prevalencia_mnt_pacientes_suspeitos_tb

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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS 
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL 
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECIOSAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PREVALÊNCIA DE MICOBACTERIAS NÃO TUBERCULOSAS EM 
PACIENTES SUSPEITOS DE TUBERCULOSE EM UMA UNIDADE DE 
REFERÊNCIA NA AMAZÔNIA BRASILEIRA 
 
 
 
 
 
 
 
ANA CAROLINA DE OLIVEIRA DE LIMA 
 
 
 
 
 
MANAUS 
2017
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ANA CAROLINA DE OLIVEIRA DE LIMA 
 
 
 
 
PREVALÊNCIA DE MICOBACTERIAS NÃO TUBERCULOSAS EM PACIENTES 
SUSPEITOS DE TUBERCULOSE EM UMA UNIDADE DE REFERÊNCIA NA 
AMAZÔNIA BRASILEIRA 
 
 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Medicina Tropical da Universidade 
do Estado do Amazonas em Convênio com a 
Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira 
Dourado, para obtenção grau de Mestre em 
Doenças Tropicais e Infecciosas. 
 
 
 
Orientador: Profº Drº Marcelo Cordeiro dos Santos 
Co-orientador (a): Profª Dra. Maria Lucia Rosa Rossetti 
 
 
 
MANAUS 
2017 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ficha catalográfica 
 
D278p de Lima, Ana Carolina de Oliveira 
Prevalência de Micobactérias não tuberculosas em pacientes suspeitos de Tuberculose 
em uma Unidade de Referência na Amazônia Brasileira: Prevalência de Micobactérias 
não tuberculosas em pacientes suspeitos de Tuberculose em uma Unidade de 
Referência na Amazônia Brasileira / Ana Carolina de Oliveira de Lima. Manaus: [s.n], 
2017. 
114 f.: il.; 297 cm. 
 
Dissertação - PGSS - Doenças Tropicais e Infecciosas (Mestrado) - Universidade do 
Estado do Amazonas, Manaus, 2017. 
Inclui bibliografia 
Orientador: Marcelo Cordeiro dos Santos Coorientador: Maria Lúcia Rosa Rossetti 
 
1. Prevalência. 2. Micobacterias não tuberculosas. 
1. 3. Técnicas moleculares. 4. HIV/AIDS. 5. Região Norte. I. Marcelo Cordeiro 
dos Santos (Orient.). II. Maria Lúcia Rosa Rossetti (Coorient.). III. Universidade 
do Estado do Amazonas. IV. Prevalência de Micobactérias não tuberculosas em 
pacientes suspeitos de Tuberculose em uma Unidade de Referência na 
Amazônia Brasileira 
 
 
Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) 
autor(a). Sistema Integrado de Bibliotecas da Universidade do Estado do Amazonas. 
 
 
 
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FOLHA DE JULGAMENTO 
 
PREVALÊNCIA DE MICOBACTERIAS NÃO TUBERCULOSAS EM 
PACIENTES SUSPEITOS DE TUBERCULOSE EM UMA UNIDADE DE 
REFERÊNCIA NA AMAZÔNIA BRASILEIRA 
 
 
ANA CAROLINA DE OLIVEIRA DE LIMA 
 
 
 
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças 
Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em 
Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de 
Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”. 
 
 
Banca Julgadora: 
 
 
______________________________________ 
Presidente 
 
 
______________________________________ 
Membro 
 
 
______________________________________ 
Membro 
 
 
 
 
 
 
 
DEDICATÓRIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedico este trabalho aos meus familiares e 
amigos que me apoiaram nos momentos 
difíceis, ao meu pai Miquéias Oliveira de Lima 
e irmãos Marcos e Miquéias Júnior, com todo 
meu amor e gratidão pela força e incentivo, por 
tudo que fizeram por mim nessa trajetória. Em 
memória de Anira de Lima, mãe e amiga, 
dedico este trabalho fruto de um sonho nosso 
e com imensa saudade, por todo exemplo de 
superação e amor que me foi passado. 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
Agradeço a Deus pela força e sabedoria concedida para que eu pudesse alcançar essa 
conquista. 
 
À minha família por terem sido alicerce inabalável na trajetória até aqui. 
 
À querida Ms. Rossicléia Lins Monte pelo carinho e pelas instruções dadas para o 
desenvolvimento deste trabalho. 
 
Ao professor Drº Marcelo Cordeiro dos Santos, meu orientador, pelos ensinamentos e pela 
oportunidade de crescimento profissional. 
 
À professora Drª Maria Lúcia Rossetti, minha co-orientadora, que me possibilitou 
aprendizagens únicas, sempre me incentivando. Muito obrigada pela confiança e por acreditar 
em meu potencial. 
 
Ao professor Drº Afrânio Kritski, pela contribuição na construção deste trabalho, incentivo 
e ensinamentos incansáveis 
 
À equipe do laboratório do Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CDCT da 
Fundação de Produção e Pesquisa em Saúde – FEPPS, pelo apoio e ensinamentos 
oferecidos. 
 
À equipe do laboratório da Gerência de Bacteriologia pelos anos que me acolheram me 
disponinilizando conhecimento e maturidade profissional o que me fez chegar até aqui. 
 
À equipe do laboratório da Gerência de Tuberculose e Virologia pelo apoio no 
desenvimento das técnicas laboratoriais necessárias nesse trabalho. 
 
A todos os professores Universidade do Estado do Amazonas/Programa de Pós-
graduação em Medicina Tropical, por todo aprendizado e atenção dispensado no repasse dos 
conhecimentos durante as aulas. 
 
À Fundação de Amparo à pesquisa do Amazonas (FAPEAM) pelo apoio e bolsa de estudo. 
 
Aos membros da secretaria acadêmica da Pós-graduação em Medicina Tropical e a todos 
os funcionários da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, pelo incentivo e 
cordialidade. 
 
Aos colegas da turma de Mestrado ano 2015, por todos os momentos maravilhosos juntos, 
pela sincera amizade durante esta jornada e por todo apoio, em especial às colegas Cynthia 
Pessoa e Maria Francisca Rodrigues. 
 
Muito obrigada! 
 
 
 
 
DECLARAÇÃO DAS AGÊNCIAS FINANCIADORAS 
 
 
O auxílio de passagens aéreas para a participação em treinamentos e capacitações 
necessários para realização das técnicas moleculares foram financiados Universidade 
do Estado do Amazonas (UEA). Os recursos laboratoriais e materiais de consumo 
para execução dos procedimentos foram disponibilizados pelo Centro de 
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CDCT) da Fundação Estadual de 
Produção e Pesquisa em Saúde (FEEPS) e pela empresa bioMérieux Brasil. O projeto 
foi apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) 
por meio de bolsa de estudo, durante os 24 meses de execução do projeto. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
[...] Não importa o quão estreito seja 
o portão e quão repleta de castigos 
seja a sentença, eu sou o dono do 
meu destino, eu sou o capitão da 
minha alma [...] 
Invictus. 
 
 
 
 
 
 
RESUMO 
 
Em países industrializados, com a queda da incidência de tuberculose (TB) ocorreu um 
aumento esporádico dos casos de infecções por micobactérias não tuberculosas (MNT). O 
uso de métodos de detecção laboratorial de MNT baseado em testes moleculares tem sido 
valorizado, pois a ausência de diagnóstico adequado em pacientes suspeitos de infecção 
por micobactérias pode levar ao tratamento inadequado, promover resistência 
medicamentosa, falência terapêutica e o óbito. Em países de alta carga de TB, são 
escassos os dados sobre a prevalência dos casos de infecção por MNT em pacientes 
suspeitos de TB com HIV/AIDS, como na região Norte do Brasil. Estima-se uma 
subnotificação dos casos por se tratar de uma doença sem notificação obrigatória. O 
objetivo desse estudo foi descrever os casos de MNT em pacientes suspeitos de TB 
atendidos na Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), 
referência para HIV/Aids, no período de 2011 a 2014. Dos pacientes atendidos, 758 tiveram 
amostras clínicas positivas para micobactérias, destes 153 (20,2%) foram positivas para 
MNT. A maioria dos pacientes era do sexo masculino (66%), infectados por HIV (77%) em 
uso de terapia antiretroviral (26,7%), com mediana de CD4 de 244 cels/mm3. Entreessas 
amostras foi possível recuperar da criogenia 56 (36,6%) isolados para identificação 
molecular da espécie. A identificação da espécie de MNT foi obtida pelos testes 
GenoType® Mycobacterium CM/AS, PRA hsp65 (PRA) e sequenciamento 
respectivamente em 50 (89,3%), 37 (66%) e em 43 (76,8%) das amostras analisadas. A 
concordância entre a técnica PRA e o GenoType foi de 81%, entre o GenoType e o 
sequenciamento de 76% e entre o PRA e o sequenciamento de 74%. As espécies 
identificadas em maior frequência foram: Mycobacterium gordonae em 17 (30,4%), M. 
fortuitum em 11 (19,6%), M. avium/intracellulare em 10 (17,9%), M. abscessus em 6 
(10,7%) M. kansasii em 3 (5,3%). Entre os 56 pacientes com MNT, 13 (23,2%) receberam 
tratamento inapropriado para TB e foram notificados no SINAN. Óbito foi identificado em 5 
(9%) pacientes. Com base nesses achados, observou-se: a) uma elevada prevalência de 
MNT de importância clínica acometendo em sua maioria pacientes soropositivos; b) que 
cerca de 25% dos pacientes com MNT foram tratados como TB, e c) o kit comercial 
Genotype® Mycobacterium CM/AS detectou a espécie de MNT em 89% das amostras. 
Torna-se urgente a implementação de técnicas moleculares para diagnóstico de MNT em 
pacientes suspeitos de TB atendidos em referência para HIV. 
 
Palavras-Chaves: Prevalência, micobacterias não tuberculosas, tuberculose, técnicas 
moleculares, Região Norte, HIV/AIDS. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
In industrialized countries, with the decline in the incidence of tuberculosis (TB), there has 
been an increase in cases of non-tuberculous mycobacterial (NTM) infections. The use of 
laboratory-based methods of NTM based on molecular tests has been valued, since the 
absence of adequate diagnosis in patients suspected of mycobacterial infection can lead 
to inadequate treatment, promote drug resistance, failure of therapy and death. In 
countries with high TB burden, data on the prevalence of NTM infection in HIV / AIDS TB 
patients are scarce, as in the Northern region of Brazil. It is estimated that underreporting 
of cases is a non-notifiable disease. The objective of this study was to describe cases of 
NTM in patients suspected of TB treated at the Heitor Vieira Dourado Tropical Medicine 
Foundation (FMT-HVD), a reference for HIV / AIDS, from 2011 to 2014. Of the patients 
treated, 758 clinical samples positive for mycobacteria, of these 153 (20.2%) were MNT 
positive. The majority of patients were male (66%), HIV infected (77%) receiving 
antiretroviral therapy (26.7%), with a median CD4 count of 244 cells / mm3. Among these 
samples it was possible to recover from the cryogenic 56 (36.6%) isolates for molecular 
identification of the species. The identification of MNT species was obtained by 
GenoType® Mycobacterium CM / AS, PRA hsp65 (PRA) and sequencing, respectively, in 
50 (89.3%), 37 (66%) and 43 (76.8%) samples analyzed. Agreement between the PRA 
technique and the GenoType was 81%, between the GenoType and the 76% sequencing 
and between the PRA and the 74% sequencing. The species most frequently identified 
were: Mycobacterium gordonae in 17 (30.4%), M. fortuitum in 11 (19.6%), M. avium / 
intracellulare in 10 (17.9%), M. abscessus in 6 (10.7%) M. kansasii in 3 (5.3%). Among the 
56 patients with NTM, 13 (23.2%) received inappropriate treatment for TB and were notified 
at SINAN. Death was identified in 5 (9%) patients. Based on these findings, we observed: 
a) a high prevalence of NTM of clinical importance, most of them being seropositive; b) 
that about 25% of the NTM patients were treated as TB, and c) the Genotype® 
Mycobacterium CM / AS commercial kit detected the MNT species in 89% of the samples. 
It is urgent to implement molecular techniques for the diagnosis of NTM in patients 
suspected of TB seen in reference to HIV. 
 
Keywords: Prevalence, non-tuberculous mycobacteria, tuberculosis, molecular 
techniques, Northern Region, HIV / AIDS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMO LEIGO 
 
 
Em alguns países muitas pessoas adoeceram por micobactérias não tuberculosas (MNT), 
aquelas que não causam a tuberculose (TB), mas os sintomas e o exame são parecidos. 
Para saber mais rápido se a pessoa está realmente doente por elas verifica-se o DNA dessa 
bactéria, mas a falta desse tipo de exame por ser caro e ainda não disponível a todos pode 
levar ao tratamento errado (remédio para o tratamento da tuberculose), a pessoa não curar 
e até mesmo à morte. Nos lugares onde há muita gente doente com tuberculose, são 
poucas as informações sobre as pessoas doentes por MNT, acredita-se que pela falta de 
notificação desses casos como na região Norte do Brasil. O objetivo desse estudo foi 
descrever os casos de MNT em pacientes suspeitos de TB atendidos na Fundação de 
Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), referência para HIV/Aids, no 
período de 2011 a 2014. Foram analisadas 758 amostras positivas para micobactérias, 
destes 153 (20,2%) foram positivas para MNT. A maioria dos pacientes era do sexo 
masculino (66%), infectados por HIV (77%), estavam em tratamento para o HIV (26,7%). 
Desses casos foi possível recuperar do congelamento, 56 (36,6%) amostras para análise. 
A identificação da espécie de MNT foi através da análise do DNA. As espécies identificadas 
em maior frequência foram: Mycobacterium gordonae em 17 (30,4%), M. fortuitum em 11 
(19,6%), M. avium/intracellulare em 10 (17,9%), M. abscessus em 6 (10,7%) M. 
kansasii em 3 (5,3%). Entre os 56 pacientes com MNT, 13 (23,2%) receberam tratamento 
errado e foram notificados no Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN) 
como doentes com tuberculose, 5 (9%) desses pacientes morreram. Torna-se urgente a 
implementação de técnicas moleculares para diagnóstico de MNT em pacientes suspeitos 
de TB atendidos em referência para HIV. 
 
Palavras-Chaves: Prevalência, micobacterias não tuberculosas, tuberculose, técnicas 
moleculares, Região Norte, HIV/AIDS. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1. Baciloscopia – Bacilos em esfregaço de amostra de escarro corado por técnica 
Ziehl-Neelsen ...................................................................................................................16 
Figura 2. Esfregaços de cultura de micobactérias ...........................................................33 
Figura 3. Colônias cepas MNT positivas fotocromógenas, acromógenas e 
escotocromógenas ...........................................................................................................34 
 
Fluxograma 1. Informações de positividade em cultura e identificação laboratorial por 
método convencional (teste fenotípico e bioquímico) no período de 2011 a 2014............58 
Fluxograma 2. Etapas do procedimento laboratorial .........................................................59 
Gráfico 1 Distribuição dos casos de HIV em pacientes suspeitos de TB com amostra 
positiva para MNT..............................................................................................................59 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1. Distribuição de isolados respiratórios de micobactérias não tuberculosas (NTM)..............25 
Tabela 2. Definição de caso de infecção por MNT ...............................................................30 
Tabela 3. Diagnóstico de doença pulmonar por MNT ..........................................................32 
Tabela 4. Classificação das MNT segundo o sistema de Runyon .......................................35 
Tabela 5. Informações sobre os resultados de baciloscopia, Xpert MTB/RIF e testes 
moleculares de identificação de espécie realizados .............................................................60 
Tabela 6. Análise de Kappa entre as técnicas moleculares .................................................60 
Tabela 7. Distribuição das espécies de MNT identificadase sorologia para HIV.................61 
 
Dados complementares 
 
Tabela 1 Características basais dos indivíduos com isolados positivos para MNT .............62 
Tabela 2 Informação sobre tratamento anti-TB e MNT ........................................................62 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA 
 
AIDS – Síndrome da imunodeficiência humana adquirida 
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária 
BCG - Bacillus Calmette-Guérin 
BAAR – Bacilo álcool-ácido resistente 
CTAB – Brometo de cetrimônio 
DPOC - Doença pulmonar crônica 
DNA - Ácido desoxirribonucleico 
EUA - Estados Unidos 
HIV - Vírus da imunodeficiência humana 
LJ - Lowenstein Jensen 
LACEN - Laboratório Central de Saúde Pública 
MgCl2 – Cloreto de magnésio 
MNT - Micobactérias não causadoras de tuberculose 
M.tb - Mycobacterium tuberculosis 
MCR -Micobactérias de crescimento rápido 
MCL - Micobactérias crescimento lento 
OMS - Organização Mundial de Saúde 
PPD - Prova tuberculínica 
PCR – Reação da cadeia da polimerase 
PRA-hsp65 – Análise de restrição da reação em cadeia da polimerase do gene hsp65 
PCT - Programa de Controle da Tuberculose 
PNB - Ácidop-nitrobenzóico 
PAS - Ácido p-aminosalicílico 
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism 
RIF - Rifampicina 
SINAN - Sistema de Informação de Agravos de Notificação 
SVS - Secretaria de Vigilância em Saúde 
TB – Tuberculose 
TB/HIV – Coinfecção TB/HIV 
TB-XDR - Tuberculose extensivamente resistente 
ZN - Ziehl-Neelsen 
μm - Micrometro 
mol – Molaridade/mole 
mm³ - Milímetro cúbico 
mL - Microlitro 
pmol - Picomol 
u – Unidade de massa atômica 
pb – Pares de base 
mM – Milimol 
μl - Microlitro 
iii 
 
 
SUMÁRIO 
 
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 16 
1.1. Classificação do gênero Mycobacterium........................................................... 16 
1.2. Relação clínica entre as Micobactérias e o HIV/AIDS.......................................17 
1.3. História e evolução das Micobactérias não tuberculosas .................................18 
1.4. Doença causada pelas Micobactérias não tuberculosas (MNT) ....................... 19 
1.5. Transmissão e formas clínicas da doença por MNT .......................................... 21 
1.6. Epidemiologia das micobactérias não tuberculosas ........................................ .23 
1.6.1. Dados mundiais .......................................................................................... 23 
1.6.2. Dados da América Latina e Brasil ............................................................... 25 
1.6.3. Dados da região Norte do Brasil ................................................................. 27 
1.7. Diagnóstico clínico e epidemiológico das MNT ................................................ 29 
1.8. Diagnóstico laboratorial das MNT .................................................................... 30 
1.8.1. Separação das espécies do Complexo M. tuberculosis das micobactérias 
não causadoras de tuberculose (MNT): .................................................................... 32 
1.8.2. Identificação fenotípica das espécies de MNT: ........................................... 33 
1.8.3. Identificação genotípica das MNT: ............................................................ 35 
 
2. OBJETIVO.............................................................................................................39 
2.1. Geral:................................................................................................................ 39 
2.2. Específicos: .......................................................................................................39 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS. ............................................................................... 40 
3.1. Modelo e período de estudo: ............................................................................ 40 
3.2. Amostras clínicas: ............................................................................................ 40 
3.3. População de referência: .................................................................................. 40 
3.4. Critérios de elegibilidade: ................................................................................. 41 
3.5. Definições para confirmação laboratorial dos casos de Micobactéria não 
tuberculosa: ............................................................................................................. 41 
3.6. Critérios de não inclusão: ................................................................................. 41 
3.7. Procedimento laboratorial: ................................................................................ 42 
3.7.1 Identificação fenotípica:................................................................................ 42 
3.7.2. Identificação genotípica:.............................................................................. 42 
3.8. Coleta e análise de dados ................................................................................. 44 
3.9. Considerações éticas: ....................................................................................... 45 
4. RESULTADOS .....................................................................................................45 
5. DISCUSSÃO .........................................................................................................62 
6. CONCLUSÃO .......................................................................................................63 
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................ .................................................. 65 
APÊNDICE.................................................................................................................71 
Apêndice A - Equipe...................................................................................................72 
Apêndice B - Cronograma..........................................................................................73 
Apêndice C - Orçamento............................................................................................74 
Apêndice D – Procedimento operacional para extração de DNA de Micobactérianão 
tuberculosa por CTAB.................................................................................................76 
15 
 
 
Apêndice E - Procedimento operacional padrão para o congelamento e recuperação 
de cepa de Micobactéria não tuberculosa ............................................................. ..79 
Apêndice F - Procedimento operacional padrão para a identificação fenotípica das 
Micobactérias não tuberculosas por tempo de crescimento e pigmentação ........... 82 
Apêndice G - Procedimento operacional padrão para inativação e extração de DNA 
por termobloco de Micobactéria não tuberculosa .................................................... 86 
Apêndice H - Procedimento operacional padrão para identificação molecular pelo 
método PRA-hsp65 ..................................................................................................88 
Apêndice I - Procedimento operacional para técnica de purificação de DNA para 
sequenciamento utilizando PED 8000/ 2,5 M NaCl ................................................. 95 
Apêndice J – Procedimento operacional padrão para teste de genética molecular para 
identificação a partir de material de cultura de espécies de Micobactérias (GenoType 
Mycobacterium CM/AS) .......................................................................................... 97 
 
ANEXO ...................................................................................................................103 
Anexo A - Parecer consubstanciado do CEP.........................................................104 
Anexo B - Modelo da ficha de notificação da Tuberculose ...................................105Anexo C - Termo de Dispensa do Consentimento Livre e Esclarecido (TDCLE) 
.................................................................................................................................106 
Anexo D - Termo de Compromisso de Utilização de Dados (TCUD) .....................107 
Anexo E - Carta de Anuência .................................................................................108 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
16 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
1.1. Classificação do gênero Mycobacterium 
 
As micobactérias são classificadas no gênero Mycobacterium com base na sua 
característica ácido resistente, na presença de ácidos micólicos e no alto conteúdo de 
guanina e citosina no seu DNA. Sua característica álcool-ácido resistente é 
visualizada por meio da técnica de coloração Ziehl-Neelsen (ZN), onde um esfregaço 
da amostra biológica em lâmina é confeccionado, corado e visualizado em 
microscópio óptico (Figura 1) (1,2). 
 
Figura 1: Baciloscopia – Bacilos em esfregaço de amostra de escarro corado por técnica Ziehl-
Neelsen. 
Fonte: Gerencia de Tuberculose – FMT/HVD. 
 
Taxonomicamente, pertencem à família Mycobacteriaceae, ordem 
Actinomycetales, subordem Corynebacterineae, classe e filo Actinobacteria. É 
composto por 165 espécies divididas em três grupos: Mycobacterium leprae; 
micobactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis e outras que não pertencem 
a esse complexo, denominadas micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT) 
(1,25). O gênero Mycobacterium também é classificado de acordo com sua 
capacidade de produzir doença no homem ou grupo de risco, como raramente 
patogênicas, potencialmente patogênicas e patogênicas. 
 
 
17 
 
 
1.2. Relação clínica entre as Micobactérias e o HIV/AIDS 
 
As espécies de micobactérias que apresentam elevada importância clínica por 
causar doença pulmonar, extrapulmonar e disseminada são as pertencentes ao 
complexo Mycobaterium tuberculosis e as MNT (2). Ambas apresentam alta 
relevância clínica, conferem ao hospedeiro infecção potencialmente grave, possuem 
diagnóstico clínico e laboratorial semelhantes e apresentam mecanismos de 
transmissão e tratamento distintos (17). 
 
Segundo dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) cerca de 10,4 milhões 
de pessoas tiveram tuberculose em 2016, cerca de 1,2 milhões de pessoas 
apresentam coinfecção TB/HIV e 1 milhão morreram por conta da doença. No ano de 
2016, foram diagnosticados e registrados 66.796 casos novos de tuberculose no Brasil 
com coeficiente de incidência de 32,4/100.000 habitantes. O Estado do Amazonas 
registrou coeficiente de incidência de 67,2/100.000 hab. e ultrapassando o Amazonas, 
a capital Manaus apresentou coeficiente de incidência de 93,2/100.000 hab. chegando 
a ultrapassar os valores regionais e nacionais para o mesmo período. Os resultados 
de testagem para HIV entre os casos novos de TB no Brasil, apontaram para a 
existência de 9,7% de pessoas com a coinfecção TB-HIV. Cerca de 73,2% dos casos 
novos de tuberculose realizaram testagem para o HIV no Brasil, seguido do Amazonas 
com 68,8% e em Manaus com 71,8% (89). 
 
O HIV continua sendo um grande problema de saúde pública mundial, em 2016 
foram registrados 2,1 milhões de novas infecções. No Brasil, neste ano, estima-se que 
tenham ocorrido 48.000 [35.000 – 64.000] novas infecções por HIV, com prevalência 
de 0,4% a 0,7% em pessoas de 15 a 49 anos – em 2014 (97). 
 
De 2007 até junho de 2016, foram notificados no SINAN 6.868 casos de infecção 
por HIV na Região Norte (6,3%). A taxa de detecção de HIV/AIDS na Região Norte 
do Brasil tem apresentado uma tendência linear de crescimento significativo; em 2006 
a taxa registrada foi de 15,0 casos para cada 100 mil habitantes, enquanto que no 
último ano a taxa foi de 24,0 representando um aumento de 61,4% (98). 
 
Isoladamente, as infecções por TB e HIV são as principais causas de mortes por 
18 
 
 
doenças infecciosas. A TB é responsável por um terço das mortes relacionadas com 
o HIV/AIDS a cada ano (24). 
 
Até o surgimento da HIV/AIDS não se atribuia grande importância às infecções 
por MNT, os relatos de doenças pulmonares causadas por esse grupo eram 
esporádicos (28). Em países industrializados, com uma alta carga de TB, onde o foco 
tem sido a realização apenas da baciloscopia, a prevalência de MNT em sujeitos com 
HIV permanece desconhecida, é relatada a baixa realização de cultura para 
micobactéria na rotina e a dificuldade na elucidação devido a coinfecção MNT/TB, 
com isso é frequente o uso do tratamento de probabilidade (empírico, sem 
confirmação), e portanto, uma proporção desconhecida de pacientes podem, de fato, 
estar infectada com MNT. Mesmo com a introdução do Xpert MTB Rif a partir de 2014, 
nos resultados positivos, confirma-se TB, mas nos resultados negativos não se afasta 
a ocorrência de MNT (67). 
 
O impacto das MNT na morbidade e mortalidade dos doentes com HIV/AIDS, 
estimulou o início de estudos relacionados à epidemiologia, ecologia, genética, 
biologia molecular e fisiologia das MNT. Além, disso a rápida ascensão das doenças 
provocadas pelas MNT estimulou o desenvolvimento de métodos rápidos para o seu 
isolamento e identificação (72). 
 
1.3. História e evolução das Micobactérias não tuberculosas 
 
Estudos revelam que a doença por micobactéria acomete a população humana há 
milhares de anos, sendo as primeiras evidências referem-se ao estudo de 44 múmias 
egípcias de faraós jovens, datando de 3.700 a 1.000 A.C. (31). A primeira descrição 
das micobactérias causando doença no homem ocorreu em 1873, quando o físico 
norueguês Gerhard Armauer Hansen descreveu alguns “corpos em forma de hastes” 
a partir de biópsia de paciente com hanseníase (32). 
 
 A maioria das espécies de MNT foi descrita no século passado. A designação de 
micobactérias “atípicas” foi utilizada pela primeira vez por Pinner, em 1935, referindo-
se às características distintas que apresentavam em relação ao complexo M. tb e a 
19 
 
 
M. leprae, em particular ao fato de não serem agentes patogênicos obrigatórios e de 
se encontrarem habitualmente no meio ambiente (17). 
 
No Brasil, a importância clínica das MNT foi reconhecida na década de 1938 
quando Costa Cruz descreveu o primeiro caso de M. fortuitum isolado de um abscesso 
cutâneo (29). Após uma década, MacCallum descreveu uma doença de pele causada 
por uma nova espécie de micobactéria, classificada mais tarde como M. ulcerans. Em 
1949, Cuttino e McCabe descreveram um novo microrganismo causando infecção 
disseminada em uma criança, logo nomearam como ″Nocardia intracellularis”, porém 
mais tarde foi classificada como M. intracellulare por Runyon (30). 
 
Em 1951, Norden e Linell descreveram “Mycobacterium balnei″ presente em 
granuloma, posteriormente reconhecido como M. marinum (29). O termo 
“micobactérias não tuberculosas” foi utilizado pela primeira vez em 1954 por Timpe e 
Runyon para identificar e diferenciar todas as micobactérias não pertencentes ao 
complexo M. tuberculosis e M. leprae (30). Com o avanço dos métodos e técnicas de 
identificação, muitas outras espécies de micobactérias foram descobertas e 
classificadas. 
 
1.4. Doença causada pelas Micobactérias não tuberculosas (MNT) 
 
Os mais importantes complexos de espécies de MNT causadoras de doença no 
homem são: o complexo M. avium (MAC), o complexo M. fortuitum, complexo M. 
celatum, complexo M. abscessus, complexo M. kansasii, complexo M. terrae, 
complexo M. simiae e o complexo M. smegmatis (25,37). 
 
Complexo MAC: É composto por espécies capazes de causar doenças em animais 
e seres humanos, incluem as espécies M. avium, M. intracellulare, M. colombiense, 
M. chimaera, M. yongonense (101). Nos hospedeiros imunocompetentes, o MAC afeta 
os pulmões em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), podendo 
causar fibrose pulmonar ou doença pulmonarcavitária (DPC). Em hospedeiros 
imunodeprimidos, no caso do HIV/AIDS, pode originar infecção sistêmica, causando 
sobretudo doença disseminada. A espécie M. avium normalmente é isolado de 
20 
 
 
ambientes como água potável, que se acredita ser uma fonte de infecção para os 
doentes soropositivos para HIV (37,38). 
 
Complexo M. fortuitum: O complexo M. fortuitum compreende as espécies M. 
fortuitum, M. peregrinum, M. mageritense (101). Essas espécies são de crescimento 
rápido, geralmente habitam o solo, poeira e água. A identificação dessas 
micobactérias é importante para estabelecer a terapêutica adequada, visto que 
possuem diferentes padrões de resistência aos farmacos. As doenças causadas por 
essas espécies incluem raramente as formas pulmonares (56). 
 
Complexo M. abscessus: O complexo M. abscessus é constituído por três espécies: 
M. chelonae, M. abscessus e M. immunogenum (101). São frequentemente 
resistentes a fluorquinolonas, sulfametoxazol, doxiciclina e sensíveis a claritromicina, 
amicacina, tigeciclina e imipenem. Em 2001, M. immunogenum foi descrita e isolada 
pela primeira vez de fluídos utilizados para a lubrificação e arrefecimento de máquinas 
industriais (41). Causa doença pulmonar em indivíduos com comprometimento 
pulmonar prévio como TB anterior e fibrose cística além de causar infecções pós-
operatórias e pós-procedimentos causando doenças de pele e tecidos moles, 
infecções do sistema nervoso central, bacteremia e infecções oculares (42). 
 
Complexo M. terrae: O complexo M. terrae é composto pelas espécies M. terrae, 
M. nonchromogenicum, M. hiberniae, M. sinense, M. senuense, M. engbaekii (101). A 
colonização do epitélio humano por estas micobactérias é rara e geralmente são 
consideradas como não patogênicas, no entanto em casos de imunossupressão, M. 
nonchromogenicum pode ocasionalmente causar doença no homem, tais como 
infecções pulmonares e tendinopatia. Nos últimos anos um número crescente de 
infecções causadas por estes organismos foi associado à coinfecção com HIV/AIDS 
(48). 
 
Complexo M. kansasii: O complexo M. kansasii inclui as espécies M. gastrii e M. 
kansasii (101). O M. kansasii é uma micobactéria não tuberculosa que pode causar 
colonização ou doença pulmonar (100). 
 
21 
 
 
Complexo M. simiae: O complexo M. simiae é composto por várias espécies 
filogeneticamente relacionadas, as quais incluem: M. interjectum, M. florentinum, M. 
sherrisii, M. triplex, M. palustre, M. bohemicum, M. nebraskense, M. europaeum (101). 
Este complexo pode apresentar manifestações clínicas e imagens pulmonar no 
radiograma torácico semelhantes ao da TB e resistência aos fármacos anti-TB 
associada a indivíduos com TB anterior (99). 
 
1.5. Transmissão e formas clínicas da doença por MNT 
 
Existem poucos relatos sobre a transmissão direta de pessoa para pessoa, por 
meio de tosse ou espirro. Há relatos de infecção adquirida a partir do meio ambiente, 
pela ingestão ou inalação de água e por meio de inoculação provocada pela 
inadequada desinfecção e manuseio de equipamentos médicos em procedimentos 
cirúrgicos, vacinação e videocirurgias (6). Procedimentos invasivos como acupuntura, 
tatuagens e piercings também são relatados como possíveis focos de transmissão 
(33). Por meio da análise de DNA verificou-se que estripes de várias espécies 
recuperadas a partir de amostras ambientais de água, solo e aerossóis, eram idênticas 
às isoladas de vários doentes (22). 
 
Indivíduos com doenças cardiovasculares, hepatite C, HIV/AIDS, transplantes, 
diabetes, alterações estruturais pulmonares como a Doença pulmonar obstrutiva 
crônica (DPOC), câncer, imunossupreção genética, artrite reumatóide e doença do 
refluxo gastroesofágico (DRGE) apresentam predisposição a desenvolver infecção 
por MNT. As manifestações clínicas da infecção por MNT compreendem as formas 
pulmonar, extrapulmonar e disseminada, pois acomete pele, órgãos, trato respiratório, 
sangue, medula e ossos (68). 
 
Forma pulmonar: A partir dos anos 80, começaram a surgir relatos de grandes 
séries de doenças pulmonares causadas por MNT, em sua maioria associada à 
imunossupressão (28). A infecção pulmonar por MNT, foi descrita pela primeira vez 
em fumantes idosos do sexo masculino com alterações estruturais pulmonares 
(doença pulmonar cavitária ou enfisema). A DPOC, a bronquiectasia, o enfisema, a 
pneumoconiose, a tuberculose anterior, a silicose, a proteinose alveolar pulmonar e a 
deficiência de α-1-antitripsina são alguns dos principais determinantes do 
22 
 
 
desenvolvimento de infecção pulmonar por MNT no início da fase adulta. Embora a 
fibrose cística, causada por mutações no regulador da condutância 
transmembrana na fibrose cística (CFTR) e a discinesia ciliar primária (doença 
autossômica recessiva), geralmente presentes na infância ou adolescência, também 
causem susceptibilidade, nos casos de alguns pacientes com mutações hipomórficas 
as infecções podem ter apresentação tardia ou atípica (8,69). Os casos da doença 
pulmonar por MNT em imunocompetentes estão em sua maioria associados ao 
trabalho em condições de constante exposição a poeira. Nestas situações clínicas, as 
características da doença pulmonar por MNT é muito semelhante as da TB (36). 
 
Existem casos onde ocorre a repressão habitual da tosse favorecendo o 
desenvolvimento de infecção pulmonar por MNT, esses casos são associados a 
doenças neuromusculares, sequelas de acidente vascular cerebral e a síndrome de 
Lady Windermere. Essa síndrome ocorre principalmente em mulheres, não-fumantes 
e na pós-menopausa, sem qualquer fator predisponentes conhecido, as pacientes, 
tendem a apresentar escoliose, depressão do esterno, costelas na frente do tórax 
(Pectus Excavatum) e prolapso da válvula mitral (9). O lobo médio e língula estão 
predispostos a inflamação crônica por causa de suas estruturas anatômicas 
específicas e incapacidade para limpar as secreções das vias respiratórias devido à 
supressão da tosse, predispondo a bronquiectasia e infecção (8, 70). 
 
Forma extrapulmonar: Em indivíduos adultos e imunocompetentes, as infecções 
causadas pelas MNT na pele, articulações, tendões e nos ossos estão 
frequentemente associadas com traumatismos e feridas cirúrgica (73, 30). Em 
crianças, os locais de infecção mais frequentes são a pele e os nódulos linfáticos. As 
infecções causadas por M. haemophilum ou M. chelonae são geralmente 
caracterizadas por nódulos subcutâneos ou abcessos. 
 
Forma disseminada: Em doentes soropositivos para HIV, a doença provocada 
pelas MNT é geralmente disseminada (71). Nos casos de pacientes soronegativos 
para HIV, déficit na resposta celular Th1 associados a defeitos imuno genéticos, como 
mutações autossômicas das interleucinas (IL), interferon (IFN) e seus receptores 
específicos (IL12, IL12RB1, ISG15, IFNGR1, IFNGR2, STAT1 e IRF8), mutações no 
cromossomo X (IKBKG e CYBβ), deficiência GATA2 e auto-anticorpos anti-IFN-γ, 
23 
 
 
predispõem susceptibilidade, tanto na infância quanto na idade adulta, levando a óbito 
quando não tratada precocemente e/ou de maneira correta (8). 
 
 
1.6. Epidemiologia das micobactérias não tuberculosas 
1.6.1. Dados mundiais 
 
A frequência das descrições dos casos de infecções por MNT vem aumentando 
juntamente com o declínio significativo da taxa de incidência de TB em países 
industrializados. Em contraste com o M. tuberculosis, cuja notificação é obrigatória no 
mundo, as infecções por MNT ainda não geram notificação, fora os casos de MNT pós 
cirúrgia. A ausência de vigilância epidemiológica resulta na escasses de dados sobre 
a sua incidência, prevalência incidência, morbi/mortalidade, e os fatores associados 
(52). Os sintomas gerais causados pelas MNT não podem ser distinguidos de 
sintomas observados em casos de TB, e as aparências das bactérias não podem ser 
diferenciadas quando examinadas por microscopia de luz (78). Portanto,há consenso 
entre os autores de que é fundamental o diagnóstico laboratorial das MNT, pois a 
sintomatologia, imagens no radiograma torácico e resultados da baciloscopia não 
permite dinstingui-las de infecção por TB. 
 
A não realização de cultura para micobactéria ou a não identificação das espécies 
de micobactéria nos exames de cultura positiva para micobactéria podem levar a 
resultados falso-positivos para diagnóstico de TB e tratamento medicamentoso 
inadequado para o controle micobacteriano (77). 
 
Na detecção das espécies pertencentes às MNT, um estudo na Ásia, revelou que 
MAC foi a principal causa de infecção pulmonar, correspondendo à 68% dos casos 
(50). Em 2002, avaliando a prevalência de doença pulmonar por MNT no mundo, foi 
observado uma predominância de MAC entre os agentes causadores de doença 
pulmonar também na Ásia (51). 
 
A infecção pulmonar por MNT pode estar associada à mortalidade em Unidades 
de Terapia Intensiva (UTI), o tratamento anti-MNT é a solução adequada para 
melhores resultados de terapia. Em um estudo retrospectivo na UTI de um centro 
24 
 
 
médico em Taiwan, de janeiro de 1999 a junho de 2007, foi descrito que as infecções 
pulmonares por MNT estavam relacionadas, em sua maioria, as espécies do 
complexo M. avium e M. abscessus. A proporção de mortalidade em 5 anos foi em 
torno de 34-69% (53). 
 
 Numa revisão sistemática e meta- análise realizada em 2015, foi relatada uma 
prevalência relativamente alta de infecções por MNT (10,2%) entre os casos positivos 
para TB, isso demonstrou a necessidade de uma maior aplicação de estratégias de 
controle da infecção, estabelecimento de critérios de diagnóstico apropriados e 
diretrizes para o manuseio de doenças por MNT além de expandir a qualidade dos 
laboratórios de referência regionais facilitando mais a prevenção e controle dessas 
infecções (3). 
 
Num estudo mais recente, com a colaboração mundial de 62 laboratórios, realizado 
pelo MNT-Network European TrialsGroup (MNT-NET) junto ao Tuberculosis Network 
European TrialsGroup (TB-NET) avaliou-se em 30 países e em 6 continentes (Europa, 
Ásia, América do Norte, América do Sul, África do Sul e Austrália) 20.182 pacientes 
positivos para MNT, cultivadas em meio de cultura sólido provenientes de amostras 
respiratórias de escarro. Nesse estudo os membros do complexo MAC predominaram 
na maioria das regiões embora M. xenopi na Hungria e M. kansasii na Polônia e na 
Eslováquia. A distribuição relativa dos membros do complexo MAC revelou diferenças 
geográficas, enquanto M. avium predominava nos centros da América do Norte, 
América do Sul e na Europa, M intracellulare foi frequentemente isolada na África do 
Sul e Austrália. Na América do Sul o complexo MAC correspondeu a 31% dos 
isolados, seguido de M. abscessus e M. fortuitum com 16%, M. kansasii foi a segunda 
espécie mais isolada na América do Sul e M. gordonae a terceira mais isolada (Tabela 
1). 
 
 
 
 
 
 
 
25 
 
 
Tabela 1. Distribuição de isolados respiratórios de micobactérias não tuberculosas (NTM). 
 
Distribuição de MNT Distribuição de MAC 
Europa MAC (37%), MCR (16%), M. gordonae 
(17%), M. kansasii (5%), M. xenopi (14%), 
M. malmoense (1%), MCL (10%) 
M. avium (47%), complexo M. 
avium (22%), M. intracellulare 
(8%). 
América 
do Norte 
MAC (52%), MCR (20%), M. xenopi (12%), 
M. gordonae (12%), MCL (3%), M. kansasii 
(1%). 
M. avium (78%), complexo M. 
avium (14%), M. intracellulare 
(8%). 
América 
do Sul 
MAC (31%), MCR (21%), M. kansasii 
(20%), M. gordonae (17%), MCL (11%). 
M. avium (64%), complexo M. 
avium (23%), M. intracellulare 
(13%). 
Autrália MAC (71%), MCR (15%), MCL (8%), M. 
kansasii (4%), M. gordonae (1%). 
M. intracellulare (80%), M. 
avium (20%). 
Ásia MAC (54%), MCR (31%), MCL (6%), M. 
gordonae (6%), M. kansasii (3%). 
M. avium (45%), complexo M. 
avium (39%), M. intracellulare 
(16%). 
África do 
Sul 
MAC (50%), MCL (33%), MCR (7%), M. 
gordonae (5%), M. kansasii (3%), M. xenopi 
(1%). 
M. intracellulare (77%), M. 
avium (21%), complexo M. 
avium (2%). 
Total MAC (47%), MCR (16%), MCL (14%), M. 
gordonae (11%), M. xenopi (8%), M. 
kansasii (3%), M. malmoense (1%). 
M. avium (47%), M. 
intracellulare (38%), complexo 
M. avium (15%). 
*MCR: micobactérias de crescimento rápido; MCL: micobactérias de crescimento lento. 
Fonte: MNT-Network European TrialsGroup (MNT-NET). 
 
A distribuição das espécies de MNT em um país pode ter profundo impacto sobre 
as frequências e manifestações da doença pulmonar por MNT em cada região sendo 
necessários estudos futuros para abordar os diferentes nichos ambientais específicos 
de cada espécie (96). 
 
1.6.2. Dados da América Latina e Brasil 
 
Na prática clínica diária é observado um número crescente de cirurgias cosméticas 
realizadas principalmente na América Latina e Caribe associado com o aumento no 
número de casos de infecções por MNT (55). Houve relatos de focos de infecções por 
26 
 
 
M. abscessus em feridas cirúrgicas resultantes de procedimentos de abdominoplastia 
na República Dominicana e Colômbia (54). O envolvimento da espécie M. fortuitum 
em infecções de sítio cirúrgico é bem documentado, pode ocorrer em ferida esternal 
após cirurgia cardiotorácica ou após cirurgia de aumento de mama devido a 
contaminação da ferida com água da torneira contaminada, no ato do banho (56,57). 
Recentemente tem sido descrito infecções por MNT em idosos após uso da banheira 
“escalda-pés” em salões de manicure e pedicure (58,59). 
 
Na América Latina,um estudo realizado em 2014 em um hospital na Colombia, 
descreveu a prevalência dos casos de MNT em 9,1%, onde o principal fator de risco 
foi a infecção pelo HIV sendo a forma clínica pulmonar a mais predominante (56,6%) 
(52). 
 
No Brasil são escassos os casos publicados de infecções por MNT, as 
publicações em sua maioria referen-se a ceratite por M. chelonae, após cirurgia para 
correção de miopia, infecções cutâneas por M. abscessus e M. fortuitum após 
aplicações em mesoterapia ou cirurgia plástica e publicações sobre o risco crescente 
de infecções por essas espécies de micobactérias em pacientes submetidos a 
procedimentos médicos invasivos. Em razão da não obrigatoriedade da notificação, 
estima-se que no Brasil ocorra subnotificação de MNT associada às cirurgias (33). 
 
No Estado do Rio de Janeiro, entre 1993 e 2011 as espécies de MNT mais foram 
M. kansassi (33,9%) e complexo MAC (30,4%) destes 9,8% eram soropositivos para 
o HIV (61). Em um estudo no estado de São Paulo, foram estudadas 1.892 cepas de 
MNT entre os anos de 1991 a 1997, desse estudo foi possível estabelecer as 
manifestações clínicas ocorridas naquele período, 48% foram de origem pulmonar, 
29,3% sangue e medula óssea e 15,8% de outras formas extrapulmonares, a 
associação desses casos com o HIV não foi descratada (28). 
 
Segundo dados da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), no período 
de 1998 a 2009,foram notificados cerca de 2.520 casos de infecção por micobactérias 
de crescimento rápido (MCR), sendo 1.107 casos relatados no estado do Rio de 
Janeiro, 363 no Espírito Santo, 327 no Pará,193 em São Paulo,149 no Paraná,115 no 
Rio Grande do Sul, 95 em Goiás, 50 no Mato Grosso, 33 no Distrito Federal,31 em 
27 
 
 
Minas Gerais,11 no Piauí,11 na Bahia, 9 no Ceará,6 em Santa Catarina, 5 em Sergipe, 
5 em Pernambuco, 3 em Alagoas, 2 no Tocantins, 1 em Roraima, 1 no Rio Grande do 
Norte, 1 na Paraíba, 1 no Amazonas e1 no Acre (6,63). 
 
Entre as micobactérias de crescimento rápido o agente etiológico prevalente na 
maioria das cidades brasileiras foi a M. massiliense, exceto nas infecções secundárias 
a mamoplastias, nas quais a maior prevalência foi de M. fortuitum. Outras espécies 
de MCR foram identificadas: M. abscessus, M. bolletii, M. chelonae, M. smegmatis e 
M. wolinskyi (62,63). Mesmo com o número elevado de casos notificadosde infecção 
por MCR, entre as espécies potencialmente patogênicas, as micobactérias de 
crescimento lento (MCL) pertencentes ao complexo MAC e M. kansasii são as mais 
comumente isoladas no Brasil, ambas causam principalmente infecção pulmonar (63). 
 
1.6.3. Dados da região Norte do Brasil 
 
Um estudo realizado na Região Norte do Brasil, mais precisamente no estado de 
Roraima, avaliou no período de dois anos, 1.812 casos suspeitos de TB pulmonar. 
Nesse estudo foi possível identificar causando doença pulmonar 369 (20%) casos 
positivos para TB e 75 (4%) casos positivos para MNT. Dentro do último grupo foi 
possível identificar 14 espécies por meio de métodos de diagnóstico molecular: M. 
abscessus, M. avium, M. fortuitum, M. intracellulare, M. gilvum, M. gordonae, M. 
asiaticum, M. tusciae, M. porcinum, M. novocastrense, M. simiae, M. szulgai, M. phlei 
e M. holsaticum. Nesse estudo 13 isolados não puderam ser identificados a nível de 
espécie devido as limitações de reprodutibilidade que o método de cultura sólida 
impõe (65). 
 
No Estado do Pará, em dados coletados nos anos de 1999 a 2010, observou-se 
que a espécie predominante nas formas clínicas pulmonares foi a M. massiliense. No 
período de janeiro de 2010 a dezembro de 2011, M. massiliense foi novamente a 
espécie mais encontrada, com 44,8% dos casos (66). 
 
Em 2013, outro estudo, realizado em Belém do Pará, 64,2% dos pacientes que 
manifestaram doença por MNT tinham acesso a um abastecimento de água por meio 
de sistemas de tubulações. Esta informação é importante porque, mesmo em zona 
28 
 
 
urbana, o abastecimento de água ainda é precário, cerca de 75% dos lares tem acesso 
a um abastecimento de água, sendo menor a cobertura em áreas urbanas periféricas, 
de acordo com o Censo Brasil 2010 (67). 
 
Na cidade de Manaus, em 2009, num outro estudo investigou-se a presença de 
MNT em águas de torneira, soluções e luvas cirúrgicas, utilizadas nas etapas dos 
procedimentos cirúrgicos executados no centro cirúrgico do Hospital Universitário 
Getúlio Vargas (HUGV). Foram coletadas e analisadas 105 amostras sendo: 24 de 
águas (coletadas das 2 torneiras existentes no centro cirúrgico), 8 de solução de 
povidine e 7 de solução de clorhexidina, que servem para a higienização das mãos 
dos cirurgiões; 39 de luvas cirúrgicas (superfícies internas e externas); e 27 de 
soluções que foram efetivamente utilizadas durante o ato cirúrgico. Obteve-se 41 
isolados micobacterianos apenas de águas das torneiras. O não isolamento de MNT 
nas soluções utilizadas para higienização das mãos e luvas dos cirurgiões bem como 
nos procedimentos cirúrgicos, indica que essas soluções têm sido eficazes na 
eliminação de micobactérias. Entretanto, a presença de M. mucogenicum nas águas 
das torneiras do centro cirúrgico, espécie já associada a surtos pós-cirúrgicos, indica 
que devem ser efetuados procedimentos de limpeza e monitoramento em todos os 
pontos de distribuição de águas, visando à prevenção de surtos de micobacterioses 
nosocomiais (91). 
 
Na Região Amazônica, a predominância de pessoas da cor parda está 
relacionada a alta heterogenia, essa diversidade genética pode estar associada ao 
aumento da susceptibilidade a desenvolver infecção por MNT, porém são necessários 
mais estudos para comprovação. Sabe-se que pescadores e outras pessoas expostas 
aos peixes estão em risco de desenvolver infecções de pele causadas por M. 
marinum. Em crianças de 18 meses a 5 anos de idade o risco de desenvolver 
linfadenite cervical por M. avium está associado a exposição a viveiros de aves. A 
imunodeficiência, também é um fator de risco para a população dessa região, devido 
à infecção pelo HIV ou imunossupressão nos casos de câncer e quimioterapia (67). 
 
 
 
29 
 
 
1.7. Diagnóstico clínico e epidemiológico das MNT 
 
Os sintomas da doença pulmonar por MNT são variáveis e não específicos em 
alguns casos, nos quais o diagnóstico laboratorial não pode ser realizado, o médico 
pode confirmar o caso pelo critério clínico-epidemiológico. No entanto, praticamente 
todos os pacientes tem tosse crônica ou recorrente como na TB. Outros sintomas 
incluem tosse com expectoração, fadiga, mal-estar, dispneia, febre, hemoptise, dor no 
peito e perda de peso. Nesses casos o curso da doença é progressivo, causando 
sintomas persistentes, declínio da função pulmonar e uma piora na qualidade de vida. 
Além disso, pode também seguir um curso fulminante com insuficiência respiratória 
aguda (64). 
 
O estabelecimento de um diagnóstico de doença por MNT não é simples, o seu 
isolamento em amostras pulmonares e extrapulmonares não é por si só, diagnóstico 
de doença, devido contaminação transitória, exigindo o cumprimento dos critérios 
clínicos e microbiológicos, tais como a presença de sintomas clínicos, evidência 
radiográfica de lesões compatíveis com doença para as definições de caso sejam 
feitas. Na tabela 2 estão descritos os critérios de patogenicidade das MNT de 
crescimento rápido proposto pela ANVISA (63,74). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
30 
 
 
Tabela 2. Definição de caso de infecção por MNT: 
Suspeito Possível Provável Confirmado 
Paciente 
submetido a 
procedimentos 
invasivos que 
apresente dois 
ou mais sinais 
referidos como 
clínica 
compatívele 
achados 
radiológicos. 
Paciente que preenche os 
critérios de caso suspeito, 
mas sem investigação 
laboratorial, e que 
respondeu ao tratamento 
específico para 
micobactérias. 
Paciente que 
preenche os 
critérios de caso 
suspeito, que 
apresente 
manifestações 
clínicas 
compatíveis com 
baciloscopia 
positiva, mas 
cultura negativa 
para micobactéria. 
Paciente que 
preenche os 
critérios de 
caso suspeito 
e apresenta 
mais de uma 
cultura positiva 
para 
micobactéria e 
baciloscopia. 
Fonte: Brasil, ANVISA 2010. Relatório descrito de investigação de casos de infecções por micobactérias 
não tuberculosas de crescimento rápido (MCR) no Brasil no período de 1998 a 2009. 
Os achados radiológicos auxiliam nas definições de casos de infecção por MNT, 
mas não diferenciam dos casos de TB. Os achados mais comuns nas infecções 
pulmonares por MNT são a bronquiolite, bronquiectasias, nódulos, consolidação, e 
menos frequentemente cavidades (10). Porém, um estudo em Israel, relacionou 
achados radiológicos de duas espécies de MNT, M. kansasii estava associada à 
achados radiológicos com mais cavidades e M. simiae à infiltrados pulmonares. Esses 
achados revelaram que para M. kansasii existe uma predileção para a doença de lobo 
superior ao passo que a infecção por M. simiae maior probabilidade de doença lobo 
médio e inferior. Os derrames pleurais e linfadenopatia foram encontradas apenas na 
presença de infecção por M. simiae (75). 
 
1.8. Diagnóstico laboratorial das MNT 
 
O número elevado de espécies circulantes de MNT e de seu isolamento ser 
possível na maioria dos espécimes biológicos e ambientais leva os laboratórios a 
desenvolver e/ou aplicar métodos mais eficientes e rápidos para a detecção e 
31 
 
 
caracterização das micobactérias, incluindo métodos de cultura mais sensíveis, 
melhoramento das técnicas de identificação e dos testes de susceptibilidade aos 
antibióticos. É importante que os laboratórios recebam as amostras coletadas 
corretamente, evitando falsos diagnósticos resultantes de amostras contaminadas 
(26,36). Os tipos de amostras para diagnóstico de MNT são: escarro, escovado ou 
lavado broncoalveolar (LBA), biópsia pulmonar, peças cirúrgicas (ósseas, linfáticas, 
pele), secreções de feridas, sangue e medula óssea (57). 
 
A presença de MNT numa amostra clínica pode ter três significados: 
 
1. A micobactéria é o agente etiológico, e neste caso o diagnóstico microbiológico 
deve ter como base os sinais clínicos e isolamento repetido da micobactéria em uma 
segunda amostra, ou por um único isolamento no caso das amostras colhidas deforma asséptica; 
2. A micobactéria colonizou a amostra, mas não tem significado clínico. Isto 
resulta frequentemente da utilização de equipamento contaminado, geralmente 
provenientes de água canalizada. Casos assim não são raros e causam o que é 
designado de ″pseudoinfecção″; 
3. A detecção de micobactéria na amostra clínica teve origem numa contaminação 
do laboratório (soluções de descontaminação contaminadas ou contaminação devido 
a outra amostra positiva), sendo fácil de verificar, caso a mesma micobactérias seja 
isolada a partir de outras amostras analisadas no mesmo dia (19,20); 
4. Micobacteria isolada sem significância clínica – não sendo causa real de 
infecção, significância clínica (3 amostras) isoladas de locais diferentes CUIDADO* 
ligação com a clínica – valorização clínica – mais de uma amostra; dias consecutivos 
e isoldadas de locais diferentes. 
 
Na tabela 3 estão descritos os critérios clínicos, radiológicos e laboratoriais para 
definir caso de infecção pulmonar por MNT de crescimento rápido ou tardio, segundo 
a ANVISA: 
 
 
Tabela 3. Diagnóstico de doença pulmonar por MNT: 
32 
 
 
Critérios clínicos e radiológicos: 
1. Sintomas respiratórios associados a opacidade nodulares ou cavidades e/ou 
na radiografia e/ou bronquiectasias e múltiplos pequenos nódulos na 
tomografia computadorizada de tórax. 
e 
2. Exclusão de outros diagnósticos, especialmente tuberculose. 
Critérios microbiológicos: 
1. Cultura positiva em duas amostras de escarro. 
ou 
2. Uma cultura positiva por escovado ou lavado broncoalveolar (LBA). 
ou 
3. Biópsia pulmonar: processo inflamatório granulomatoso crônico e/ou BAAR no 
tecido associado à cultura positiva em tecido, escarro ou LBA. 
Fonte: Brasil, Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA 2010). Relatório descrito de 
investigação de casos de infecções por micobactérias não tuberculosas de crescimento rápido (MCR) 
no Brasil no período de 1998 a 2009. 
 
1.8.1. Separação das espécies do Complexo M. tuberculosis 
das micobactérias não causadoras de tuberculose (MNT): 
 
As características culturais (morfologia das colônias e pigmentação), temperatura, 
taxa de crescimento e testes bioquímicos diferem entres as espécies do complexo M. 
tb e as MNT (21). Os métodos de cultura e os testes bioquímicos são morosos e 
laboriosos, podem levar várias semanas, além disso não são totalmente elucidáveis, 
deixando lacunas de diagnósticos quando ocorre a falta de reprodutibilidade da cepa 
em meio de cultura (25). A variabilidade de estirpes presentes numa mesma espécie, 
pode levar a uma variabilidade nos resultados dos testes bioquímicos, podendo 
também ocorrer espécies diferentes com morfologias e perfis bioquímicos 
indistinguíveis ou muito idênticos (63,64). 
 
Apesar das dificuldades enfrentadas, os laboratórios que realizam cultura para 
micobactérias devem ser capazes de primeiramente separar espécies do complexo 
M.tb das MNT através de testes fenotípicos, do contrário terão que reportar o resultado 
das culturas positivas, como Mycobacterium sp., ou encaminhar a cultura a um 
33 
 
 
laboratório de referência para realização da identificação da espécie por método 
molecular (1). 
 
A separação das espécies do complexo M. tuberculosis das MNT pode ser 
realizada por meio de quatro testes fenotípicos partindo do primo-cultivo: análise 
microscópica da cultura, inibição de crescimento em meio de cultura LJ-PNB 
(Lowenstein Jensen – ácido p-nitrobenzóico) e teste da Niacina. 
 
A análise microscópica da cultura consiste na confecção de um esfregaço de uma 
alçada da colônia, que é corada com fucsina de ZN. Esse teste avalia a pureza da 
cultura, a presença de BAAR e a formação de corda (Figura 2). A maioria das MNT 
não formam fator corda, exceto M. kansasii, M fortuitum e M. chelonae (1,21). 
 
 
a. Complexo M.tb b. MNT 
Figura 2: Esfregaços de cultura de micobactérias. 
Fonte: Gerência de Tuberculose – FMT/HVD 
 
O teste de inibição de crescimento em meio com ácidop-nitrobenzóico 500 µg/ml 
(PNB) é um teste utilizado na separação das espécies do complexo M.tb das MNT 
através da cultura, todas as espécies do complexo M.tb não crescem nesse meio ao 
contrário da maioria das MNT. As espécies de MNT que eventualmente podem não 
crescer em presença de PNB é o M. kansasii, M. xenopi e M. gastri (79). 
 
1.8.2. Identificação fenotípica das espécies de MNT: 
 
 Após a separação das MNT do complexo M.tb, é necessário a realização do 
34 
 
 
teste de identificação fenotípico das espécies de MNT, as diferentes espécies inclusas 
a esse grupo também possuem diferenças terapêuticas (1,21). Os testes de 
identificação fenotípico tem como base as características culturais e bioquímicas, tais 
como: tempo e temperatura de crescimento, pigmentação e testes bioquímicos (1,35). 
Em 1958, Runyon propôs a classificação das MNT em quatro grupos, baseando-
se na pigmentação e tempo de crescimento das colônias em meio de cultura sólido 
(OK e/ou LJ). As espécies que apresentam crescimento após sete dias são 
classificadas como micobactérias de crescimento lento (MCL) e aquelas que 
apresentam crescimento em menos de sete dias, micobactérias de crescimento rápido 
(MCR). As micobactérias pigmentadas produzem intensamente carotenoides 
amarelos (Figura 3), que podem ser estimulados pela exposição à luz, estes são 
denominados organismos fotocromogênios ou quando produzidos na ausência de luz, 
organismos escotocromogênicos, além das micobactérias não pigmentadas (43). 
 
Figura 3: Colônias cepas MNT positivas fotocromógenas, acromógenas e escotocromógenas. 
Fonte: Gerência de Tuberculose – FMT/HVD 
 
Esse esquema de identificação auxilia a elucidar possíveis lacunas de 
diagnóstico, todavia, uma micobactéria pigmentada ou de crescimento rápido não 
deve ser confundida com M. tuberculosis (Tabela 4) (1,4). 
 
 
Tabela 4. Classificação das MNT segundo o sistema de Runyon. São apresentadas 
algumas espécies exemplificativas de cada um dos grupos: 
35 
 
 
Grupo Característica da cultura 
I Fotocromógenas: Crescimento lento das colônias; Culturas desenvolvem 
pigmento amarelo somente quando expostas à luz. Exemplo: M. kansasii, 
M. marinum. 
 
II Escotocromógenas: Caracteriza-se pelo crescimento lento das colônias; 
Culturas desenvolvem pigmento tanto na luz como no escuro. Exemplo: 
M. gordonae, M. szulgai. 
III Acromógenas: Caracteriza-se pelo crescimento lento das colônias; 
Culturas não produzem pigmento. Exemplo: M. avium, M. terrae. 
 
IV Crescimento rápido: Caracteriza-se pelo crescimento rápido das colônias; 
Colônias podem ser pigmentadas ou não. Exemplo: M. fortuitum, M. 
chelonae, M. abscessos. 
 
Fonte: Leão SC, Martin A, Mejia GI, Palomino JC, Robledo J, Telles MA da S, Portaels F. 2005. Practical 
Handbook for the phenotypic and genotypic identification of Mycobacteria. 
1.8.3. Identificação genotípica das MNT: 
Devido a demora no diagnóstico de infecções provocadas pelas MNT, tornou-se 
necessário o desenvolvimento de métodos de identificação molecular, com uma boa 
relação custo-benefício e que acima de tudo sejam mais eficazes quando comparados 
aos métodos convencionais. Estes métodos incluem testes baseados na reação em 
cadeia da polimerase (PCR) em tempo real, RFLP (Restriction Fragment Length 
Polymorphism), sequenciamento de DNA, sondas genéticas, entre outros (1). 
O atraso de diagnóstico tem um impacto importante na escolha do tratamento 
mais adequado do doente, quanto mais precoce o diagnóstico mais eficaz o 
tratamento com uma maior chance de cura. O diagnóstico molecular consiste na 
análise do material genético do microrganismo através de regiões específicas do 
genoma de cada espécie, esta metodologia é específica e tem sido empregada na 
maioria dos laboratórios, estes métodos têm cada vez mais importância, porque são 
36mais rápidos e precisos que os métodos convencionais e na maioria dos casos, 
produzem resultados mais confiáveis (82). 
Para esse tipo de metodologia é necessário que seja realizado previamente a 
extração do DNA, que pode ser realizado através de vários métodos de digestão de 
membrana como: método enzimático por brometo de cetil trimetilamonio (CTAB), 
extração por choque térmico e banho ultrasônico (1). 
Kit comercial GenoType® Mycobacterium CM-AS: 
Estão disponíveis no mercado o sistema da linha GenoType® (Hain Lifescience, 
Nehren, Alemanha). O kit comercial GenoType® Mycobacterium CM (do inglês 
“Common Mycobacteria”) e o GenoType® Mycobacterium AS (do inglês “Additional 
Species”), juntos são um teste molecular que se baseia em uma técnica de PCR por 
segmentação de uma região do gene 23S rRNA, seguida de hibridização reversa para 
uma fita de nitrocelulose, permitindo a identificação genética molecular simultânea 
de M. complexo de tuberculosis e 24 das espécies de MNT mais comuns a partir das 
culturas positivas. O procedimento completo é dividido em três passos: extração do 
DNA de cepa cultivada em meio de cultura sólido, amplificação através de técnica de 
PCR multiplex com primers biotinilados e hibridização reversa, realizado no prazo 
máximo de 2 dias. A determinação da espécie é realizada com a ajuda de uma tabela 
de interpretação (83). 
O GenoType® Mycobacterium CM permite a identificação do complexo M. avium, 
M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. 
scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. marinum-M. ulcerans, 
M. peregrinum, M. xenopi e o complexo M. tuberculosis. O GenoType® 
Mycobacterium AS permite a identificação de espécies adicionais de MNT, 
nomeadamente M. simiae, M. mucogenicum, M. goodie, M. cellatum, M. smegmatis, 
M. genavense, M. lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai, M. phlei, M. 
hemophilum, M. kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum e M. shimoidei (85). 
PRA-hsp65 (Análise de restrição da reação em cadeia da polimerase do gene 
hsp65). 
37 
 
 
O PRA-hsp65 (do inglês Polimerase Chain Reaction Restriction Analysis of the 
gene hsp65) é uma técnica não comercial, “in house” que tem apresentado uma boa 
eficácia na identificação de espécies das MNT, se baseia na amplificação do gene 
hsp65 e posterior análise de seu polimorfismo mediante a digestão com as enzimas 
de restrição BstEII e HaeIII. Foi descrito por Telenti e col. em 1993. Esse método 
diferencia amaioria das espécies MNT, mas não as do complexo M. tuberculosis. As 
variações na sequência do gene hsp65 podem ser exploradas para a identificação ao 
nível da espécie tanto em micobactérias de crescimento lento como em espécies de 
crescimento rápido (1). 
Resumidamente, um fragmento de 441 pares de base (pb) do gene hsp65 é 
amplificado por reação de PCR e digerido por duas enzimas de restrição, BstE II e 
Hae III. O produto dessa reação é submetido a análise através de eletroforese em gel 
de agarose e a determinação das espécies é feita através da leitura desse gel, de 
acordo com o perfil dos pares de base obtidos a partir da digestão de cada enzima 
específica. A determinação dos perfis eletrosféricos são comparados aos padrões de 
restrição de vários algoritmos encontrados no sistema on-line PRASITE através da 
página eletrônica: http://app.chuv.ch/prasite/index.html (84). 
Ambos os testes acima descritos são os mais utilizados e tem mostrado bons 
resultados na identificação das espécies das MNT bem como amostras mistas (MNT 
e TB) (83). Porém é importante lembrar que o método PRA-hsp65, não permite a 
diferenciação entre algumas espécies de micobactérias, devido a superposição de 
perfis de várias espécies distintas, necessitando o sequenciamento para 
complementação do resultado nessas situações (92). Apesar dessas limitações, o 
método PRA-hsp65 pode ser utilizado para a identificação preliminar das espécies de 
MCR mais frequentes (85). 
Sequenciamento de genes: 
As definições de espécies, inicialmente baseadas em testes fenotípicos, 
atualmente estão sendo baseadas no sequenciamento de vários genes essenciais ao 
metabolismo da célula bacteriana (48). O sequenciamento é a técnica molecular mais 
sensível, considerada padrão-ouro dos métodos da biologia molecular e é 
constantemente utilizada em estudos de identificação das espécies de micobactérias 
38 
 
 
(92). A identificação é feita através da comparação das sequências de nucleotídeos 
obtidas com as sequências de referência presentes em várias bases de dados. 
Geralmente é necessário apenas uma única reação de sequenciamento para uma 
identificação definitiva (93). 
Este método permite também a detecção direta de espécies de micobactérias que 
não cresceram em meios de cultura além de identificar diversas espécies 
possivelmente não conhecidas. Porém o sequenciamento, no entanto é um método 
dispendioso e necessita de técnicos e equipamento especializados, ou na ausência 
dos mesmos, de se recorrer a empresas especializadas (93). 
Essa técnica utiliza fragmentos de regiões específicas do genoma das 
micobacterias: hsp65, rpoB e 16S rRNA. Dentre estas regiões gênicas, o 
sequenciamento do gene hsp65 é o mais utilizado a nível de espécie e subespécie 
(92). 
O sequenciamento do gene rpoB é usado como alternativa não só para identificar, 
mas também diferenciar as MNT entres os grupos de crescimento lento e crescimento 
rápido (93). 
O impacto na magnitude exata das infecções por MNT em países onde a TB é 
endêmica ainda não são conhecidos. A Região Norte do Brasil é endêmica para os 
casos de TB e está em constante processo de expansão devido à industrialização 
gerada pela Zona Franca de Manaus, é detentora da maior bacia hidrográfica e é o 
berço da maior parte da biodiversidade existente do mundo, possivelmente abrigue 
em seu ecossistema a maior parte das micobatérias. Além disso, segundo dados do 
Ministério da Saúde, em 2014, está no ranking das unidades da Federação com as 
maiores taxas de detecção e mortalidade para o HIV/AIDS. Esses fatores apontam 
para a necessidade de estudos mais detalhados na população da Região Norte 
elucidando a relação entre TB/MNT/HIV. 
 
Devido à escassez de dados de incidência, prevalência e mortalidade nos casos de 
MNT/HIV na Região Amazônica são necessários estudos a fim de estabelecer critérios 
clínicos e bacteriológicos para que se possa notificar e tratar de maneira mais eficaz. 
39 
 
 
Como as técnicas de identificação de MNT ainda não estão bem estabelecidas, 
aumenta a necessidade do desenvolvimento de métodos de diagnóstico laboratorial, 
bem como a avaliação das técnicas existentes. Dessa forma, é recomendável que a 
identificação em nível de espécie seja realizada por sequenciamento de DNA para a 
confirmação dos resultados obtidos pelo PRA-hsp65 e outros testes moleculares, 
como o kit comercial GenoType® Mycobacterium CM-AS (86). 
 
Considerando que ainda não foram elucidadas as questões epidemiológicas das 
MNT nessa região e nem sua interação com os pacientes que soropositivos, esse 
estudo cooperará para o andamento da formulação dos critérios de controle, 
diagnóstico e tratamento de MNT na Região Amazônica. 
 
Visando priorizar a adequação terapêutica e obter dados que possam ser revisados 
a qualquer momento, é recomendável que a identificação em nível de espécie seja 
realizada por sequenciamento de DNA. Portanto, a confirmação dos resultados 
obtidos pelo PRA-hsp65 e outros testes moleculares, como o kit comercial 
GenoType® Mycobacterium CM-AS, é realizada através do sequenciamento genético 
(86). 
Com aumento de casos de infecções por MNT aumenta a necessidade da inovação 
dos métodos de diagnostico laboratorial bem como a criação de técnicas mais 
precisas para a identificação das espécies de MNT, que hoje são laboriosos e 
dispendiosos. 
 
2. OBJETIVO 
 
2.1. Geral: 
 
Descrever ecaracterizar as espécies de micobactérias não tuberculosas isoladas de 
amostras clínicas de pacientes com suspeita de TB atendidos em uma unidade de 
referência no Estado do Amazonas. 
 
40 
 
 
 
2.2. Específicos: 
 
Descrever os achados microbiológicos dos pacientes com suspeita de TB e amostra 
clinica positiva para MNT; 
Identificar as espécies de MNT por meio de testes moleculares; 
Comparar as técnicas moleculares PRA hsp65, GenoType® Mycobacterium CM/AS e 
sequenciamento genômico das regiões hsp65 e rpoB; 
Descrever a frequência de coinfecção MNT/TB/HIV. 
3. MATERIAIS E MÉTODOS. 
 
3.1. Modelo e período de estudo: 
 
Trata-se de um estudo de coorte retrospectivo de casos suspeitos de TB no 
período de 2011 a 2014, na Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira 
Dourado (FMT-HVD). 
 
3.2. Amostras clínicas: 
 
As amostras foram obtidas através das buscas em livros de registros laboratoriais 
da Gerência de Tuberculose, foi realizado teste molecular das cepas criopreservadas 
positivas para MNT do período de 2011 a 2014. Os achados clínicos foram obtidos 
por meio do sistema de prontuário eletrônico on-line I-Doctor e no Sistema de 
Informação de Agravos de Notificação (SINAM). 
 
3.3. População de referência: 
 
 Amostras clínicas de pacientes admitidos com suspeita clínica de TB, com 
amostra encaminhada ao laboratório de tuberculose da FMT-HVD e cultura positiva 
para MNT no período de 2011 a 2014. 
 
41 
 
 
3.4. Critérios de elegibilidade: 
 
Análise clínica e epidemiológica: Amostras clínicas de pacientes com suspeita 
clínica e epidemiológica de tuberculose independente de idade, sexo e procedência 
(ambulatório, enfermaria, UTI e/ou pronto atendimento), caracterizados por apresentar 
sintomas respiratórios, achado radiológico ou tomográfico compatível com doença 
pulmonar por micobactéria, solicitação de exame de escarro e resultado da cultura. 
 
Análise molecular para identificação de espécie de MNT: Amostras clínicas de 
pacientes com achados clínico-epidemiológicos sugestivos de TB e que possuam 
cepa criopreservada em condições viáveis de armazenamento (quantidade, aspecto 
e temperatura -70ºC). 
 
3.5. Definições para confirmação laboratorial dos casos de Micobactéria não 
tuberculosa: 
 
Infecção pulmonar por MNT confirmada laboratorialmente: Todo paciente que 
apresentou exame de escarro com resultado de baciloscopia negativa ou positiva 
variando em +/++ ou +++, teste molecular Xpert MTB/RIF® não detectável e cultura 
em meio sólido com crescimento confluente para MNT identificada por meio de teste 
fenotípico (análise de coloração e tempo de crescimento) e bioquímico (PNB, TCH e 
Niacina). 
 
Infecção pulmonar por MNT não confirmada laboratorialmente: Todo paciente 
que apresentou exame de escarro com resultado de cultura negativo, ou seja, com 
ausência de unidade formadora de colônia (UFC) e/ou cultura contaminada. 
 
3.6. Critérios de não inclusão: 
 
Análise clínica e epidemiológica: Não foram incluídos no estudo pacientes que 
não tiverem amostra clínica coletada e encaminhada ao laboratório de tuberculose 
e/ou que não possuam resultado do exame de baciloscopia e/ou Xpert MTB/RIF e/ou 
cultura. 
42 
 
 
 
Análise molecular para identificação de espécie de MNT: Amostras clínicas que 
tiveram o material perdido com o tempo, que não apresentaram concentração 
satisfatória para análise (0,5 mL) e que após repique apresentaram contaminantes 
não foram submetidas aos testes moleculares e sequenciamento de DNA. 
 
3.7. Procedimento laboratorial: 
 
Foi realizado o levantamento das informações laboratoriais referentes aos 
pacientes do estudo primeiramente através de livros de registro da Gerência de 
tuberculose e posteriormente buscas das cepas criopreservadas em geladeira -70ºC 
situada na Gerência de Bacteriologia da FMT- HVD. Para determinação e identificação 
de espécie as cepas rastreadas foram submetidas aos seguintes procedimentos: 
 
3.7.1 Identificação fenotípica: 
 
As culturas criopreservadas foram semeadas em meio de cultura sólido Ogawa 
Kudoh e incubadas em estufa bacteriológica à 37ºC (APÊNDICE E) para análise 
fenotípica através da constatação do tempo de crescimento e a presença de 
pigmentação conforme protocolo (APÊNDICE F). 
 
Foram submetidas a teste molecular (identificação genotípica) as cepas de 
isolados de espécimes cultivadas de amostras biológicas caracterizadas como 
Micobactéria não tuberculose que apresentaram crescimento em meio de cultura sem 
contaminantes. 
 
3.7.2. Identificação genotípica: 
 
a) Etapa 1: extração de DNA 
 
Foram utilizados dois métodos: um método de extração de DNA enzimático 
através de CTAB (APÊNDICE D) conforme técnica descrita por van Soolingen et al 
(1994) e outro por sonicação (banho ultra-sônico). 
43 
 
 
 
Resumidamente a técnica consistia em: 
 
Inativação de cepa e extração de DNA por termobloco: As cepas crescidas foram 
submetidas à inativação de sua potencialidade contaminante e posterior lise de 
membrana através de choque térmico (APÊNDICE G), foi retirada de 2 a 3 alçadas do 
crescimento micobacteriano da cultura e suspensas em um microtubo contendo água 
ultra-pura (Gibco®), logo após a suspensão foi submetida à banho maria por 20 
minutos a 99ºC. 
 
b) Etapa 2: As cepas foram submetidas a dois testes moleculares, um através de 
método não comercial “in house” e outro através de kit comercial. 
 
PCR – Restriction Enzyme Analysis (PRA-hsp65): Foi realizada a amplificação 
deum fragmento de 441 pb do gene hsp65, comum entre as micobactérias e posterior 
análise de seu polimorfismo mediante a digestão com as enzimas de restrição BstEII 
e HaeIII (APÊNDICE H). A determinação da espécie foi realizada através da análise 
do gel de eletroforese, as bandas de DNA encontradas foram comparadas a padrões 
descritos de restrição algoritmas encontrados na página eletrônica PRASITE: 
http://app.chuv.ch/prasite/index.html. 
 
Kit Comercial GenoType® Mycobacterium CM-AS: 
 
O DNA extraído submetido à técnica PRA-hsp65 também foi submetido a 
segmentação da região do gene 23S rRNA e hibridização reversa em fita de 
nitronucleose. Nesta fita, sondas específicas imobilizadas (tecnologia Hain 
LifeScience - DNA-STRIP), permitiram a identificação das seguintes espécies de 
micobactérias: Mycobacterium avium spp, M. chelonae, M. abscessus, M. fortuitum, 
M. gordonae, M. intracellulare, M. scrafulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. 
malmoense, M. peregrinum, M. marinum/M. ulcerans, M. xenopi e CMTB (complexo 
M.tb). O procedimento é a partir do material cultivado. A determinação da espécie é 
realizada através de uma tabela de interpretação. 
 
44 
 
 
Os resultados obtidos das duas técnicas foram analisados e comparados entre si e 
por fim confirmados através da técnica de sequenciamento. 
 
c) Etapa 3: Sequenciamento do gene hsp65 e rpoB. 
 
As técnicas de sequenciamento foram realizadas de acordo com os procedimentos 
descritos por Adekambi et al., 2003 e Selvaraju et al., 2005. 
 
Foi realizada a PCR utilizando primers específicos para a região do gene hsp65, 
com os oligonucleotídeo hsp667F 5’ GGCCAAGACAATTGCGTACG e hsp667R 5’ 
GGAGCTGACCAGCAGGAT e outro para a região do gene rpoB, com os 
oligonucleotídios MycoF 5’ GGCAAGGTCACCCCGAAGGG e MycoR 5’ 
AGCGGCTGCTGGGTGATCATC. Os produtos amplificados foram purificados 
utilizando Polietilenoglicol (PEG) 8000/2.5 M NaCl antes do sequenciamento 
(APÊNDICE I). As reações de amplificação foram realizadas através de termociclador 
com etapa de desnaturação inicial de 96ºC por 15 segundos, 50ºC por 15 segundos 
e 60ºC por 4 minutos. Os produtos da PCR foram submetidos a eletroforese em gel 
de 1%. 
 
A reação de sequenciamento foi realizada através do equipamento ABI 3500 
Genetic Analyzer com capilares de 50 cm e polímero POP7 (Applied Biosystems). 
Depois de marcadas foram novamente purificadas