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REVEJA ACESSO LIVRE ISSN 1678-9199 www.jvat.org Manutenção de serpentes peçonhentas em cativeiro para produção de venenos no Instituto Butantan de 1908 até o presente: um histórico de escopo Kathleen Fernandes Grego1*-, Samira Emanuela Maria Vieira1, Jarbas Prado Vidueiros1, Eliana de Oliveira Serapicos1, Cibele Cíntia Barbarini1, Giovanni Perez Machado da Silveira1, Fabíola de Souza Rodrigues1, Lucas de Carvalho Francisco Alves1, Daniel Rodrigues Stuginski1, Luciana Carla Rameh-de-Albuquerque1 -, Maria de Fátima Domingues Furtado1, Anita Mitico Tanaka-Azevedo1, Karen de Morais-Zani1-, Marisa Maria Teixeira da Rocha1, Wilson Fernandes1, Sávio Stefanini Sant'Anna1 1Laboratório de Herpetologia, Instituto Butantan, São Paulo, SP, Brasil. Abstrato A manutenção de serpentes no Instituto Butantan começou no século passado, com o objetivo de produzir um soro antiofídico diferenciado para reduzir a mortalidade por picada de serpente. Por meio de uma campanha bem-sucedida coordenada pela Vital Brazil, agricultores enviaram cobras venenosas ao Instituto Butantan pelas ferrovias sem custo. De 1908 a 1962, as cobras foram mantidas em um serpentário ao ar livre, onde a extração do veneno era realizada a cada 15 dias. Nesse período, a sobrevivência média das cobras foi de 15 dias. Em 1963, as serpentes foram transferidas para um prédio adaptado, atualmente denominado Laboratório de Herpetologia (LH), para serem mantidas em sistema intensivo. Embora a periodicidade da extração do veneno tenha permanecido a mesma, a sobrevida média dos animais aumentou para dois meses. Com a grave crise do soro em 1983, o Ministério da Saúde financiou a reforma dos três produtores públicos de soro e, com esse apoio, o LH pode ser melhorado. Foram instalados sistemas de ar condicionado e exaustão nos quartos, além do estabelecimento de manejos higiênico-sanitários críticos para aumentar o bem-estar das serpentes. No início da década de 1990, a sobrevivência das cobras era de dez meses. Ao longo dos anos até os dias atuais, diversas melhorias foram feitas no serpentário intensivo, como o estabelecimento de duas quarentenas, alimentação com roedores descongelados, intervalo de dois meses entre as rotinas de extração de veneno e monitoramento da saúde das serpentes por meio de exames laboratoriais. Com esses novos protocolos, a sobrevivência média das serpentes aumentou significativamente, sendo oito anos para o gênero Foram instalados sistemas de ar condicionado e exaustão nos quartos, além do estabelecimento de manejos higiênico-sanitários críticos para aumentar o bem-estar das serpentes. No início da década de 1990, a sobrevivência das cobras era de dez meses. Ao longo dos anos até os dias atuais, diversas melhorias foram feitas no serpentário intensivo, como o estabelecimento de duas quarentenas, alimentação com roedores descongelados, intervalo de dois meses entre as rotinas de extração de veneno e monitoramento da saúde das serpentes por meio de exames laboratoriais. Com esses novos protocolos, a sobrevivência média das serpentes aumentou significativamente, sendo oito anos para o gênero Foram instalados sistemas de ar condicionado e exaustão nos quartos, além do estabelecimento de manejos higiênico-sanitários críticos para aumentar o bem-estar das serpentes. No início da década de 1990, a sobrevivência das cobras era de dez meses. Ao longo dos anos até os dias atuais, diversas melhorias foram feitas no serpentário intensivo, como o estabelecimento de duas quarentenas, alimentação com roedores descongelados, intervalo de dois meses entre as rotinas de extração de veneno e monitoramento da saúde das serpentes por meio de exames laboratoriais. Com esses novos protocolos, a sobrevivência média das serpentes aumentou significativamente, sendo oito anos para o gênero várias melhorias foram feitas no serpentário intensivo, como o estabelecimento de duas quarentenas, alimentação com roedores descongelados, intervalo de dois meses entre as rotinas de extração de veneno e monitoramento da saúde das serpentes por meio de exames laboratoriais. Com esses novos protocolos, a sobrevivência média das serpentes aumentou significativamente, sendo oito anos para o gênero várias melhorias foram feitas no serpentário intensivo, como o estabelecimento de duas quarentenas, alimentação com roedores descongelados, intervalo de dois meses entre as rotinas de extração de veneno e monitoramento da saúde das serpentes por meio de exames laboratoriais. Com esses novos protocolos, a sobrevivência média das serpentes aumentou significativamente, sendo oito anos para o gêneroBothrops, dez anos para o gêneroCrotaluseLachesis,e quatro anos para o gêneroMicrurus. Visando a produção de venenos de boa qualidade, o respeito às boas práticas de manejo é essencial para a manutenção das serpentes em cativeiro. Novas técnicas e manejos eficientes devem sempre ser buscados para melhorar o bem-estar animal, a qualidade do veneno produzido e a segurança de quem trabalha diretamente com as serpentes peçonhentas. Palavras-chave: Cobra Veneno Criação de cobras Produção de veneno * Correspondência:kathleen.grego@butantan.gov.br https://doi.org/10.1590/1678-9199-JVATITD-2020-0068 Recebido: 05 de maio de 2020; Aceito: 03 de dezembro de 2020; Publicado on-line: 22 de janeiro de 2021 On-line ISSN 1678-9199 © O(s) autor(es). 2021 Open Access Este artigo é distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Atribuição 4.0 Internacional (http:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/), que permite uso, distribuição e reprodução irrestritos em qualquer meio, desde que você dê os devidos créditos ao(s) autor(es) original(is) e à fonte, forneça um link para a licença Creative Commons e indique se foram feitas alterações. A isenção de Dedicação de Domínio Público Creative Commons (http:// creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) aplica-se aos dados disponibilizados neste artigo, salvo indicação em contrário. Traduzido do Inglês para o Português - www.onlinedoctranslator.com http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ http://www.jvat.org http://orcid.org/0000-0003-4769-5818 http://orcid.org/0000-0002-7073-6000 https://orcid.org/0000-0001-9900-8384 https://www.onlinedoctranslator.com/pt/?utm_source=onlinedoctranslator&utm_medium=pdf&utm_campaign=attribution Grego et ai. J Venom Anim Toxins incluindo Trop Dis, 2021, 27:e20200068 Página 2 de 11 Fundo Baseado em referências bibliográficas e registros de banco de dados do Laboratório de Herpetologia (LH) sobre a manutenção de serpentes do Instituto Butantan; descrevemos a manutenção de serpentes para produção de veneno em quatro períodos diferentes, mostrando como as mudanças feitas na criação em cativeiro impactaram o bem-estar das serpentes peçonhentas e a quantidade de veneno produzida. Entre 1895 e 1897, o recém-formado médico Vital Brazil, da cidade de Campanha, Minas Gerais, mudou-se para Botucatu, São Paulo. Não é possível precisar a data exata de sua chegada, embora se saiba que nos primeiros dias de 1897 ele praticava e viajava de fazenda em fazenda, cuidando de seus pacientes [1]. Vital Brazil, impressionado com o número de pacientes picados por cobras venenosas, resolveu buscar um remédio que pudesse salvar vidas. Iniciou seus estudos avaliando a eficácia de estratos vegetais que a tradição apontava como solução para o problema.1]. Em 1898, já trabalhando no Instituto Bacteriológico de São Paulo, preparou o primeiro soro antiofídico de eficácia comprovada contra o envenenamento porBothropseCrotalus[1]. Em 1899, o diretor do Instituto Adolfo Lutz sugeriu ao Governador do Estado a criação do Instituto de Soroterapia do Estado de São Paulo, que, após sua conclusão, passou a ser dirigido por Vital Brazil [2,3]. Nesse momento, foram iniciadas as atividades do atual Instituto Butantan, oficializado em 1901. O uso de veneno de serpente para tratar envenenamento por serpentes foi descoberto por Albert Calmette, médico francês. Este cientistaacreditava em um universalsoro produzido apenas com oNajasp. veneno [2,4]. Vital Brazil, fundador do Instituto Butantan, passou a manter serpentes em cativeiro para extração de veneno para produção de soro antiofídico. Como consequência, ele descobriu o mundo especificidadede soros [1,3]. Serpentes que chegavam ao Instituto Butantan eram usadas para fornecer veneno para a imunização de cavalos que produziam soros antiofídicos; para pesquisas químicas, farmacológicas e imunobiológicas; e fornecer laboratórios com material para o estudo da biologia e sistemática de serpentes [5]. As cobras chegaram ao Instituto Butantan devido a um programa coordenado pelo Dr. Vital Brazil chamado “A defesa contra o ofidismo” [3,6], que teve como objetivo divulgar informações ao público em geral sobre o novo tratamento contra picadas de cobras, principalmente na zona rural [6,7]. Com este programa, a Vital Brazil atraiu o interesse de agricultores e trabalhadores rurais, estabelecendo um sistema de troca de serpentes peçonhentas por frascos de soro antiofídico, bem como todo material necessário para sua aplicação; incentivando a população a enviar cobras dentro de caixas de madeira seguras junto às linhas ferroviárias, gratuitamente [ 6,7]. Como resultado, o instituto recebeu serpentes em quantidade suficiente para fabricar soro antiofídico em escala compatível com as demandas da população.6,7]. Cada serpente recebida foi registrada em livros, com o nome do doador, a espécie da serpente, gênero, localidade de origem e data de chegada. Desde a fundação do Instituto Butantan em 1901 até 1977, cerca de 1,1 milhão de serpentes foram recebidas, sendo 80% de espécies venenosas [8]. Como resultado dessa campanha bem sucedida no início do século passado, ainda hoje o Instituto recebe uma grande variedade de cobras, embora não incentivemos sua captura, e por muito tempo não troque soro antiofídico por cobras. Atualmente o Instituto recebe serpentes principalmente do Estado de São Paulo. Manutenção de cobras de 1908 a 1962 Durante este período, as serpentes foram mantidas em um serpentário semi-intensivo medindo 500m2[5]. As extrações de venenos eram realizadas publicamente, tornando-se uma atração para o público em geral. Este serpentário ao ar livre tinha abrigos em forma de iglus para proteger as cobras do sol, do frio e da chuva; lagoas rasas; e neste espaço foram realizadas diversas demonstrações sobre manejo de cobras e prevenção de acidentes ofídicos (Figura 1). A extração do veneno foi realizada a cada 15 dias [9], e apesar do capricho em sua concepção, o serpentário semi- intensivo não proporcionou às serpentes boas condições de vida [10]. Nesse período, a porcentagem de mortalidade de cobras era de cerca de 92 a 98% ao ano, o que significa que cada cobra foi extraída apenas 0,6 a 1,5 vezes.9]. Neste tipo de manutenção, a taxa de sobrevivência das serpentes foi de cerca de 15 dias. As baixas taxas de sobrevivência no serpentário ao ar livre desde sua fundação até 1999 provavelmente se devem a fatores estressantes, incluindo a impossibilidade de termorregulação eficiente, a falta de protocolo alimentar controlado, a alta densidade populacional, associada à ausência de medicina higiênico-sanitária e preventiva.11]. Manutenção de cobras de 1963 a 1987 Enquanto a demanda por soro antiofídico aumentou de forma constante, o número de cobras recebidas no Instituto permaneceu o mesmo [9]. Para aumentar a produção de venenos, o veterinário Hélio Belluomini (chefe da Unidade de Animais Experimentais de Serpentes Peçonhentas – atual Laboratório de Herpetologia) passou a manter serpentes em um serpentário intensivo, introduzindo diversas mudanças no ambiente de criação das serpentes para prolongar sua taxa de sobrevivência. Belluomini também estudou sua biologia em cativeiro e aumentou o número de extrações/animal [8,9,12]. Ao contrário dos sistemas semi-intensivos, os serpentários intensivos têm a vantagem de controlar fatores abióticos, como temperatura, umidade e fotoperíodo, o que facilita a manutenção de espécies com diferentes exigências de manejo; permitir maior controle individual sobre alimentação e doenças; além de otimizar espaço [10,13,14]. Algumas das mudanças implementadas foram as salas aquecidas com resistências elétricas; a manutenção de até quatro cobras em cada caixa de madeira e o fornecimento de roedores dois dias após a extração do veneno [9]. Até 1978, a periodicidade de extração era de 15 a 20 dias e a sobrevivência média das serpentes era de cerca de dois meses. Em meados da década de 70, o uso de dióxido de carbono (CO ) foi adotado no serpentário interno para auxiliar na extração do veneno 2 Grego et ai. J Venom Anim Toxins incluindo Trop Dis, 2021, 27:e20200068 Página 3 de 11 rotina, como uma anestesia de curta duração. A inalação de CO puro por quatro a dez minutos é um método seguro e não traumático para serpentes, facilitando a extração do veneno e tornando-a mais segura para a equipe. O gás dióxido de carbono reduz significativamente o risco de acidentes, sem afetar a sobrevivência dos animais ou a produção de veneno.15]. De 1979 a 1987, embora a periodicidade da extração do veneno tenha sido estendida para 30 dias, a sobrevivência das serpentes permaneceu a mesma, em média de dois meses. Ressalta-se que a taxa de sobrevivência das serpentes mantidas no serpentário interno foi maior do que a taxa de sobrevivência dos animais mantidos no externo. Consequentemente, a produção de veneno também aumentou na terapia intensiva (Tabela 1). No entanto, muito mais era necessário para melhorar o bem-estar das cobras em cativeiro. uma empresa farmacêutica privada [16]. A produção e distribuição nacional de soro antiofídico entrou em crise quando a Syntex do Brasil encerrou sua produção de imunobiológicos em 1983 [17]. Para solucionar a escassez de soro antiofídico, em 1986 o Ministério da Saúde disponibilizou recursos para aprimorar e modernizar métodos e processos dos três produtores públicos, propondo adquirir integralmente toda a sua produção.16,17]. Assim, do segundo semestre de 1987 a 1989, o serpentário intensivo pôde ser remodelado e sua infra-estrutura melhorada. Uma renovação significativa foi a instalação de um sistema de ar para controlar a umidade relativa e a temperatura dentro das salas de manutenção, além de um sistema de ventilação eficiente. Além disso, o biólogo Wilson Fernandes, chefe do LH nesse período, individualizou cobras em caixas de madeira; manteve a extração do veneno uma vez por mês com auxílio de CO ; protocolo de alimentação alterado (as serpentes foram alimentadas com roedores uma semana após a rotina de extração); e instituiu a medicina higiênico-sanitária e profilática, como vermifugação e quarentena dos animais. Essas melhorias melhoraram a manutenção e o bem-estar de serpentes peçonhentas em cativeiro de tal forma, 2 2 Manutenção de Serpentes de 1988 a 2000 Até 1985, o soro antiofídico não fazia parte do Programa Nacional de Imunizações do Ministério da Saúde. Nesses anos, o antiveneno brasileiro foi produzido pelo Instituto Butantan (São Paulo), Instituto Vital Brazil (Rio de Janeiro) e Fundação Ezequiel Dias (Minas Gerais), além da Syntex do Brasil, Figura 1.Vista do serpentário semi-intensivo em 1926 (foto cortesia do Acervo do Centro de Memória do Instituto Butantan). Grego et ai. J Venom Anim Toxins incluindo Trop Dis, 2021, 27:e20200068 Página 4 de 11 Tabela 1.Veneno produzido por serpente [volume médio (mL) ± variação padrão], de acordo com o manejo e ano de manutenção. Período 1908-1962 1963-1968 2000-2004 2005-2019 2005-2019 Crotalus durissus 0,18ml* 0,26ml* 0,30ml* 0,45 ± 0,11mL 0,19 ± 0,07 mL Bothrops jararaca 0,10ml* 0,20ml* 0,27ml* 0,46 ± 0,18 mL 0,20 ± 0,09 mL Venom rendido/cobra no serpentário ao ar livre Venom rendido/cobra no serpentário interno Venom rendido/cobra recentemente capturada na sala de projeção * Nessesperíodos, nosso banco de dados possui apenas o valor médio de veneno extraído/animal. Na década de 1990, a manutençãoMicrurus corallinuse M. frontalisem LH começou. Manter essas espécies em cativeiro foi um desafio, devido à dificuldade em adaptá-las à criação em cativeiro e à sua dieta específica, que é baseada em anfisbenos e serpentes [1].18,19]. Durante este período, a taxa média de sobrevivência das cobras corais foi inferior a cinco meses [18,20]. A temperatura e a umidade de cada ambiente são monitoradas com termohigrômetros e anotadas diariamente em planilhas. Desde 2015, o veneno de cada cobra é extraído a cada 60 dias. A alimentação continua a ser dada a cada 30 dias, uma semana após a extração de rotina. Em relação à alimentação, os viperídeos são alimentados com roedores (Mus musculusouRattus norvegicus) do Centro de Reprodução de Roedores do Instituto Butantan, e desde 2015 os roedores são eutanasiados em gás CO, congelados e descongelados às cobras. A nova manobra evita o sofrimento dos roedores, bem como os possíveis ferimentos que as presas podem causar às cobras [23]. Noventa e cinco por cento de nossas cobras aceitam presas imediatamente descongeladas. A presa é dada na proporção de 10 a 20% do peso corporal da cobra para evitar a obesidade, que pode prejudicar a saúde dos animais, causar infertilidade e até a morte.23,24]. No que diz respeito à alimentação de cobras corais ofiófagos (Micrurus corallinuseM. frontalis),jovens viperídeos e pequenas cobras dipsadini são sacrificados, congelados e administrados em uma proporção de 30 a 40% do peso corporal do coral.20]. As presas congeladas são descongeladas em água quente e oferecidas às cobras. Alguns fatores podem ser responsáveis pela anorexia em serpentes, como doenças sistêmicas e parasitárias; animais em processo de ecdise; baixa ou alta temperatura e umidade; fêmeas que deram à luz recentemente; cobras com neoplasias; entre outros [23,25 ]. Verificamos que durante a época reprodutiva (de abril a agosto), alguns animais, principalmente machos, não se interessam em se alimentar, corroborando outros trabalhos na área.26,27]. Um protocolo utilizado no LH consiste em alimentar à força os animais que recusam presas por três meses consecutivos e, posteriormente, investigar e corrigir a causa da inapetência. Serpentes anoréxicas são sedadas em recipiente com gás CO e, com o auxílio de pinças, roedores descongelados lubrificados em complexo vitamínico são gentilmente forçados no esôfago da serpente (os dentes incisivos do roedor devem ser cortados para evitar lesões no esôfago da serpente). Em relação aos elapídeos anoréxicos, uma dieta específica feita em LH é administrada através de um tubo esofágico [20]. Todas as melhorias feitas no serpentário indoor ao longo dos anos são responsáveis pelas maiores taxas de sobrevivência que alcançamos atualmente. A taxa média de sobrevivência para os diferentes gêneros considera serpentes nascidas em cativeiro, bem como recém-chegadas após período de quarentena. A taxa média de sobrevivência para o gêneroBothropsé de oito anos, para o gênero Crotaluse Lachesisde dez anos, e para o gêneroMicrurus,quatro anos. Manutenção de Snakes de 2000 até hoje 2 A manutenção de serpentes em LH desde o ano 2000 até hoje não mudou muito, embora melhorias sejam feitas continuamente para aumentar o bem-estar das serpentes e a segurança daqueles que trabalham diretamente com elas. Atualmente, o LH mantém aproximadamente 1000 exemplares de cobras venenosas, incluindo cobras-corais (Micrurus corallinus, M. frontalis, M. ibiboboca, M. spixieM. altirostris),caçadores de mato (Lachesis muta),víboras (Bothrops jararaca, B. jararacussu, B. alternatus, B. moojeni, B. neuwiedi, B. mattogrossenssis, B. pauloensis, B. pubescens, B. marmoratus, B. erythromelas, B. insularis, B. fonsecai, B. cotiara , B. billineata, B. leucuruseB. atrox), cascavéis (Crotalus durissus) e naja (Naja kaouthia). Além de extrair veneno, pesquisadores e técnicos do LH também estudam biologia reprodutiva, comportamento e criação de serpentes; investigar patologias que acometem espécimes em cativeiro; e estudar aspectos biológicos, bioquímicos e farmacológicos de seus venenos. As cobras são mantidas em gaiolas plásticas com dimensões diferentes de acordo com seu tamanho (uma cobra enrolada não pode ocupar mais de 1/3 da área total da gaiola [14,21]. As gaiolas são feitas de material plástico transparente impermeável, livre de fissuras e inerte a desinfetantes e produtos químicos de limpeza, conforme recomendação da OMS [21], e dispostos em prateleiras para otimizar o espaço da sala. O gêneroBothropseCrotalussão mantidos nessas gaiolas com substrato de papelão ondulado e água disponível gratuitamente (Figura 2A), o gêneroMicrurusé mantido em gaiolas com substrato de casca, também com água à vontade [20] (Figura 2B). Na gaiola de cada cobra, há um crachá com o código da cobra, localidade de origem e sexo. O gêneroLachesis mutadevido ao seu grande tamanho é mantido em uma área de 20 m2sala, com água ao alcance, grama artificial, ventilador umidificador e abrigos com substrato fofo. As salas são mantidas com temperaturas entre 23 a 26ºC, com umidade relativa em torno de 60% e ciclo claro/escuro de 12h [22]. 2 Grego et ai. J Venom Anim Toxins incluindo Trop Dis, 2021, 27:e20200068 Página 5 de 11 Figura 2. (A)Gaiolas utilizadas na manutenção de viperídeos com substrato de caixa de papelão ondulado e potes plásticos para água. Cada gaiola tem um crachá com o número do código da cobra, localidade de origem e sexo.(B)Substrato de casca usado na manutenção de cobras corais (Micrurus corallinus). O LH conta com uma equipe de técnicos e biólogos treinados e pelo menos um veterinário, conforme recomendação do CONCEA [14]. A instalação é composta por uma sala de projeção; duas quarentenas; dez salas para manutenção de cobras venenosas; uma sala de consulta/cirurgia; uma sala de reprodução; uma sala de berçário; um laboratório de análises clínicas; um laboratório de anatomia patológica; e laboratórios para processar e estudar venenos de cobras. Sala de triagem As cobras peçonhentas que chegam ao Instituto doadas por fazendeiros, Corpo de Bombeiros ou Polícia Ambiental são encaminhadas ao LH onde ficam por no máximo sete dias na sala de triagem. Nesta sala, todas as cobras têm seus venenos extraídos e alguns espécimes, de acordo com seu estado de saúde, sexo e localidade de origem, são selecionados para irem para a sala de quarentena. É importante dizer que para a produção de um soro antiofídico de alta qualidade, é essencial ter espécimes de uma ampla área geográfica.10,21]. As serpentes não selecionadas são encaminhadas para projetos de pesquisa, zoológicos ou coleções zoológicas. Na sala de triagem, as cobras selecionadas para quarentena são examinadas clinicamente; pesado e medido [comprimento focinho- cloalha (CVE) e comprimento total (CT)]; receber sua primeira dose de anti-helmíntico (Ivermectina 0,2 mg kg-1) e são imersos em solução ectoparasiticida (Triclorfon a 0,2%). Esse primeiro manejo profilático é de suma importância, pois os espécimes que chegam da natureza geralmente hospedam uma vasta gama de endo e ectoparasitas que podem predispor os animais a infecções, má absorção de alimentos, regurgitação e até mesmo levá-los à morte se não forem eliminados.11 ,23,28]. Os principais endoparasitos encontrados em viperídeos recém-chegados são nematóides pulmonares (Figura 3A), nematóides gastrointestinais (Figura 3B) e pentastomídeos pulmonares (Figura 3C). Mais raramente são encontrados cestóides e trematódeos gastrointestinais.11,23,28]. Protozoários também são comuns, como flagelados e coccídeos. Figura 3. (A)NematódeoRhabdiassp. no pulmão deBothrops jararaca. (B)Ascarídeos no trato gastrointestinal superior deCrotalus durissus.(C) Parasito pentastomídeo no pulmão deBothrops jararaca. Entre os ectoparasitas, os principais são os carrapatos(Amblyomma sp.) e ácaros (Ophionyssus natricis). Após os procedimentos profiláticos descritos acima, as serpentes são encaminhadas para a sala de quarentena estrategicamente localizada ao lado da sala de triagem, mas separada por uma porta (barreira física). Cada cobra recebe um Formulário Individual onde constam informações sobre sua localidade de origem; data de chegada; Gênero sexual; SVL – TL e peso; número de código específico; número do microchip; data da alimentação; data da ecdise; data da extração do veneno; tratamentos veterinários; e data do pareamento, gestação e parto, são anotados. Grego et ai. J Venom Anim Toxins incluindo Trop Dis, 2021, 27:e20200068 Página 6 de 11 Divisão de quarentena Todas as salas possuem termohigrômetro para monitoramento diário de temperatura e umidade, além de um temporizador de luz programável para garantir ciclos claro/escuro. As cobras são inspecionadas diariamente e as gaiolas são trocadas sempre que necessário. Em cada sala de manutenção mantemos cobras da mesma espécie ou cobras com requisitos semelhantes de criação. A extração do veneno é realizada mensalmente dentro da sala, com auxílio de gás carbônico (CO ) e mesa de aço inoxidável. As cobras são colocadas em recipientes saturados com gás CO, onde permanecem por cerca de 5 minutos. Após a cessação dos estímulos, as cobras são retiradas do recipiente e a extração do veneno é realizada por massagem das glândulas de veneno, que leva cerca de 5 a 8 segundos. O uso de CO não causa nenhum dano às cobras [33]. Extração de veneno de viperídeo (Bothropssp., Crotalus durissus e Lachesis muta) é realizado em um béquer de vidro coberto com plástico espesso, imerso em banho de gelo. O plástico é trocado após cada extração para evitar contaminação entre os indivíduos (Figura 4A). Após o procedimento de extração, clorexidina a 0,12% é pulverizada nas bainhas das presas para prevenir infecções por micro lesões que podem ocorrer durante o procedimento de extração. A cobra é então pesada, medida (SVL- TL) e devolvida à sua gaiola. Uma semana após a extração, as cobras são alimentadas com roedores descongelados. Extração de veneno de elapídeo (Micrurussp.) é diferenciada. Devido ao pequeno tamanho dessas serpentes e suas glândulas de veneno reduzidas, a pilocarpina é administrada por via intradérmica (10 mg kg -1) dez minutos antes da extração do veneno para aumentar a eficiência da ordenha [34]. A pilocarpina é um alcalóide natural com atividade agonista colinérgica que se liga a receptores muscarínicos induzindo secreção de glândulas exócrinas.35]. Utilizando a pilocarpina observamos um aumento de 127% no volume de veneno extraído da Micrurus coralinus,sem mudança significativa na composição do veneno [34]. A extração das cobras-corais é feita com pontas conectadas às presas do proteróglifo (Figura 4B) e, com o auxílio de pipetas, o veneno é transferido para microcentrífuga A introdução de animais que chegam em um novo local produz respostas estressantes que, se prolongadas, podem levar à angústia, exaustão e até morte.23,29,30,31]. Portanto, os animais devem passar por um período de aclimatação (quarentena) antes de serem introduzidos nas salas de manutenção. Além disso, a quarentena das cobras que chegam é essencial para evitar a propagação de doenças infecciosas e parasitárias.22,31,32]. O LH trabalha com duas salas de quarentena (Q1 e Q2) que ficam próximas à sala de triagem e às salas de Manutenção, porém separadas por elas por barreiras físicas conforme recomendação da OMS [21]. Q1 recebe os animais semanalmente e é o início da aclimatação. Nessa sala, as cobras são inspecionadas diariamente, recebem a segunda dose do anti-helmíntico (15 dias após a data de chegada) e são alimentadas mensalmente. Q2 recebe cobras saudáveis do Q1 em um “tudo dentro, tudo fora" sistema. Nesse sistema, cobras saudáveis que estão se alimentando adequadamente e estão há pelo menos 30 dias no Q1 são transferidas no mesmo dia para o Q2, onde ficam isoladas por 30 dias. Após esse período, todos são transferidos para as salas de Manutenção no mesmo dia. Enquanto no Q2 os animais são inspecionados diariamente e se um indivíduo morre, o período é estendido por mais 30 dias. Neste caso, a causa da morte é investigada. Portanto, nosso período de quarentena dura pelo menos 60 dias. Apenas serpentes com exames coproparasitológicos negativos são transferidas para as salas de Manutenção. A extração de veneno não é realizada nas salas de quarentena. 2 2 2 Salas de manutenção para produção de veneno Na entrada do hall das salas de Manutenção, há uma pequena área de 8 m2 onde os técnicos usam aventais e capas de botas/sapatos para evitar a entrada de patógenos externos na instalação de animais. As salas de manutenção têm 20m2com paredes revestidas com epóxi e piso de granulito para facilitar a limpeza. Cada sala tem capacidade para manter 90 cobras em gaiolas plásticas individuais dispostas em prateleiras. Figura 4. (A)Extração de veneno emCrotalussp. realizado em um béquer de vidro coberto com uma folha plástica grossa, imerso em banho de gelo.(B)Extração de veneno em cobra coral realizada com pontas conectadas às presas do proteróglifo. Grego et ai. J Venom Anim Toxins incluindo Trop Dis, 2021, 27:e20200068 Página 7 de 11 tubos em banho de gelo. Uma semana após a extração, as cobras-corais são alimentadas com cobras descongeladas em uma proporção de 30 a 40% do seu peso corporal.20] por três semanas alternadas. Todas as salas são equipadas com equipamentos de proteção individual (EPIs) e utensílios necessários para o manuseio de cobras, como ganchos, alça de Lutz, tubos de contenção, pinças e pinças, que são imersos em solução de hipoclorito de sódio a 4% após o uso. submetidos à extração de veneno. As cirurgias também são realizadas nesta sala sempre que necessário. O mobiliário desta sala é composto por mesa de aço inox, aparelho de ultrassom, aparelho de anestesia inalatória, armário de remédios, forno de esterilização para materiais cirúrgicos e geladeira para medicamentos. Sala de Reprodução A sala de reprodução não possui móveis, mas quatro câmeras estrategicamente posicionadas para registrar o comportamento reprodutivo, como combates em algumas espécies (Figura 5A), corte do macho e acasalamento (Figura 5B). Costumamos colocar dois machos na sala para aumentar a competitividade e o interesse reprodutivo, e após 30 minutos uma fêmea é colocada na sala. No dia seguinte ao pareamento, é realizado um esfregaço vaginal para verificar a presença de espermatozóides. Se o resultado for positivo, mensalmente é feito um exame de ultrassonografia para acompanhar a gestação da fêmea até o nascimento (Figura 6). Sala de Consulta/Cirúrgica Nesta sala estrategicamente construída próxima às salas de manutenção, o veterinário realiza exames clínicos, ultrassonográficos, diagnósticos diferenciais e prescreve tratamentos a serem estabelecidos em serpentes que apresentem sintomas de doença ou alteração de comportamento, como desconforto respiratório, lesões de pele, distúrbios gastroentéricos, entre outros. . Animais doentes e em tratamento não são Figura 5. (A)Combate emCrotalus durissus(cascavel) machos.(B)Acasalamento emCrotalus durissus. Figura 6.imagem de ultra-som deCrotalus durissusfetos. Grego et ai. J Venom Anim Toxins incluindo Trop Dis, 2021, 27:e20200068 Página 8 de 11 viperídeos brasileiros, com exceção deLachesis muta, são cobras vivíparas; elapids (cobras corais) eLachesis muta (bushmasters) são ovíparos. Devido à diminuição da chegada de serpentes ao Instituto Butantan, temos aprimorado a reprodução para sermos autossuficientes, dependendo menos de serpentes vindas da natureza. Atualmente, 60% das serpentes mantidas em LH são nascidas em cativeiro. Observamos que apenas pequenas diferenças na constituição do veneno são detectadas quando comparamos venenos recém-chegadosBothrops jararacae cobrasnascidas ou mantidas por vários anos em cativeiro [36]. conhecimento sobre diferentes espécies, determinar alterações macroscópicas e microscópicas, bem como o agente etiológico e a causa da morte.23,37]. Nosso laboratório de anatomia patológica está localizado fora da instalação de animais. Necropsias são realizadas no LH desde a década de 1990, com 3.050 necropsias realizadas até agora. Os principais sistemas afetados na maioria das espécies são o digestivo (gastrite e enterite) e o respiratório (pneumonia caseosa). Atualmente, com o aumento da longevidade de nossas serpentes, tem sido cada vez mais comum a presença de neoplasias (Figura 7), assim como doenças cardíacas. Enfermaria Padrões de fluxo de tráfego Todas as cobras recém-nascidas, sejam de fêmeas que chegam grávidas da natureza ou de acasalamento que ocorreu no LH, são mantidas até o 3º.rdano de idade na creche. Cobras jovens de até um ano de idade são alimentadas a cada 15 dias com dedinhos, e a partir de um ano são alimentadas mensalmente com pesos variados de roedores, dependendo do tamanho da cobra. Aos três anos, as cobras jovens são transferidas para as salas de manutenção, onde são ordenhadas periodicamente. Um dos cuidados higiênico-sanitários cruciais em um serpentário que deve ser sempre atendido, são os padrões de fluxo de tráfego, que devem progredir das áreas menos contaminadas (menor potencial de contaminação microbiana) para as áreas altamente contaminadas (maior potencial de contaminação microbiana). , sempre em sentido único (Figura 8). Produção de veneno ao longo dos anos A qualidade e quantidade do veneno produzido estão diretamente ligadas ao estado de saúde e bem-estar das serpentes. Como as condições de manutenção vêm melhorando ao longo dos anos, a produção de veneno (por cobra) também está aumentando, como pode ser visto na Tabela 1. A tabela mostra que menos veneno foi extraído no período de 1908 a 1962. Nessa época, as cobras percorridos por linhas férreas de diversas regiões do Brasil em caixas de madeira com restrição hídrica, demorando alguns dias para chegar ao Instituto. As cobras chegaram estressadas, desidratadas e algum veneno foi perdido durante a contenção física para o procedimento de ordenha. Desde a implantação do serpentário indoor em 1963, a produção de veneno/cobra vem aumentando devido às melhorias profiláticas e de bem-estar.8,9]. Laboratório de Análises Clínicas Esta sala está equipada para a realização de exames hematológicos, bioquímicos e coproparasitológicos para acompanhamento do estado de saúde das serpentes mantidas no serpentário, diagnóstico de doenças e seu prognóstico. Laboratório de Anatomia Patológica As serpentes que morrem no biotério são encaminhadas ao Laboratório de Anatomia Patológica, onde são realizadas necropsias. Fragmentos de tecido de todos os órgãos são coletados para análise histopatológica. O exame de necropsia é importante para aumentar nossa Figura 7.Tumor da glândula de veneno em um velhoBothrops alternatus. Grego et ai. J Venom Anim Toxins incluindo Trop Dis, 2021, 27:e20200068 Página 9 de 11 Figura 8.Padrões de fluxo de tráfego no serpentário LH. Vale ressaltar que a quantidade de veneno extraída de Crotalus durissuseBothrops jararacarecém-chegados da natureza (na sala de triagem) de 2005 a 2019 foi 50% menor que o volume extraído de serpentes mantidas em cativeiro por pelo menos 60 dias (após o período de quarentena). No gêneroC. durissus, o volume extraído na sala de projeção foi muito próximo ao relatado para o serpentário ao ar livre de 1908 a 1962. No gêneroB. jararaca, o volume atualmente obtido de indivíduos recém-chegados é o dobro do obtido em 1908-1962, mas ainda 50% inferior ao volume extraído de serpentes mantidas em cativeiro por pelo menos 60 dias. Conclusão A manutenção de serpentes peçonhentas em cativeiro para produção de veneno é essencial. Anualmente, 20.000 acidentes ofídicos ocorrem no Brasil, e os produtores de soros devem atender a demanda nacional pelo fornecimento de soros eficientes. Esse breve histórico mostrou que as melhorias feitas no biotério LH aumentaram a taxa de sobrevivência das serpentes ao longo dos anos, bem como a quantidade e a qualidade do veneno produzido. As mudanças mais significativas foram as medidas profiláticas, incluindo quarentena, padrões de fluxo unidirecional e uso de aventais e capas de sapato ao entrar em diferentes áreas do serpentário. Grego et ai. J Venom Anim Toxins incluindo Trop Dis, 2021, 27:e20200068 Página 10 de 11 O controle de fatores abióticos, como temperatura e umidade, de acordo com as espécies mantidas em cada sala, aumentou o bem-estar dos animais. Além disso, o LH possui pessoal altamente qualificado para manusear, manter e reproduzir diferentes espécies de serpentes em cativeiro, além de realizar análises clínicas e anatômicas e pesquisas de venenos. Desde 2000, os lotes de veneno produzidos no LH são submetidos a análises bioquímicas, como concentração de proteínas e eletroforese em gel de dodecil sulfato-poliacrilamida em condições redutoras e não redutoras; bem como análises toxicológicas, como LD (determinação da dose letal mediana). Essas análises são importantes para monitorar a qualidade e eficácia dos diferentes venenos produzidos. Um serpentário bem conduzido é um elemento chave na manutenção de serpentes peçonhentas para produção de veneno. Novas técnicas e manejo eficiente devem sempre ser buscados para melhorar o bem-estar das serpentes, a qualidade e a quantidade de veneno produzida e a segurança daqueles que trabalham diretamente com os animais peçonhentos. Todos os procedimentos realizados em uma manutenção de cobras devem ser devidamente documentados e programados. Consentimento para publicação Não aplicável. Referências 1. Donato H. Achegas para a história de Botucatu. 218p. 1954. 2. Bucherl W. Acúleos que matam. Revista dos Tribunais, São Paulo. 153p. 1979. 3. Vital-Brasil AO. A Defesa contra o Ofidismo. Pocai, Weiss, editores. São Paulo (SP). 1911. 4. Bochner R. Caminhos para a descoberta da soroterapia antiveneno na França. J Venom Anim Toxins incl Trop Dis. 14 de julho de 2016;22(1):20. https://doi. org/ 10.1186/s40409-016-0074-7. 50 5. Vital-Brasil AO. Noções gerais sobre serpentes. Instituto Butantã. São Paulo (SP). 1954. 6. Brasil LV. Vital Brazil: vida e obra 1865-1950. Instituto Vital Brasil. 2001. 7. Mott ML, Alves OS, Dias CESB, Fernandes CS, Ibañez N. A defesa contra o ofidismo de Vital Brazil e sua contribuição à Saúde Pública brasileira. Cad Hist Ciênc. 2011;7(2):73-85. 8. Belluomini HE. Produção de veneno de serpentes em cativeiro. Arq Inst Biol. 1964;31:149-54. 9. Belluomini HE. Produção de veneno de cobras em cativeiro. Mem Inst Butantan. 1965;32:79-88. 10.Melgarejo-Giménez AR. Criação e manejo de serpentes. In: Animais de Laboratório: Criação e Experimentação. pág. 388. 2002.Agradecimentos 11.Grego KF, Gardiner CH, Catão-Dias JL. Patologia comparativa de infecções parasitárias em víboras de vida livre e em cativeiro (Bothrops jararaca). Veterinário Rec. 1 de maio de 2004;154(18):559-62. Os autores agradecem a todo o pessoal do Laboratório de Herpetologia pelo apoio no serpentário interno e ao pessoal da Unidade de Roedores do Instituto Butantan pela criação e manutenção das presas utilizadas para alimentação das serpentes. 12.Belluomini HE. Extração e quantidades de veneno de algumas serpentes brasileiras. In: Bucherl W, Buckley E, Deulofeu V, editores. Animais peçonhentos e seus venenos. Imprensa Acadêmica de Nova York. pág. 97-117. 1967. 13.Brasil. Resolução Normativa Nº 29, de 13 de nov. de 2015. Decreto n. 3.847, de 30 de mar. de 2017. Anfíbios e serpentes em instalações de instituições de ensino ou pesquisa científica. Brasília, DF. Novembro 2015. Disponibilidade de dados e materiais 14.Grego KF, Sant'Anna SS, Almeida-Santos SM. Anfíbio e serpentes em instalações de instituições de ensino e pesquisa científica.In: Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação e Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (organizadores). Guia Brasileiro de Produção, Manutenção ou Utilização de Animais em Atividades de Ensino ou Pesquisa Científica. Brasil. pág. 53-74. 2016. Os conjuntos de dados gerados durante e/ou analisados durante o estudo atual estão disponíveis com o autor correspondente mediante solicitação razoável. Financiamento 15.Leinz FF, Janeiro-Cinquini TRF, Ishizuka MM. Dióxido de carbono como auxiliar na extração de veneno debothrops jararacacobras (viperidae, crotalinae). Mem Inst Butantan. 1990;52(1):17-23.Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), projeto número 2017/18100-2. 16.Cardoso JLC, Wen FH. Introdução ao ofidismo. In: Cardoso, JLC, França FOS, Wen FH, Málaque CMS, Haddad V, editores. Animais peçonhentos no Brasil. São Paulo (SP). pág. 3-5. 2003. Interesses competitivos Os autores declaram não ter interesses conflitantes. 17.Gadelha CAG. A produção e o desenvolvimento de vacinas no Brasil. Hist Cienc Saúde-Manguinhos. 1996;3(1):111-32. 18.Serapicos EO, Merusse JLB. Variação de peso e sobrevida deMicrurus corallinus sob diferentes condições de alimentação em biotério (Serpentes, Elapidae). Iheringia Sér Zool. 2002 dez;92(4):105-9.Contribuições dos autores 19.Serapicos EO, Merusse JLB. Análise comparativa entre tipos de alimentação de Micrurus corallinus(Serpentes, Elapidae) em cativeiro. Iheringia Sér Zool. 2002 dez;92(4):99-103. SEV, JPV, EOS, CCB, GPMS, FSR, LCFA, DRS, LCRAZ, MFDF, AMTA, KMZ, MMTR, WF, SSS: todos os autores são ou foram importantes na história do nosso biotério e sem eles não haveria absolutamente nenhuma história. Todos os autores forneceram feedback crítico e ajudaram a moldar este artigo de revisão. Além disso, todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final. 20.Mendes GF, Stuginski DR, Loibel SM, Morais-Zani KD, Da Rocha MMT, Fernandes W, et al. Fatores que podem influenciar as taxas de sobrevivência de cobras corais ( Micrurus corallinus) para a produção de soro antiofídico. J Anim Sci. 2019 fev;7(2):972-80. 21.Organização Mundial da Saúde. Diretrizes para a produção, controle e regulação de imunoglobulinas antiofídicos. Anexo 5. p. 236-46. 2016. 22.Rossi JV. Manejo e manejo geral. In: Divers SJ, Stahl SJ, editores. Medicina e Cirurgia de Répteis e Anfíbios. São Luís, Missouri. pág. 109-30. 2019. Aprovação ética A manutenção de serpentes em cativeiro para extração de veneno no Laboratório de Herpetologia é aprovada pelo Comitê de Ética do Instituto Butantan, número 7967310720. 23.Grego KF, Rameh-Albuquerque LC, Kolesnikovas CKM. Squamata: Serpentes. In: Cubas ZS, Silva JCR, Catão-Dias JL, editores. Tratado de Animais Selvagens: medicina veterinária. São Paulo (SP). pág. 186-218. 2014. Grego et ai. J Venom Anim Toxins incluindo Trop Dis, 2021, 27:e20200068 Página 11 de 11 24.Boyer TH. Doenças nutricionais. In: Divers SJ e Stahl SJ, editores. Medicina e Cirurgia de Répteis e Anfíbios. São Luís, Missouri. pág. 932-50. 2019. 31.Rivera S. Quarentena. In: Divers SJ e Stahl SJ, editores. Medicina e Cirurgia de Répteis e Anfíbios. São Luís, Missouri. pág. 142-4. 2019. 25.Funk RS, Schnellbacher RW. Diagnósticos diferenciais por sinais clínicos - Serpentes. In: Divers SJ e Stahl SJ, editores. Medicina e Cirurgia de Répteis e Anfíbios. São Luís, Missouri. pág. 1249-56. 2019. 32.Murphy JB, Armstrong BL. Manutenção de cascavéis em cativeiro. Museu de História Natural, Universidade do Kansas, 1978. 33.Wang T, Fernandes W, Abe AS. pH sanguíneo e homeostase de O2 sob anestesia com CO na cascavel (Crotalus durissus). 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