Freitas
Fernandes Pedrosa, do Departamento de Farmácia da UFRN e com o auxílio das doutorandas
Manuela Torres Rêgo e Allanny Furtado.

4.8.2 Modelo de edema de pata induzido por carragenina
O efeito anti-inflamatório do pós-tratamento por via oral (v.o) dos EH das folhas e
das cascas do caule de C. leptophloeos na inflamação aguda foi avaliado conforme o
procedimento descrito por Posadas e colaboradores (2004), com algumas modificações.
Inicialmente, o edema de pata nos animais foi induzido através de injeção subplantar (s.pl.) de
50 µL de λ-carragenina 1% (500 µg/pata). Após 30 minutos os animais foram tratados por v.o
38

com 100 µL de solução salina estéril (0,9 mg/mL), dexametasona (0,5 mg/kg) e EH nas doses
100, 200 e 400 mg/kg. O edema foi quantificado por meio da mensuração da espessura
individual das patas, através de um paquímetro digital, nos tempos 1, 2, 3 e 4 horas após a
injeção do inflamógeno. A resposta edematogênica foi determinada através da diferença entre
a espessura da pata depois (nos respectivos tempos) e antes (valores basais) da injeção de
carragenina. Ao final dos experimentos, os animais foram eutanasiados com overdose de
xilazina e cetamina (10 mg/kg, 100 mg/kg), realizado o descolamento cervical e suas patas
foram coletadas para a extração e posterior quantificação da enzima mieloperoxidase (MPO)
(marcador quantitativo indireto de migração leucocitária). O edema de pata foi expresso em
milímetros (mm) e foi calculado como a porcentagem de edema. A área sob a curva de tempo-
curso (AUC0-4 h) também foi determinada usando a regra trapezoidal.

4.8.3 Modelo de bolsa de ar induzido por zimosam
O efeito anti-inflamatório dos EH das folhas e das cascas do caule de C. leptophloeos
na inflamação aguda também foi avaliado usando o modelo de bolsa de ar induzida por
zimosam segundo o procedimento de Yoon e colaboradores (2005), com algumas
modificações. Inicialmente, foi coletado ar estéril no fluxo laminar em condições assépticas.
Em seguida, os animais receberam 5 mL de ar estéril no dorso por via subcutânea, para a
formação da bolsa de ar. Após 2 dias, a bolsa já formada, foi reforçada com a injeção de mais
2,5 mL ar estéril no mesmo local. Seis dias após a formação da bolsa de ar inicial, a
inflamação foi induzida pela injeção de solução de zimosam dentro da bolsa de ar e logo em
seguida receberam pós tratamento por v.o de solução salina estéril (0,9 mg/mL),
dexametasona (2,0 mg/kg)