Relatório de Microbiologia - Prática 1 (Coloração de Gram)

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Universidade Federal da Grande Dourados
Faculdade de Ciências Biológicas e Ambientais – FCBA Disciplina de
Microbiologia – P3
Professora Dra. Kelly Mari Pires de Oliveira
Acadêmica: Sammara Valim Luz
Relatório prática I – Coloração de Gram
Dourados – 2022
Introdução
A microbiologia é a área da ciência que estuda os microrganismos existentes no mundo,
ela analisa suas funções, características, metabolizações, distribuições e seus efeitos. Estes
microrganismos podem ser eucariontes (cujo núcleo celular está envolto por uma membrana)
como algas, fungos e protozoários, podem ser procariontes (nos quais o material genético está
disperso no interior da célula) como as bactérias ou podem ser acelulares (sem célula) como os
vírus, viroides e prions. O surgimento da microbiologia está ligado ao desenvolvimento
tecnológico tendo um grande avanço no período de 1857 a 1914, particularmente na Europa.
Louis Pasteur estabeleceu a relação entre o processo de fermentação do vinho com
microrganismos (as leveduras, organismos unicelulares pertencentes ao Reino Fungi) e, na busca
de uma solução para um problema dos viticultores de uma região da França – a acidificação dos
vinhos armazenados – relacionou essa deterioração com a contaminação por bactérias. Pasteur
descobriu que, aquecendo o vinho a uma temperatura de 56ºC, os organismos que alteravam o
gosto do vinho eram eliminados. Esse processo ficou conhecido como pasteurização, ainda hoje
largamente utilizado na indústria de alimentos, principalmente como processo de conservação do
leite.
Já a coloração de Gram ou técnica de Gram, é uma técnica de coloração secular descrita
em 1884 pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram. É rápida e simples, tendo
como objetivo diferenciar as bactérias de acordo com as características de sua parede celular
após exposição a diferentes corantes e soluções, sendo assim possível verificar, além da forma da
bactéria, a cor que adquirem, sendo esse resultado importante para definir outras estratégias de
identificação da espécie bacteriana. Sua preparação consiste em um esfregaço em lâmina de
vidro para microscopia, de preferência da porção mais purulenta/sanguinolenta da amostra. No
caso de líquidos corporais, pode-se realizar uma citocentrifugação para se concentrar o material,
obtendo assim uma melhor visualização das estruturas. A amostra é então mantida em ar
ambiente para sua secagem ser fixada por metanol ou por meio de um leve aquecimento. Um
corante (cristal violeta) é adicionado, por um a dois minutos, e, em seguida, inserido o lugol,
também por um a dois minutos. Dessa reação, forma-se o complexo iodo-pararosanilina na
parede celular das bactérias, que coram-se de roxo (nessa fase, tanto as bactérias Gram-positivas
e Gram-negativas retêm o corante). Na próxima etapa, após a lavagem da lâmina, inicia-se a
etapa de descoloração, acrescentando-se uma solução de álcool-éter ou de álcool-acetona ao
material. Nesse momento, em virtude das diferenças entre a constituição das paredes celulares
(as bactérias Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptidoglicanos e de ácidos
teicóicos, já nas Gram-negativas essa camada é mais delgada, com maior proporção lipídica), as
Gram-positivas resistem à descoloração, retendo o corante, permanecendo roxas. Em
contrapartida, as finas e lipídicas paredes celulares das bactérias Gram-negativas, quando
expostas ao álcool, fazem com que as mesmas percam o corante, tornando-se incolores. Na fase
de contra-coloração, após uma lavagem da lâmina com água, é adicionado safranina (corante de
cor vermelha), o qual é o responsável pela coloração avermelhada das bactérias Gram-negativas.
Nova lavagem com água é realizada, secando-se cuidadosamente o material em seguida. A
lâmina é então colocada no microscópio, sendo primeiramente visualizada em objetiva de
pequeno aumento, para em seguida ser observada em objetiva de imersão em óleo (aumento de
mil vezes) (MORALES, 2020).
Objetivo
O objetivo da aula prática foi inocular bactérias e observar seu crescimento em diferentes
meios de cultura. Na segunda parte da aula nós pegamos parte das bactérias de levedura e
fizemos a coloração de Gram, fizemos também um swab bucal e realizamos a coloração das
bactérias bucais também. Observamos a coloração no microscópio para saber se a bactéria é
Gram-positiva ou Gram-negativa.
Materiais
➔ Placas de petri com meio de cultura;
➔ Tubo de ensaio com meio líquido;
➔ Tubo de ensaio com meio sólido
inclinado;
➔ Tubo de ensaio com o meio
semi-sólido;
➔ Alça de platina;
➔ Agulha de platina;
➔ Microscópio óptico;
➔ Lâmina;
➔ Óleo de imersão;
➔ Solução salina;
➔ Bico de bunsen;
➔ Placa de petri contendo uma
Staphylococcus Aureus para a
coloração de Gram;
➔ Colônia de bactérias A;
➔ Cristal Violeta;
➔ Lugol;
➔ Álcool;
➔ Safranina;
➔ Pipeta.
Métodos
A aula foi dividida em duas partes, a primeira parte fizemos a inoculação do meio,
primeiramente transferimos uma bactéria A para os tubos de ensaio e em seguida para as placas
de petri. Os resultados da inoculação ficaram prontos após 24h. No resultado, observamos se há
presença de flagelos nas bactérias ou se houve alguma contaminação do meio externo nos
tubos/placas. Para a transferência, utilizamos duas alças de platina, uma tipo agulha e outra tipo
alça. Com a agulha tocamos levemente em uma colônia de bactérias, e passamos para o primeiro
tubo de ensaio, que no meu caso foi o meio semi-sólido. Tocamos a agulha no fundo do tubo,
sem encostar nas beiradas, e com a agulha devidamente esterilizada e dentro do campo de calor
do bico de bunsen, para evitar contaminação. No segundo tubo, que foi o meio sólido com o ágar
inclinado, primeiro tocamos a agulha com a colônia de bactérias no fundo do tubo, e subimos
para a superfície do ágar fazendo estrias com a agulha, sem perfurar o ágar, para observar se o
crescimento de bactérias é maior com maior ou menor presença de oxigênio. No terceiro e último
tubo, o de meio líquido, pegamos com a alça de platina a bactéria do tipo Staphylococcus Aureus
presente no tubo e inoculamos em outro tubo com o meio líquido. Após todo o procedimento
com os tubos, fizemos o mesmo com as placas de petri, utilizamos duas, uma com as bactérias
em meio sólido e a outra no meio líquido. Identificamos todo o material e levamos para a estufa
para observar no dia seguinte. Na segunda parte da aula, fomos para a coloração de Gram.
Utilizamos três lâminas de vidro para observar as amostras coletadas. A primeira amostra foi a
da bactéria em meio sólido, onde pegamos com a pinça de platina uma colônia, colocamos
solução salina na lâmina e fizemos o esfregaço. Na segunda lâmina, fizemos a mesma coisa, mas
com as bactérias em meio líquido, e na terceira, fizemos com as bactérias presentes na nossa
boca, que pegamos com um swab e fizemos o esfregaço normalmente na lâmina. Após, foi
preciso deixar todas as lâminas trabalhadas secando por alguns minutos e passamos as lâminas
três vezes no fogo do bico de bunsen, para se certificar que estava bem fixado e não precisar
repetir todo o procedimento. Na etapa da coloração (que é igual em todas as lâminas), primeiro
pingamos um pouco de cristal violeta, deixamos agir por 1 minuto e colocamos em seguida o
lugol que vai agir por mais 1 minuto; após isso, realizamos a lavagem da lâmina com álcool e
água, e aplicamos safranina, deixando agir por apenas 30 segundos. Após a safranina, lavamos
novamente, mas dessa vez apenas com água, enxugamos o excesso com um papel toalha e
deixamos secar. Depois de seco, levamos até o microscópio óptico para observar a coloração e
identificar se as bactérias eram Gram-positivas ou Gram-negativas.
Resultados
Em ambas as placas pode-se observar o crescimento de algumas colônias, mas foram
contaminadas pelo meio externo. No tubo com meio sólido, não apareceram quase nada
relacionado a colônia, nem na parte de oxigênio e nem na parte com menos oxigênio,
provavelmente também por erro de manuseio na hora da inoculação. No tubo semi-sólido a
inoculação teve um grandesucesso, pois foi inoculada sem contaminação, também notou-se que
a bactéria não possui flagelos, pois cresceu somente onde a agulha contaminada tocou, ao invés
de se espalhar por todo o tubo. No tubo com meio líquido também obtivemos sucesso e
observamos que a bactéria possui flagelos pois turvou bastante o nosso meio de cultura.
➔ PLACA COM MEIO SÓLIDO:
➔ PLACA COM MEIO LÍQUIDO:
➔ TUBO COM MEIO SÓLIDO (ÁGAR INCLINADO):
➔ TUBO COM MEIO SEMI-SÓLIDO:
➔ TUBO COM MEIO LÍQUIDO:
Conclusão
Com a aula prática do dia 22 de março de 2002, podemos concluir que devemos
sempre prestar muita atenção ao manusear o material, pois ele é de fácil contaminação. A
atenção deve ser redobrada também ao flambar as alças e agulhas, para não cometer o
erro de esquentar demais e acabar matando as colônias selecionadas.
Referências
MORALES, Pedro. “Microbiologia: em que consiste, características e utilidade da
coloração de Gram”. Pebmed, 2020. Disponível em:
<https://pebmed.com.br/microbiologia-em-que-consiste-caracteristicas-e-utilidade-da-col
oracao-de-gram/#:~:text=Selecionados%20para%20voc%C3%AA-,Colora%C3%A7%C
3%A3o%20de%20Gra> Acesso em: 24 de março.
NÓBREGA, Francisco. “Introdução à Microbiologia". Microbiologia USP, 2011.
Disponível em:
<https://microbiologia.icb.usp.br/cultura-e-extensao/textos-de-divulgacao/microbiologia-
geral/introd>. Acesso em: 24 de março.