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1 Samille Donato - Microbiologia MORFOLOGIA, CITOLOGIA E MÉTODOS DE COLORAÇÃO BACTERIANA: Estrutura das células bacterianas: → São as menores células, visíveis apenas por microscopia. → Procariontes (sem envoltório nuclear). → Não apresentam organelas citoplasmáticas, possuem somente ribossomos, que por serem responsáveis por manter a célula viva, são os alvos dos antibióticos... → Presença de parede celular de peptídeoglicano (proteção contra o meio). → DNA de dupla fita, circular (fácil de atacar o DNA da célula) e podem viver em ambientes hostis. → Por serem seres mais simples, são mais fáceis realizar mutação. Diferenças macroscópicas: → A organização das colônias bacterianas – odor, cor, tamanho, forma, capacidade de resistir a determinados antibióticos, de fermentar açucares, de lisar hemácias e hidrolisar lipídeos. Diferenças microscópicas: → Tamanho, forma, configuração do organismo (coco, bacilo, cocobacilo, vibriões, espirilos) e capacidade de reter corantes de Gram. OBS: Gram positivas (bactérias que durante o teste de coloração de Gram, são capazes de reter o corante em sua parede e coram- se de roxo). Gram negativas (bactérias que durante o teste de Coloração de Gram são incapazes de reter corantes em sua parede e coram-se de vermelho com o contracorante safrinha). Diferenciação metabólica, antigênica e genética: Diferenças metabólicas: → Baseado no perfil metabólico das bactérias – exigência de ambiente aeróbico ou anaeróbico, nutrientes específicos, produção de metabólitos específicos. Diferenças antigênicas: → Baseada na sorotipagem – Descoberta de anticorpos no sangue, para combate de antigênicos específicos. Não é muito usada. Usa mais a cultura. Diferenças genéticas: → Análise de pedações do cromossomo ou do genoma inteiro em busca de sequencias específicas de DNA de uma determinada bactéria. Estruturas citoplasmáticas: → Cromossomo único na forma de dupla fita circular não armazenado no núcleo (nucleóide – região definida que fica a fita em algumas bactérias). → Ausência de histonas e o DNA não forma nucleossomos. → Plasmídeos como se fosse um DNA acessório que serve como um DNA extra (formas circulares de DNA extracromossomal), replicação autônoma. → Plasmídeos R → resistência à antibióticos. Plasmídeos F → capacidade de transferir material genético por conjugação (reprodução sexuada). → Ausência de membrana nuclear – Transcrição e tradução acontecem acoplados e na mesma região. → Ribossomo bacteriano (70s) – Diferente dos eucariontes. Alvo de antibióticos. → Membrana citoplasmática – bicamada fosfolipídica com proteínas integrais e sem colesterol (exceção: micoplasmas). Realiza funções de transporte de elétrons e produção de energia. 2 Samille Donato - Microbiologia Parede celular Espessa, rígida e permeável: → Envolve e dá forma à célula, → Permite troca de substância entre célula e o meio, → Proteção contra determinados agentes físicos e químicos externos → resistência contra choques mecânicos e osmóticos, → Determinante de especificidade antigênica, → Responsável pela divisão das bactérias Gram + / Gram – Bactérias Gram + Camada espessa de peptideoglicano: → Exoesqueleto - Estrutura da bactéria. Duplaligação. → Sobrevivência em ambientes hostis. Ácido teitóico e ácido lipoteitóico: → Antígenos da superfície bacteriana usados para diferenciar os tipos de bactérias. → Adesão de bactérias a receptores das células e a outras bactérias. → Usam antibióticos para síntese proteica, ribossomos, adentram a membrana com mais facilidade. OBS → O peptideoglicano pode ser degradado por meio da enzima lisozima, presente na lágrima e no muco humano. A sua degradação implica na desestruturação da parede celular e na morte da célula por lise, devido a diferença de pressão osmótica. Bactérias Gram – → Duas camadas (uma fina de peptideoglicano + membrana externa). → Espaço periplasmático – entre a membrana externa e membrana plasmática. Compartilhamento para: Sistema de transporte de ferro, proteínas, açucares e enzimas hidrolíticas. → Mais resistentes aos antibióticos por ser mais difícil atingir o citoplasma devido a parede celular. Geralmente usam antibióticos de membrana. Membrana externa: → Bicamada – face externa (lipopolissacarídeos ou LPS) e face interna (fosfolipídeo). → Funções: Proteção, barreira de permeabilidade as grandes moléculas. Exemplo: enzima lisozima. → Presença de porinas (proteínas que formam poros e permitem a passagem de substâncias hidrofílicas como antibióticos). → Ligadas na membrana plasmática por sítios de aderência e ao peptideoglicano por lipoproteínas. Estruturas externas: Cápsulas: → Composição: Polissacarídeo ou proteína. → Camadas NÃO fixadas na célula – SLIME quando frouxamente fixadas. → Cápsula + Slime = Glicocálix. → Funções: Antifagocítica, barreira para moléculas hidrofílicas tóxicas, aderência a outras bactérias e ao tecido hospedeiro, proteção contra a fagocitose. Aumenta o poder de infecção. Fímbria: → Composição: Subunidade de proteína pilina. 3 Samille Donato - Microbiologia → Menores que os flagelos e distribuídos pela superfície da célula. → Funções: Adesão a outras bactérias ou ao hospedeiro. Troca de material genético (Pili F). Flagelos: → Composição: Subunidades de proteína flagelina enroladas em hélice e fixadas na membrana basal. → Um ou mais flagelos. → Funções: Motilidade (potencial de membrana e quimiotaxia). Esporos bacterianos: → Algumas bactérias produzem esporos que é uma “bolinha” para se proteger dos locais hostis. Altamente resistente. → Bactérias Gram + (Bacillus e Clostridium), possuem resistência grande pois conseguem esporolar, ficando no estado vegetativo. → Estado vegetativo para o estado de dormência (esporo) sob condições inóspitas. → Para sair desse estado, precisa encontrar um ambiente favorável. → Formado por várias camadas, desidratado, contém uma cópia do cromossomo, altas concentrações de Ca2+ associados ao ácido dipicolínico. → Duas camadas de peptideoglicano, 1 membrana externa e 1 revestimento proteico semelhante a queratina. NUTRIÇÃO, CRESCIMENTO E METABOLISMO MICROBIANO: A obtenção de hidrogênio e oxigênio, geralmente se dá juntamente de compostos orgânicos. A obtenção e produção se da pela luz (fototrópicos) ou por meio da química (quimiotrópicos). Nitrogênio e íons essenciais: Nitrogênio: → Diretamente da atmosfera. → Através de compostos inorgânicos (sais de amônio e nitrato). → Fontes orgânicas (aminoácidos e proteínas). Macronutrientes: → Fósforo – forma de fosfato. Metabolismo energético e síntese de ácidos nucleicos. → Enxofre – composição de aa (cisteina). Síntese de vitaminas (Biotina). → Potássio – Ativador de enzimas e regulador de pressão osmótica. → Magnésio – fator importante na síntese de proteínas. União dos fragmentos ribossômicos. → Ferro – síntese de citocromos e certos pigmentos. Macronutrientes: → Funcionam como coenzimas. → Exemplo: cobre, cobalto, zinco, manganês, sódio, etc. OBS: Algumas substâncias indispensáveis para o crescimento bacteriano não podem ser sintetizadas por elas, são chamadas de fatores orgânicos de crescimento e devem ser obtidos do meio. OBS: As bactérias se nutrem por solutos dispersor na água que atravessa as membranas biológicas. Regulação térmica. Regulação da pressão osmótica. Meios de cultura: → Soluções de nutrientes para promover o crescimento de microrganismos. → Não existe um meio de cultura universal. → Existem vários tipos de meios p/ diversas finalidades. → Para obter sucesso no cultivo, é necessário o conhecimento de suas exigências nutricionais,p/ que os nutrientes sejam fornecidos na forma e proporção adequadas. Meios líquidos: → Soluções aquosas de nutrientes. → Bactérias crescem mais facilmente, principalmente em pequena quantidade. → Não é bom p/ diferenciar os tipos de bactérias inoculadas. Meios sólidos: → Separação dos tipos bacterianos em colônias. → Preparador utilizando agente solidificante (ágar). Meios seletivos: → Favorecem o crescimento de microrganismos desejados em detrimento de outros. 4 Samille Donato - Microbiologia Meios diferenciais: → Obtenção das características das colônias de um microrganismo desejado. → Diferencias características metabólicas diferentes de um mesmo grupo bacteriano. Temperatura: Classificação: → Psicrófilos – Seres que crescem em temperatura baixa. → Mesófilos – Seres que crescem em temperatura média. → Termófilos – Seres que crescem em temperaturas altas. As classificações dos microrganismos segundo sua temperatura de crescimento não são rígidas. Maioria são mesófilos. Entre os psicrófilos e mesófilos, estão as bactérias que causam muita toxicidade alimentar, pois conseguem se reproduzir nos alimentos. A refrigeração dos alimentos causa queda na taxa de crescimento bacteriano, conservando-os. A quantidade do alimento influencia no tempo de refrigeração. Maioria dos mesófilos são patogênicos e deteriorantes. Os endofilosporos produzidos por bactérias termófilas são anormalmente resistentes a temperatura e podem sobreviver ao tratamento térmico dos alimentos. PH e pressão osmótica: Acidófilas X alcalófilas: → Maioria das bactérias – neutralidade. → Sais de fosfato – Sistema tampão dos meios de cultura, não são tóxicos e fornecem fosforo para a bactéria. OBS: Bactérias cultivadas em laboratório produzem ácidos que interferem no crescimento, assim, tampões são acrescentados aos meios de cultura. Pressão osmótica: → Microrganismos tendem a se desenvolver em meios isotônicos. → A concentração de ágar (1,5%) nos meios de cultura, influencia na concentração do meio. → Halófilos extremos – Seres que precisam de altas concentrações de sair para sobreviver. 5 Samille Donato - Microbiologia OBS: A adição de sal p/ a conservação de alimentos, implica no desequilíbrio osmótico do meio e com isso na morte das bactérias sensíveis a alteração de pressão. Fatores necessários para o crescimento: Fatores físicos: → Temperatura, → pH, → Pressão osmótica. Fatores químicos: → Carbono, → Nitrogênio, enxofre e fósforo, → Elementos traços, → Oxigênio. Respiração X Fermentação: Respiração: → Aeróbica: Aceptor final de elétrons é o O². Degradação total da molécula de ácido pirúvico. → Anaeróbica: Aceptor final de elétrons é uma substância inorgânica (exceto O²). Fermentação: → Aceptor final de elétrons é uma substância orgânica. → Degradação parcial da molécula de ácido pirúvico. Curva de crescimento: CONTROLE DOS MICRORGANISMOS POR AGENTES FÍSICOS E QUÍMICOS, TÉCNICAS DE ESTERILIZAÇÃO, DESINFECÇÃO E ANTISSEPSIA: Terminologia do controle microbiano: → Esterilização. → Desinfecção. → Antissepsia. → Assepsia. 6 Samille Donato - Microbiologia OBS: Esterilização comercial, é o termo usado p/ conservação dos alimentos usados em aquecimento parcial, o suficiente para matar os esporos e o C. Botulinum e não degradas e não degradar os alimentos. OBS: Sanitização é o conceito de desinfecção utilizado p/ controle de microrganismos em bares e restaurantes, visando a saúde pública. OBS: Degerminização, é um conceito de antissepsia voltado para a remoção mecânica dos microrganismos. Exemplo: Algodão e álcool para aplicação de injeção. Terminologia com relação ao efeito sobre os microrganismos: → Agentes biocidas: Tratamentos que causam a morte direta dos microrganismos. Ligam-se fortemente a seus alvos celulares e matam as células dos microrganismos. Sufixo – cida. Exemplo: fungicida. → Agentes biostáticos: Tratamentos que inibem ou diminuem o crescimento e a multiplicação de bactérias. São geralmente inibidores de algum importante processo bioquímico, como a síntese proteica, e a ligação é relativamente fraca; se o agente é removido, as células podem retomar seu crescimento. Muitos antibióticos se enquadram nesta categoria. Sufixo – stático. Exemplo: Bacteriostático. Motivos para o controle microbiano: → Inibir propagação de bactérias patogênicas: • Humanos e animais → Conservação de alimentos. → Contaminação na água e ambiente. → Aumento da validade de produtos alimentícios. Fatores que influenciam a efetividade dos tratamentos antimicrobianos: → Número de micróbios. → Influências ambientais. → Texto de exposição. → Características microbianas. Resistência bacteriana aos métodos de controle: Ação dos agentes de controle microbiano: Alteração na permeabilidade da membrana: → Danos aos lipídeos ou proteínas da membrana plasmática por agentes antimicrobianos causam o extravasamento do conteúdo celular no meio circundante e interferem no crescimento da célula. Danos às proteínas e aos ácidos nucléicos: → Sofrer desnaturação pelo rompimento das ligações de hidrogênio, produzindo a perda da estrutura tridimensional e das ligações covalentes. Danos aos ácidos nucléicos: → Danos que frequentemente são letais p/ a célula, que não pode mais se replicar, nem realizar funções metabólicas normais como a síntese de enzimas. Agentes de controle microbiano: MÉTODOS FÍSICOS: Calor: 1. Esterilização por calor úmido: 7 Samille Donato - Microbiologia → Fervura: Mata as formas vegetativas dos patógenos bacterianos, quase todos os vírus, e os fungos e seus esporos em 10 minutos aproximadamente. → Autoclave: Método usado para esterilizar itens que podem suportar altas temperaturas e pressões. É um dispositivo de aquecimento selado que usa vapor sob pressão p/ matar os microrganismos. OBS: A autoclave utiliza vapor a uma pressão de 15 psi para alcançar 121°C, temperatura a qual morrem os endósporos termorresistentes após 15-20 minutos. 2. Esterilização por calor seco: Mata por efeitos de oxidação. → Chama – direta: esteriliza efetivamente a alça de inoculação aquecendo o fio até obter um brilho vermelho. → Incineração: modo efetivo de esterilizar e eliminar papel, copos, sacos e vestimentas contaminadas. → Esterilização em ar quente: Esterilizar os itens em um forno, a uma temperatura de cerca de 170°C mantida por aproximadamente 2 horas. Filtração: Passagem de soluções ou gases através de filtros de poros suficientemente pequenos é usado para reter bactérias e fungos (não vírus). Usada para esterilizar materiais sensíveis ao calor, como meios de cultura, enzimas, vacinas e soluções antibióticos. Filtros de partículas de ar de alta eficiências, removem quase todos os microrganismos. Baixas temperaturas: O seu efeito depende da resistência do microrganismo e da intensidade da aplicação. → Sob refrigeração (0-7°c): A taxa metabólica da maioria dos microrganismos é reduzida e não podem se reproduzir ou sintetizar toxinas (efeito bacteriostático). OBS: Psicótrofos ainda crescem lentamente, alterando o aspecto e o sabor dos alimentos após algum tempo. → Sob congelamento (<0°c): Os microrganismos se tornam dormentes se essas temperaturas são obtidas rapidamente, porém o congelamento lento é mais nocivo às bactérias porque os cristais de gelo que se formam e crescem rompem a estrutura celular e molecular. Alta pressão: Pressão elevada causa desestruturação dos carboidratos e proteínas (inativação das células bacterianas). Endósporos são altamente resistentes a pressão. Dessecação: Os microrganismos não podem crescer ou sereproduzir sob dessecação, mas podem permanecer viáveis por anos. Só quando a água é oferecida a eles, podem retomar seu crescimento e divisão. Esse é o princípio da liofilização, ou congelamento- dessecação, um processo utilizado em laboratórios para preservação de microrganismos. Pressão osmótica: Usa do princípio da dessecação e causa desidratação na célula bacteriana. Radiação: → Radiação não ionizante: De comprimento de onda entre 220 e 300mm, é absorvida e pode causar danos ao DNA, mutações ou outros efeitos, podendo levar à morte do organismo exposto. Radiação UV é útil na desinfecção de superfícies e ar, porém tem baixo poder de penetração. → Radiação ionizante: Eletromagnética que ioniza a água, forma radicais hidroxila altamente reativos que reagem com os componentes orgânicos celulares, destruindo o DNA. É gerada por raio X e gama, tendo energia e poder de penetração suficientes para matar os microrganismos em itens volumosos. MÉTODOS QUÍMICOS: Características gerais: Parede celular e membrana: → Alvo: Proteínas, camada fosfolipídica, lipopolissacarídeos, peptideoglicanos. → Ação: Afeta a permeabilidade, síntese, rompimento, favorecimento da lise celular. → Consequências: Afeta o crescimento celular e pode causar morte. Álcoois: → Causa desnaturação de proteínas e rompimento de membranas. → Vantagem na evaporação. → Não devem ser aplicados em feridas. → Mais usados: etanol e isopropanol. → Álcool puro é pouco efetivo. → Não mata endósporos. → Usados para aumentar eficiência de outros agentes químicos. Fenóis: Usado p/ controle de infecções em mesas cirúrgicas, 1% fenol tem ação antibacteriana forte. Age na membrana plasmática, ocasionando o vazamento do conteúdo celular, gerando morte celular. Estável e não afetado por compostos orgânicos: → Desinfecção de pus, saliva e fezes. Raramente usado como antisséptico ou desinfetante: → Irritante para a pele, → Odor. Bisfenóis: 1. pHsiHex: Usado em ambiente hospitalar e berçários. Ativo contra estafilococos e estreptococos. 2. Triclosano: Usado desde a sabonetes a cabos de faca. Inibe enzimas da biossíntese de ácidos graxos. Eficaz contra Gram + e menos eficaz contra Gram – e fungos. Biguanidas: Controle microbiano da pele e mucosas. Para preparação cirúrgica combina-se com degermante e álcool. O efeito é lesão na membrana plasmática, desnatura proteínas e inibe metabolismo. 8 Samille Donato - Microbiologia Halogênios: Agentes antimicrobianos eficazes, tanto isoladamente quanto como constituintes de compostos inorgânicos ou orgânicos. 1. Iodo → Disponível na forma de tinturas – solução de álcool aquoso. → Geralmente como iodóforo – combinação de iodo + molécula orgânica. → Usado para tratar feridas. Agentes de superfície: → Sabões e degermantes. → Pouco valor como antisséptico e função importante na remoção mecânica. → Emulsifica as secreções oleosas da pele facilitando a remoção de microrganismos. → Pode romper a membrana plasmática. AGENTES ANTIMICROBIANOS, PRINCIPAIS GRUPOS, MECANISMOS DE AÇÃO E ANTIBIOGRAMA. MECANISMOS DE RESISTÊNCIA: Antimicrobiano → Abrange todos os fármacos usados contra agentes infecciosos. Antibiótico → Substância química com ação inibitória da reprodução ou com poder de destruição de microrganismos. Classificação dos antibióticos: Quanto ao mecanismo de ação: Quanto ao tipo de ação: Mecanismos de resistência: OBS: Antibióticos que não induzem a resistência bacteriana, a resistência é uma consequência. Ocorre um processo de seleção. Sendo o processo: 1. População original de bactérias, com cepas com diferentes graus de resistência aos antibióticos. 2. USO DE ANTIBIÓTICOS. 3. Uma pequena parcela das bactérias é resistente e sobrevive ao medicamento. 4. Se o organismo não for capaz de eliminar as poucas bactérias que sobraram, elas vão se multiplicar e dar origem a uma colônia de bactérias resistente ao antibiótico utilizado previamente. As bactérias vão passando por alterações genéticas, com recombinações. A transpeptidase é o local de ligação das drogas b – lactâmicas, inibindo a produção das cadeias de peptideoglicano nas bactérias, fazendo com que iniba a parede celular, lisando a célula. Caso desenvolva resistência, ao tomar b-lactâmicos, não irá inibir a ação da transpeptidade. OBS: Bactérias gram – são mais resistentes devido a presença das porinas que dificulta a ligação de b-lactâmicos. •B lactâmicos. •Glicopeptídeos. Inibidores da síntese da parede celular • Macrolipídeos, lincosamidas, tetraciclinas, oxazolidinonas, aminoglicosídeos. Inibidores da síntese proteica • Quinolonas, sulfonamidas, imidazólicos, lipopeptídeos. Outros mecanismos • Lise bacteriana. • B lactâmicos, glicopeptídeos, aminoglicosídeos, quinolonas, lipopeptídeos. Bactericida • Inibe a multiplicação. • Macrolipídeos, tetraciclinas, lincosamidas, oxazolidinonas, sulfonamidas. Bacteriostático 9 Samille Donato - Microbiologia Quatro mecanismos principais de resistência: Espectro de ação das drogas antimicrobianas: OBS: A membrana externa de LPS e proteínas, representa uma dificuldade para drogas antimicrobianas, que devem ser hidrofílicas e pequenas, para atravessarem essa estrutura. Seleção das drogas antimicrobianas: → A natureza e seriedade da infecção. → O estado do sistema imunológico da pessoa (até onde pode ajudar na ação do medicamento). → Eventuais efeitos colaterais. → A possibilidade de alergias ou outras reações sérias ao medicamento. → O custo medicamentoso. MICROBIOTA DO CORPO HUMANO: Microbiota normal: Refere-se à população de microrganismos que habitam (colonizam) a pele e as membranas mucosas de um indivíduo saudável. → Colonização: Aderência e multiplicação bacteriana ou fúngica em um hospedeiro sem causar dano tecidual ou comprometimento de funções. → Corpo humano – células eucariontes. Tipos de microrganismos: → Bactérias: Principalmente. → Archae: Seres vivos unicelulares morfológicas semelhante às bactérias, mas geneticamente e bioquimicamente distintas. Presentes no tubo digestivo e são inofensivas. → Vírus: Bacteriófagos. → Fungos: Tubo digestivo e sistema genital feminino (são oportunistas). Os microrganismos não são encontrados em todo o corpo humano, mas estão localizados em certas regiões: → Pele. → Trato gastrintestinal. → Trato urinário. → Trato respiratório superior (Nasofaringe e orofaringe). → Trato respiratório inferior (Traqueia e brônquios). Sítios estéreis → Sangue, líquido cefalorraquidiano, órgãos (coração, pâncreas, baço e fígado). OBS: Os animais e seres humanos são livres de microrganismos quando no útero materno. Ao nascer, as populações microbianas normais começam a se estabelecerem. O primeiro contato entre o RN e os microrganismos ocorre geralmente com lactobacilos, que se tornam predominantes no organismo do bebê. Aleitamento materno: → Colostro: As quantidades de imunoglobulinas presentes chegam a alcançar 90% do teor proteico no 1° dia de lactação, depois diminui. → Imunoglobulinas: IgA, IgG, IgM, IgD. Fatores que interferem na microbiota normal: → Nutrientes. → Fatores físicos e químicos. → Defesas do organismo do hospedeiro. → Fatores mecânicos. Microbiota residente: É a população de microrganismos que habita a pele e as mucosas. Microbiota transitória: Tempo variável, não necessariamente será patogênico. Microbiota normal X hospedeiro: Uma vez estabelecida a microbiota normal, pode beneficiar o hospedeiro ao impedir o crescimento de microrganismos com potencial patogênico – competição entre microrganismos. Antagonismo microbiano ou exclusão competitiva. Equilíbrio X desequilíbrio: Disbiose → Desequilíbrio, geralmente devido uso prolongado deantibióticos e imunidade do hospedeiro. 10 Samille Donato - Microbiologia Simbiose → Interação entre duas espécies que vivem juntas. Alimentos funcionais: → Prebióticos: Servem de substrato para microrganismos presentes no intestino, favorecendo a multiplicação. Componentes não digeríveis. → Probióticos: Alimentos que contém bactérias genéticas. → Simbióticos: Prebióticos + probióticos.